细胞外信号调节激酶信号转导通路在病毒性心肌炎心肌细胞中的调控作用

目的：细胞外信号调节激酶(ERK)与细胞生长，分化，增殖等生理病理过程有密切关系。该研究通过比较ERK1/2在病毒性心肌炎心肌细胞中表达变化及ERK特异性阻断剂PD98059干预后细胞活性的改变，探讨ERK信号传导通路在病毒性心肌炎早期病毒攻击心肌细胞过程中的作用。方法：取新生SD大鼠，采用酶消化法分离得到心肌细胞。将培养细胞分为对照组，柯萨奇B3(CVB3)感染组，20 μmol/L和50 μmol/L PD98059干预组，后3组用柯萨奇B 3M 株感染。采用Westen blot分别测定ERK1/2，ERK激活后产物(P-ERK1/2)表达变化，采用MTT法检测细胞活性，采用细胞病变法计算细胞病变。结果：4组ERK1/2表达总量差异无显著性；CVB3感染组P-ERK1/2表达为 135.57 ± 0.7 高于对照组的 119.41 ± 1.97 ，差异有显著性( P < 0.01 )。经20 μmol/L或 50 μmol/L PD98059干预后心肌细胞P-ERK1/2 表达为 113.75±1.03，42.56±2.17 比感染组细胞低，差异有显著性(均P<0.01)；其中50 μmol/L PD98059干预组P-ERK1/2表达较20 μmol/L组低(P<0.01)。PD98059干预组心肌细胞活性0.53±0.13，0.41±0.04 明显高于感染组0.17±0.04，差异有显著性(P<0.01)；不同浓度PD98059干预组间心肌细胞活性差异无显著性(P>0.05)。PD98059干预组细胞出现细胞病变的时间较感染组晚，程度较感染组轻，感染面积较感染组小。结论：病毒在攻击心肌细胞时启动了ERK信号通路；PD98059能干预病毒对心肌细胞的感染。     

胰岛素样生长因子-1在病毒性心肌炎小鼠中的变化及对心肌的保护作用

目的 探讨病毒性心肌炎（VMC）小鼠血清胰岛素样生长因子-1（IGF-1）水平的变化及外源性IGF-1对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。方法 Balb／c雄性小鼠随机分为3组：正常对照组、柯萨奇B3病毒（CVB3）感染组（感染组）和病毒感染加IGF-1治疗组。分别在实验d7、d14处死动物，留取血清、心肌标本。放射免疫法检测血清IGF-1水平，免疫组织化学法检测心肌组织Bcl-2和Bax蛋白表达。结果 感染组血清IGF-1水平较对照组明显降低，Bcl-2表达减少、Bax表达增加（P〈0．01）；治疗组较感染组Bcl-2表达增加、Bax表达减少（P〈0．01）。结论 IGF-1对VM小鼠的心肌细胞有保护作用。     

黄芪对病毒性心肌炎心肌细胞信号转导及转录活化因子3信号通路的影响

目的　探讨黄芪在保护病毒性心肌炎 (VM)心肌细胞中信号转导及转录活化因子- 3(STAT3)表达及其对细胞增殖的影响。方法　体外分离培养心肌细胞建立VM心肌细胞模型。采用不同浓度黄芪进行干预 ,RT- PCR、Westernblot、MTT等方法分别检测各组病毒RNA及STAT3水平变化。结果　黄芪干预组细胞病毒RNA表达均减弱 ,而且与浓度无关 (P >0 .0 5)。Westenblot法示黄芪对STAT3有抑制作用 ,而且浓度越高 ,抑制作用越强 (P <0 .0 1 )。MTT法示黄芪为 1g/L时细胞出现病变 ,70 0mg/L时细胞存活率最高。结论　黄芪可以抑制病毒RNA复制 ,其保护作用与抑制STAT3信号通路密切相关。     

存活素蛋白在病毒性心肌炎中的表达及作用

目的探讨病毒性心肌炎(VMC)中存活素蛋白的表达变化及可能机制。方法以柯萨奇病毒B3(CVB3)感染SD乳鼠原代心肌细胞复制VMC细胞模型,在CVB3感染后0、12、24、36、48、60 h观察心肌细胞形态及搏动情况,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验评估心肌细胞损伤程度,Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡,采用Western blot技术检测抗凋亡蛋白存活素及凋亡酶cleaved-caspase-3的表达。结果 CVB3感染48 h后,乳鼠原代心肌细胞开始出现团缩变圆,搏动减弱、不规则,至60 h时大部分细胞停止搏动,细胞脱壁、溶解。CVB3病毒感染至细胞凋亡在60 h时至高峰(35.85±3.76)%。感染CVB3后,心肌细胞存活素蛋白表达明显增加,12 h即至最高峰(1.88±0.39),为正常组的1.88倍;随后存活素蛋白表达逐渐减少,60 h时至最低点(0.47±0.41)。CVB3病毒感染激活心肌细胞cleaved-caspase-3表达,60 h时至高峰(3.46±0.16)。心肌细胞存活素蛋白表达量与细胞凋亡率及cleaved-caspase-3表达量均存在显著负相关(r=-0.727、-0.677,P0.01)。结论 VMC时存活素蛋白表达增加,可能在早期参与抗心肌细胞凋亡作用。     

心炎宁颗粒剂对柯萨奇病毒B组感染心肌细胞保护作用的实验研究

目的在病毒性心肌炎心肌细胞模型上观察心炎宁颗粒剂对柯萨奇病毒B组(CVB3m)感染SD大鼠心肌细胞的保护作用。方法体外原代培养的新生SD大鼠心肌细胞,感染CVB3m作为病毒性心肌炎心肌细胞模型,体外给予心炎宁颗粒剂后分别测定最大无毒剂量(TD0)、细胞病变(CPF)、半数致死量(TCID50),分析其对心肌细胞的保护作用。结果不同浓度的心炎宁颗粒剂对心肌细胞的保护率差异有统计学意义(P<0.05);4TD0、TD0、1/2TD0、1/4TD0对心肌细胞的保护率明显高于1/8TD0,差异具有统计学意义(P<0.05),4TD0、1/4TD0对心肌细胞的保护率与1/32TD0之间差异也存在统计学意义(P<0.05)。结论心炎宁颗粒剂对CVB3感染心肌细胞有明显的保护作用。     

黄芪和大青叶治疗小鼠病毒性心肌炎的对比研究

目的：通过中药单剂黄芪、大青叶治疗小鼠病毒性心肌炎(VM C)的疗效观察,探讨VMC的有效治疗措施。方法：Balb/C小鼠给予柯萨奇病 毒B3(CVB3)稀释液腹腔注射后,随机分为感染对照组、黄芪治疗组和大青叶治疗组,于CVB3 感染后第3,5,7,10,14,21天分批处死,作HE染色,比较各组小鼠心肌病变积分,并行 心肌组织病毒分离。于感染后第7天各组小鼠电镜观察心肌细胞超微结构改变。结果：黄芪治疗组自CVB3感染后第5～21天、大青叶治疗组在CVB3感染后第5天和7天时,其心肌病变积分较感染对照组明显减轻(P＜0.05)。而大青叶治疗组CVB3感染后 第10～21天心肌病变积分与感染对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。电镜观察发 现感染对照组小鼠心肌细胞线粒体肿胀、嵴断裂、肌浆网扩张、肌丝溶解,治疗组上述病变轻,且大青叶治疗组可见大量溶酶体。病毒分离结果显示3组小鼠CVB3感染后第3天即可分离 出病毒,阳性率均为66.7%,第5～10天3组均为100%,第14天感染组病毒分离阳性率为33.3%,治疗组均未分离到病毒,第21天时3组均未分离出病毒。不同时间点的3组间病 毒分离阳性率差异无显著性(P>0.05)。结论：黄芪具有保护心肌 的作用。大青叶在CVB3感染早期对VMC的病理改变具有显著影响。     

柯萨奇病毒B3诱导体外培养心肌成纤维细胞增殖与骨桥蛋白表达

病毒性心肌炎(viral myocarditis,VM)是小儿常见获得性心脏疾病之一,系病毒感染引起的心肌弥漫性或局灶性病变,近年来VM的发病呈上升趋势[1].目前VM的发病机制尚不十分清楚,病毒可引起心肌细胞发生裂解性溶解、细胞凋亡.近来研究发现变异型柯萨奇病毒B3(myocarditic coxsackievirus B3,CVB3)可通过其他受体进入心肌成纤维细胞[2],进入细胞后的CVB3毒力增加并使细胞呈持续感染状态,产生多种细胞因子,最终导致心肌纤维化、扩张性心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)[3-4].     

皮质激素对病毒性心肌炎疗效及其不良反应预防的实验研究

目的 研究皮质激素对病毒性心肌炎(VM)的疗效与不良反应及预防不良反应的对策。方法 40只小鼠平均分为6组，每组40只，A组为正常对照组，B组单用激素组，C组单纯柯萨奇病毒(CVB)组，D组CVB 早期激素(CVB感染后3d用激素)组，E组CVB 早期激素 参麦注射液(SMI)组，F组CVB 后期激素(CVB感染后10d用激素)组。于感染后第3、7、10、14、21、30、40、50天，各组分别处死5只小鼠。检查心肌病理积分、病毒滴度和停留时间、心肌细胞凋亡率和坏死率。结果 CVB3感染小鼠早期用激素，心肌病理积分和细胞坏死率显著降低，对心肌细胞凋亡率无影响，但心肌内病毒滴度增高、停留时间延长；早期用激素加SMI可显著降低上述不良反应；后期用激素可提高疗效而无不良反应。结论 VM早期用激素可减轻心肌病变，降低心肌细胞坏死率，但可使病毒滴度升高，病毒在心肌内停留时间延长，如早期同时使用SMI可预防上述不良反应?     

负显突变体细胞因子信号转导抑制物-1增强干扰素-γ体外抗柯萨奇病毒活性

目的病毒性心肌炎(VM)细胞模型JAK/STAT1信号通路的特异性内源抑制物细胞因子信号转导抑制物-1(SOCS1)及其负显突变体SOCS1(dnSOCS1)对IFN-γ抗CVB3活性影响。方法构建pEGFP-C1-SOCS1及pEGFP-C1-dnSOCS1的真核表达载体,以脂质体法转染至心肌细胞后,加用IFN-γ刺激细胞并感染病毒,采用荧光显微镜检测心肌细胞中SOCS1和dnSOCS1表达,同时利用Westernblot法测定不同条件下STAT1表达水平并测定病毒滴度。结果与转染dnSOCS1组比较,转染SOCS1组病毒滴度高,而心肌细胞存活率低,心肌细胞搏动时间短。另外在dnSOCS1组磷酸化STAT1的表达更明显。结论dnSOCS1可增强IFN-γ体外抗病毒活性。SOCS1可为我们治疗VM提供一个新的治疗靶点。     

病毒受体陷阱与病毒性心肌炎

柯萨奇B组病毒(CVB)是引起人类病毒性心肌炎(VM)的最常见病原体,CVB感染心肌细胞主要是通过与柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)及衰变加速因子(DAF/CD55)这2种受体蛋白的相互作用完成。近年来,病毒受体陷阱(virus receptor trap)已被用于治疗实验性小鼠CVB3心肌炎,并已显示出良好的抗病毒效果。所谓"病毒受体陷阱疗法"是指利用人工合成的可溶性病毒受体来结合病毒,从而阻断病毒与靶细胞膜上的受体结合及随后的病毒内吞。病毒受体陷阱疗法加深了对VM发病机制的理解,拓展了VM的治疗策略,有望成为急性VM一个新的有效治疗手段。     

栀子等中药治疗小鼠病毒性心肌炎实验研究

目的观察栀子等中药抗Balb/c小鼠Coxsakie B3病毒(CVB3)感染的急性病毒性心肌炎的疗效。方法将Balb/c小鼠随机分为模型组、栀子组、黄连组、黄芩组、大青叶组、复方组及正常对照组,腹腔注射CVB3建立病毒性心肌炎模型,用上述中药进行灌胃治疗7 d,检测小鼠心脏CVB3,病毒滴定、心肌病变形态定量分析及电镜观察细胞超微结构改变。结果中药治疗各组病毒滴定、心肌病变面积及细胞超微结构改变均较模型组减轻,复方组最轻。结论上述中药对小鼠病毒性心肌炎有一定治疗作用。     

黄芪甲甙对病毒性心肌炎小鼠神经生长因子表达的影响

目的探讨黄芪活性成分黄芪甲甙对病毒性心肌炎(VM)小鼠心肌中神经生长因子(NGF)表达的影响。方法Balb/c小鼠100只,随机分成6组。非感染小鼠腹腔无菌注射病毒培养液,分为正常对照组[A组,10只,以羧甲基纤维素钠(CMC)0.1 mL灌胃7 d]、高剂量对照组(B组,10只,9%黄芪甲甙液0.1 mL灌胃7 d);余80只小鼠以柯萨奇病毒(CVB3)腹腔无菌注射制作VM模型,VM小鼠随机分为心肌炎对照组和低、中、高剂量干预组,分别以CMC、1%、3%、9%黄芪甲甙液0.1 mL灌胃7 d(分别为C、D、E、F组,每组20只)。14 d后处死小鼠并取其心脏,采用RT-PCR和免疫组织化学检测NGF mRNA及蛋白表达水平。结果F组小鼠较C组死亡率明显降低,B组无小鼠死亡;与C组比较,NGF mRNA、蛋白表达水平以及心肌病变积分在F组均显著下降,而低、中剂量黄芪甲甙对心肌炎小鼠NGF mRNA、蛋白表达及心肌病变积分无明显影响。结论黄芪甲甙可能通过抑制NGF表达,对Balb/c小鼠CVB3心肌炎具有良好的治疗作用。     

肿瘤坏死因子-α单抗对小鼠病毒性心肌炎的影响

目的：探讨细胞间粘附分子-1(ICAM1)及肿瘤坏死因子α(TNFα)在心肌炎发病中的作用及TNF-α单克隆抗体预处理对其的影响,为临床治疗提供实验依据。方法：Balb/c雄性小鼠随机分为三组:正常对照组、柯萨奇B3病毒感染组和病毒感染加TNFα抗体干预组,采用光镜、电镜和免疫组织化学测定不同时期心肌病理变化、超微结构改变和心肌ICAM1与TNFα的表达。结果：光镜和电镜结果显示干预组心肌病理变化和超微结构改变较感染组减轻;免疫组织化学结果显示干预组ICAM1及TNFα的表达较感染组减轻(7d:14.71±1.94vs18.80±2.62,P<0.01和16.70±2.90vs20.63±1.95,P<0.05;14d:17.49±2.58vs23.51±3.50,P<0.01和19.29±3.21vs24.64±2.97,P<0.01);感染组TNFα与ICAM1的表达呈正相关(r=0.706,P<0.05),TNFα,ICAM1的表达与心肌病变积分呈正相关(r=0.737,P<0.05;r=0.693,P<0.05)。结论：TNFα与ICAM1在病毒性心肌炎小鼠的发生发展中发挥重要作用,抗TNFα单克隆抗体抑制其表达,对受损心肌有保护作用。     

卡托普利对病毒性心肌炎小鼠 NF-κB活化及 MCP- 1表达的影响

目的探讨核因子kB(NF-kB)活化在病毒性心肌炎发病机制中的作用及卡托普利对NF-kB活化的调节作用。方法55只Balb/c小鼠随机分为3组:柯萨奇病毒B3(CVB3)感染组、CVB3感染加卡托普利治疗组和对照组,分别在实验的第7、14和21天处死动物,留取血清、心肌标本,免疫组化检测心肌组织中NF-kB活化和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达,双抗体夹心ELISA法检测血清MCP-1含量。结果感染组小鼠心肌组织中NF-kB活化、MCP-1表达较对照组明显增强(P<0.01),而且与心肌病变程度相关;与对照组比较感染组小鼠血清MCP-1含量明显增加(P<0.001);治疗组心肌组织中NF-kB活化、MCP-1表达及血清MCP-1含量均较感染组显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论NF-kB活化在病毒性心肌炎发病机制中发挥重要作用,抑制NF-kB活化可能是卡托普利治疗病毒性心肌炎的作用机制之一。     

FTY720对肾大部切除大鼠肾小球硬化及细胞周期调节蛋白表达的影响

目的 观察FTY720对肾大部切除大鼠肾小球硬化的作用,探讨其作用机制.方法 采用肾大部切除制作肾小球硬化模型,分模型组和FTY720治疗组,设假手术组为正常对照组,每组8只.检测各组术前及术后第2、4、8、12周大鼠24 h尿蛋白,术前及术后8周、12周检测血尿素氮和肌酐以及残肾组织病理改变,并应用免疫组化方法检测Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)、纤维连接蛋白(FN)的表达水平及细胞周期调控蛋白p21、p27、细胞周期素E(cyclinE,CE)的表达.结果 模型组术后2周24 h尿蛋白升高至(8.07±1.61)mg/d,以后逐渐增高,12周达(28.6±12.21)mg/d,治疗组24 h尿蛋白量在术后4周为(9.90±1.49)mg/d,12周时为(11.35±2.09)mg/d,较模型组减低(P＜0.01).与假手术组相比,模型组8周血肌酐升高达(61.08±4.28)μmol/L,12周时为(130.20±23.90)μmol/L,升高更明显(P＜0.05);治疗组血肌酐则未见明显升高,12周时为(80.19±7.11)μmol/L,较模型组显著减低(P＜0.05);各组血尿素氮与肌酐变化相似.肾脏病理和免疫组化染色显示,FTY720能明显减轻大鼠硬化程度,抑制肾小球内细胞外基质Col-Ⅳ、FN的表达.细胞周期调控蛋白研究结果表明FTY720能升高肾小球p27表达,降低p21及CE表达.治疗组p21和CE表达明显低于模型组,但仍稍高于假手术组,p27明显高于模型组,与正常组无明显区别.结论 FTY720能显著降低肾大部切除大鼠的24 h尿蛋白量,防止肾小球硬化,其作用与调控细胞周期调节蛋白的表达,减少Col-Ⅳ、FN聚积有关.     

新型免疫调节剂FTY720对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响

目的 探讨新型免疫调节剂FTY720对单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠肾间质纤维化的影响。 方法 将45只SD大鼠随机分为假手术组,模型组和FTY720治疗组（UUO＋FTY720）（每组n=15)。FTY720治疗组于术前3 d给予FTY720 0.5 mg·kg-1·d-1，灌胃，每日1次，直至处死动物，模型组和假手术组给予等量生理盐水同法处理。3组分别于术后7、14和21 d平行处死5只大鼠，并收集血清和24 h尿液，观察肾功能和24 h尿蛋白变化。取梗阻侧肾脏行组织学检查，观察肾间质纤维化程度和炎性细胞浸润情况。用免疫组化方法检测肾组织中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、胶原-Ⅲ型（COL-Ⅲ）的表达水平。结果 24 h尿蛋白定量：术后14 d模型组为(15.5±1.5 ) mg·d-1，FTY720治疗组为(9.7±1.7) mg·d-1，较模型组明显降低（P<0.05）。术后7、14和21 d，模型组血清肌酐（SCr）水平分别为（123.0±15.8)μmol·L-1、（65.9±6.1）μmol·L-1和（51.4±6.9） μmol.·L-1，FTY720治疗组SCr分别为（41.8±4.5） μmol·L-1、（39.5±7.9）μmol·L-1和（38.5±4.5）μmol·L-1，均较模型组明显降低（P<0.05），FTY720治疗组与假手术组SCr水平差异无统计学意义。术后7和14 d，模型组BUN分别为（16.1±3.2）mmol·L-1和（10.7±1.7）mmol·L-1，FTY720治疗组BUN分别为（8.1±1.0）mmol·L-1和（7.0±0.8）mmol·L-1，均较模型组明显降低（P<0.05）。病理学检查显示，FTY720治疗组肾间质浸润细胞较模型组明显减少，纤维化程度明显减轻。免疫组化结果显示，α-SMA表达在假手术组中仅限于血管，而在FTY720治疗组和模型组，表达明显增多，可见于肾小管和间质细胞，但FTY720治疗组中表达要弱于模型组。假手术组各个时间点肾间质中可见少量COL-Ⅲ表达，模型组手术后7、14和21 d COL-Ⅲ表达明显增强，主要集中于肾小管间质病变明显区域,FTY720治疗组表达则明显减少。结论 FTY720可以明显减轻单侧输尿管梗阻后大鼠肾间质纤维化的程度，减少肾间质炎性细胞浸润，在一定程度上可抑制肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质的积聚，对肾功能有一定的保护作用。     

卡托普利对病毒性心肌炎小鼠心肌线粒体结构及其酶活性的影响

目的　研究卡托普利对病毒性心肌炎小鼠心肌线粒体结构和三磷酸腺苷 (ATP)酶活性变化的影响。方法　将雄性Balb/c小鼠随机分为柯萨奇病毒B3 (CVB3 )感染组、CVB3 感染加卡托普利治疗组和对照组。以d3、d14为两个时相点 ,比较线粒体超微结构 ,线粒体Na+ K+ ATP酶、Ca2 + ATP酶活性变化。结果　感染组心肌细胞线粒体结构破坏 ,线粒体Na+ K+ ATP酶、Ca2 + ATP酶活性较对照组显著下降 (P均 <0 .0 1)。卡托普利治疗组各时相点线粒体结构破坏较轻 ,线粒体Na+ K+ATP 酶、Ca2 + ATP酶活性较感染组明显增高 (P均 <0 .0 5 )。结论　病毒性心肌炎早期即可见心肌线粒体结构破坏 ,ATP酶活性下降。卡托普利可有效保护心肌线粒体结构和功能     

神经生长因子在小鼠病毒性心肌炎心肌中表达的意义

目的探讨病毒性心肌炎(VMC)发病过程中,心肌组织神经生长因子(NGF)表达的动态变化及发病机制中作用。方法70只4周龄雄性BALB/C小鼠腹腔接种0.1ml的CVB3建立VMC模型,10只同周龄同品系小鼠腹腔接种Eagle’s液作为对照组。VMC组于接种后3、7、15、30d,对照组于30d处死,采用RT-PCR、免疫组化检测心肌NGF mRNA及蛋白表达,并对NGF表达水平与心肌病变积分进行相关性分析。结果VMC组3~30d各时点心肌NGF mRNA及蛋白表达水平均明显增高,以7d时为最高,与对照组比较,差异均有显著性(P<0.05或0.01),而且NGF蛋白表达水平与心肌病变积分呈显著正相关(r=0.90,P<0.05)。结论NGF过度表达可能在病毒性心肌炎的发病机制中起重要作用。