逆转录病毒介导的HyTK基因转移及杀伤恶性黑色素瘤细胞的…

用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因导入恶性肿瘤细胞，随后应用药物丙氧鸟苷可选择性杀死肿瘤细胞。本研究中我们将ＨｙＴＫ基因克隆到逆转录病毒载体ＬＸＳＮ中，并初除其中的ＳＶ４０早期启动子，构建成重组逆转录病毒载体ＬＨｙＴＫ／Ｎ，并用该重组病毒转染小鼠恶性黑色素瘤细胞系Ｂ１６细胞，经ＰＣＲ方法检测证明ＨｙＴＫ基因已成功地导入了肿瘤细胞中，且不含可复制的辅助病毒。     

逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用

目的：探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用。方法 应用PA317细胞包装的逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统,在体外以逆转录病毒上清感染法将TK基因导入MKN28人胃癌细胞,并初步观察更昔洛韦（GCV）对转染TK基因的MKN28胃癌细胞的杀伤作用。结果：TK基因可成功转导入MKN28细胞,且对细胞的生长状态无明显影响。但对GCV的敏感性却显增加;同时还观察到显的“旁观效应”。结论：逆转录病毒介导的HSV-TK系统对人胃癌细胞有较高的转染效率,GCV对转染阳性的胃癌细胞有显的杀伤作用。     

逆转录病毒载体介导的标志基因转移研究

目的：为建立高效、安全的逆转录病毒介导的基因标记系统。方法：用脂质体方法将含有标志基因 Ｎｅｏ Ｒ的逆转录病毒载体 Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 导入包装细胞 Ｐ Ａ３１７ ;通过与单向型包装细胞 Ｇ Ｐ Ｅ８６ 相互转导,获得高滴度的双嗜型产病毒细胞,并以其对人类白血病细胞进行基因标记。结果：脂质体转染法获得的病毒滴度约为２ ．０ ×１０５ Ｃ Ｆ Ｕ／ ｍｌ,而与 Ｇ Ｐ＋ Ｅ８６ 细胞转导后可提高至２ ．８ ×１０６ Ｃ Ｆ Ｕ／ ｍｌ;重组病毒转导白血病细胞（ Ｈ Ｌ－ ６０ , Ｋ５６２ , Ｋ Ｇ－ １） 后,聚合酶链反应（ Ｐ Ｃ Ｒ） 证实 Ｎｅｏ Ｒ 基因整合到靶细胞基因组,巢式 Ｐ Ｃ Ｒ 与补救分析均未能检测到辅助病毒。结论：“乒乓效应”可显著提高逆转录病毒滴度,而逆转录病毒介导的基因标记系统是安全的。     

逆转录病毒介导的HSV-TK基因对人骨肉瘤细胞的杀伤作用

目的 探讨骨肉瘤基因治疗的可行性。方法 采用逆转录病毒介导的HSV-TK基因转移和GCV治疗的方法进行研究。结果 成功构建含HyTK基因的重组逆转录病毒载体DORHyTK;采用DOTAP将其转入PA317细胞中进行包装,筛选,并进行病毒滴度测定。收获病毒上清体外感染骨肉瘤细胞株OS732和SAOS-2。分别用PCR和RNA斑点杂交的方法证明假病毒中不含有复制活性病毒,HSV-TK基因已整合到宿主细胞基因组中,并获得表达,MTT比色法测定结果显示GCV对OS732TK和SAOS-2TK细胞均有明显的杀伤作用。且前者强于后者,旁观者效应在高细胞密度接种条件下强于低细胞密度,在SAOS-2细胞中的作用强于OS732。结论 HSV-TK/GCV基因治疗系统可为骨肉瘤的治疗提供新途径。     

重组逆转录病毒载体介导基因转移的现状及思考

目的在将目的基因导入靶细胞实现基因治疗的过程中，载体起着关键作用。令人遗憾的是至今仍未能。建立一种兼顾安全与高效的载体系统，即使研究应用最广的逆转录病毒载体也不例外，利用重组逆转录病毒介导基因转移弥补及克服传统载体的缺陷，实现安全而高效的基因治疗势在必行。     

重组TNF－α基因逆转录病毒转移系统的构建

将人ＴＮＦ－αｃＤＮＡ功能片段０．９ｋｂ克隆于逆转录病毒载体ＰＬＪ，构建成重组逆转录病毒载体ＰＬＪ－ＴＮＦ；在磷酸钙介导下，将其导入包装细胞ψＣＲＩＰ和ψＣＲＥ中，经克隆筛选，获得了病毒滴度为１０６ＣＦＵ／ｍｌ能稳定、高效分泌含ＴＮＦ－α基因重组病毒颗粒的细胞株ＰＬＪＣ－５。     

含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK的建立

目的 :研究肿瘤的自杀基因疗法 ,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK。　方法 :应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G4 18筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因整合和病毒颗粒分泌情况。　结果 :逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,G4 18后筛选得到阳性克隆细胞 ,命名为PA317/TK。PCR检测PA317/TK细胞出现一特异性 4 0 4bp阳性条带 ,而PA317细胞没有扩增出相应条带。PA317/TK细胞经扫描电镜检测见其表面有颗粒状突起 ,其周围有许多呈团状的病毒颗粒。证实含HSVtk基因重组逆转录病毒存在于包装细胞中。　结论 :成功建立含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞     

逆转录病毒上清液瘤内注射介导体内mdrl基因转移

目的 探讨逆转录病毒上清液瘤内及瘤周注射介导体内ｍｄｒｌ基因转移。方法 应用逆转录病毒上清液裸鼠皮下移植瘤内及瘤周注射法转移ｍｄｒｌ基因,腹腔注射化疗药物观察肿瘤模型的耐药性,免疫组化检测肿瘤细胞Ｐ－ＧＰ的表达,ＲＴ－ＰＣＲ检测肿瘤内ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ的表达量。结果 携带ｍｄｒｌ基因的逆转录病毒上清液注射后肿瘤模型表现出多药耐药性,高滴度病毒上清液可达到６０％细胞表达Ｐ－ＧＰ,是病毒原液基因转移率     

基因转移FasL诱导人黑色素瘤细胞凋亡的体外实验

目的 探讨体外基因转移Fas配体（Fas-ligand,FasL)对人恶性黑色素瘤细胞凋亡的影响。方法 用携带人FasL,cDNA的缺陷型重组腺病毒载体（Ad-FL)，在体外转导两株黑色素瘤细胞，并使其表达；通过流式细胞仪，RT－PCR法进行Fas/FasL表达检测，TUNEL法及荧显微镜相关凋亡检测，分析，结果 流式细胞仪和RT－PCR检测两株黑色素瘤细胞表面均表达Fas，不表达FasL，而Ad-FL转导的两株黑色素瘤细胞均能表达FasL，Ad-FL能显著诱导两株黑色素瘤细胞在体外凋亡或抑制其生长。结论 重组腺病毒FasL在体外诱导人黑色素瘤凋亡效果显著。     

逆转录病毒介导的野生型p53基因转入对慢粒多药耐药细胞恶性表型的影响

以Ｋ５６２／ＨＨＴ 细胞为模型,采用重组逆转录病毒载体介导的基因转移技术,将人野生型ｐ５３ｃＤＮＡ转入该细胞系,研究外源性野生型ｐ５３ 基因在白血病多药耐药细胞表达的意义。结果显示,外源性野生型ｐ５３ 基因抑制细胞增殖,一般形态学观察见细胞明显向成熟型分化。流式细胞仪分析还显示ｐ５３ 基因诱导Ｋ５６２／ＨＨＴ细胞死亡且伴有细胞周期Ｇ１ 期的生长阻滞。结果表明,野生型ｐ５３ 基因对多药耐药的白血病细胞能部分降低其恶性表型     

逆转录病毒介导的造血干细胞基因治疗

造血干细胞 (ＨＳＣ)作为基因治疗的靶细胞具有较大的疾病治疗潜能 ,基因治疗临床方案近 1 3涉及到ＨＳＣ[1 ] 。替换性基因转移可用于治疗造血系统遗传性疾病 ,包括血红蛋白病、免疫缺陷综合征、溶酶体贮积病和糖原贮积病等 ,也适应于造血系统的一些获得性疾病 ,包括抗癌化疗所诱导的骨髓抑制[2 ] ,由于癌基因活化所致的白血病[3 ] 和病毒诱导性疾病 ,如获得性免疫缺陷综合征[4] 。造血干细胞及其子代细胞直接与血液相接触 ,或存在于血液循环之中 ,极利于转染细胞的表达产物释放入血液。因此 ,除造血系统的遗传性和获得性疾病外 ,造血干细…     

重组逆转录病毒介导的人载脂蛋白AI基因在肌源细胞中的表达

目的 探索一种安全有效的载脂蛋白ＡＩ基因表达系统。方法 构建含人载脂蛋白ＡＩ ｃＤＮＡ的双顺反子逆转录病毒载体ｐＬＡＥＮ,用其转化小鼠原代肌母细胞及肌源性细胞Ｃ２Ｃ１２,ＥＬＩＳＡ法检测细胞液中人载脂蛋白ＡＩ的含量。结果 转化后的小鼠原代肌母细胞及Ｃ２Ｃ１２细胞在分化为肌管细胞后均获得异源表达人载脂蛋白ＡＩ的能力;而且经Ｇ４１８筛选也获得稳定转化的Ｃ２Ｃ１２细胞株,３０天后仍保持有效表达人载脂蛋白     

逆转录病毒介导外源基因高效感染大鼠骨髓间充质干细胞

目的 通过逆转录病毒系统将小鼠同源盒基因Soxl转移至大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）。检测外源基因的表达，感染效率及感染时间。方法 常规分子生物学亚克隆技术构建重组逆转录病毒载体，转染至包装细胞株PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液，感染rMSC，并用带EGFP表达盒的pLEGFP-N1载体的逆转录病毒系统作为平行对照，评估感染率；使用Westernblot以及免疫组织化学的方法检测携带目的基因的重组逆转录病毒在rMSC中的感染和表达情况。结果 本实验成功地制备了pLXSN—Soxl重组逆转录病毒载体并制备出高滴度病毒颗粒；将病毒上清感染rMSC，EGFP阳性细胞为21％，感染时间持续20d，而对照脂质体转染法EGFP阳性细胞仅为3％。免疫组化及Westernblot显示用重组逆转录病毒液感染的rMSC可表达外源基因产物Soxl蛋白。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将外源性基因高效转移至rMSC中，并有外源性基因的稳定表达。     

293包装细胞产生重组逆转录病毒的基因转染研究

目的 :如何提高重组逆转录病毒的滴度和基因转染率 ,是目前需要研究的问题。方法 :目的基因连接到病毒载体形成重组子 ;病毒载体质粒转入包装细胞 2 93 ,产生无复制能力的病毒颗粒 ;用病毒感染NIH3T3细胞 ,测定病毒的滴度 ;将携带有目的基因的病毒颗粒转染靶细胞 ,绿色荧光蛋白 (GFP)为转染阳性细胞的标记物 ,FACS分离阳性细胞 ;Westernblot检测目的基因表达。结果 :用包装细胞 2 93产生的病毒颗粒 ,其滴度高达 3× 10 9;用携带目的基因的病毒转染悬浮细胞UT7,转染率为 60 % ,转染贴壁细胞MDA -MB -4 3 5 ,转染率为 99% ,转染原代培养的造血干细胞 ,转染率为 3 1% ;UT7细胞和MDA -MB -4 3 5细胞分别表达目的基因的产物 ,5个月以后 ,仍能提出滴度的病毒 ,并能有效地转染靶细胞 ,转入的目的基因能持续和稳定地表达 ,仍能提出基因产物     

TH基因逆转录病毒表达载体的构建及产病毒细胞系的建立

目的　构建含有鼠酪氨酸羟化酶 (TH)基因的重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH,建立 PA317产病毒细胞系。方法　将质粒 p GEM- 2上酶切下的 THc DNA片段与线性化的逆转录病毒表达载体 N2 A连接 ,克隆出重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH。把 p N2 ATH质粒转入 PA317包装细胞 ,通过 G4 18抗性筛选 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,得到高滴度产毒 PA317/p N2 ATH细胞株 ,免疫组化测定细胞 TH表达。结果　重组质粒 p N2 ATH经酶切鉴定证明 THc DNA正向插入 N2 A表达载体中 ,PA317/p N2 ATH产毒细胞高效表达 TH。结论　成功地构建了重组逆转录病毒表达载体p N2 ATH,建立了 PA317/p N2 A产毒细胞株     

表达mFasL的新型双顺反子逆转录病毒基因转移体系的建立

为建立表达小鼠 Fas配体 (m Fas L)的内部核糖体进入位点 (IRES)串联的双顺反子新型逆转录病毒基因转移体系 ,用基因重组技术将 m Fas L c DNA基因构建到 IRES双顺反子逆转录病毒载体 (PL XIN)中 ,脂质体法将此重组质粒 PL FIN和空载体 PL XIN分别转染包装细胞 (PA317) ,经 G418筛选出抗性包装细胞克隆 ,基因组 DNA PCR测定基因整合情况。并将抗性 PA317克隆培养上清感染小鼠成纤维细胞系 (NIH3T3) ,筛选出高滴度的 PA317细胞系 ;用流式细胞术测定筛选的 NIH3T3细胞目的基因表达状况 ;以抗性 NIH3T3和 Fas+Yac- 1细胞共培养法检测目的基因的生物学活性。筛选出 12个 PL FIN转染的 PA317细胞克隆中 ,最高产毒效价为 8.5× 10 5CFU(colony- form ing- unit) ;经此上清感染、筛选出的 NIH3T3细胞 ,高表达 m Fas L (阳性率高于对照组 5 2 .5 4% ) ;且能显著诱导 Fas+Yac- 1细胞凋亡 (凋亡率高于对照组 49% )。说明成功建立了表达 m Fas L 的双顺反子逆转录病毒基因转移体系     

假型逆转录病毒高效介导人乳腺癌细胞基因转移

目的 :探索假型逆转录病毒MuLV/VSV G在乳腺癌细胞基因转导的效率 ,为乳腺癌细胞基因转导找寻一种高效的载体。方法 :将含报道基因的假型逆转录病毒MuLV/VSV G转导入人乳腺癌MDA MB 435细胞 ,观察其转导效率 ,并与MuLV的转导效率进行比较。结果 :MuLV/VSV G的转导效率达 (92± 12 ) % ,MuLV的转导效率为 (2 4±5 ) % ,前者较MuLV转导效率提高 3.8倍。结论 :假型逆转录病毒MuLV/VSV G可作为一种高效的载体广泛应用于乳腺癌的基因治疗研究。     

逆转录病毒载体介导的人IFN—r基因在膀胱癌细胞中的表达

逆转录病毒载体介导的人ＩＦＮ－ｒ基因在膀胱癌细胞中的表达辛军王晓雄王鑫冯东晓李春海孟书礼本课题为“九五”全军医药卫生科研基金资助项目作者单位：１００８５３北京中国人民解放军总医院泌尿外科（辛军、王晓雄、孟书礼）；中国人民解放军军事医学科学院基础医学研...