PTEN基因剪接变异体与肝细胞肝癌发生的相关研究

目的研究PTEN基因在肝细胞肝癌中是否存在新的剪接变异体,探讨PTEN基因在肝细胞肝癌发生发展中的作用。方法提取肝细胞肝癌组织的RNA,逆转成cDNA。根据Genbank上的PTEN基因cDNA序列,设计6对引物,并以肝细胞肝癌组织cDNA为模板分别扩增外显子1～2、1～3、2～4、3～5、4～6和5～7之间的片段,得到的PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳,比较不同样本扩增出来的目的条带的异同。结果每对引物分别做了61例肝细胞肝癌组织,3%琼脂糖凝胶电泳后发现每对引物扩出来的目的条带大小相同,与野生型剪切体一致。结论PTEN基因在肝细胞肝癌中不存在新的剪接变异体,说明在肝细胞肝癌发生发展中PTEN没有出现异常的mR-NA剪接突变。     

大鼠磷脂酶C-γ1前体mRNA剪接的初步鉴定

目的 探讨在大鼠中是否存在磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)选择性剪接变异体的表达及其可能意义.方法 针对在人中已发现的选择性剪接位点(即第30内含子的3'末端与第31外显子交界处)自行设计引物,将大鼠RNA逆转录为cDNA后,再用该对引物进行PCR扩增及序列测定.用此方法初步筛查了大鼠包括胚胎时期、出生早期、成年时期6种脏器组织心、肝、肺、肾、脑和眼球样品共21份.结果 在大鼠中未发现与人相似的第一种剪接方式PLC-γ1aNM 002660).结论 (1)由于不同物种之间的差异,在大鼠中可能不存在与在人类中已发现的PLC-γ1前体mRNA相似的选择性剪接方式,在大鼠中PLC-γ1转录后的剪接主要以与人类相似的第二种剪接方式(PLC-γ1b)为主.(2)在大鼠中PLC-γ1的选择性剪接位点可能与人不同而位于其他位点.     

Survivin及其剪接变异体在宫颈病变组织中的表达研究

目的:探讨survivin及其剪接变异体在宫颈上皮病变组织中的表达及意义。方法:采用RT-PCR方法检测10例宫颈炎、10例宫颈上皮内瘤变Ⅰ级(Cervical intraepithelialneoplasiaⅠ,CINⅠ)、20例CINⅡ～Ⅲ及20例宫颈鳞状上皮细胞癌(squamouscellcarcinoma,SCC)组织中survivin、survivin-2B、survivin-ΔEx3、survivin-2αmRNA表达。结果:survivin及其剪接变异体在SCC组织中表达普遍升高,其表达阳性率随宫颈上皮病变的进展逐渐升高。Spearman等级相关分析显示survivin、survivin-2B和survivin-ΔEx3的表达与宫颈上皮病变的级别呈高度正相关(rs=0.864、0.899、0.827,P<0.01),survivin-2α的表达与宫颈上皮病变的级别呈中度正相关(rs=0.612,P<0.01);survivin-2B、survivin-ΔEx3和survivin-2α的表达与survivin的表达呈高度正相关(rs=0.922、0.991、0.999,P<0.01)。结论:survivin剪接变异体伴随着survivin的表达在宫颈上皮病变中表达逐渐升高,可能与survivin一起共同参与了宫颈癌的发生、发展,有望成为宫颈癌基因治疗的新靶点。     

前列腺特异性膜抗原新型剪接变异体PSM-E 在外周血的定量表达

 【目的】 检测分析前列腺特异性膜抗原(PSMA)及其新型剪接变异体(PSM-E)在前列腺癌(PCA)及良性前列腺增生(BPH)患者外周血中的表达,探讨其意义&#65377; 【方法】 通过实时荧光定量PCR方法对PSM-E&#65380;PSMA在前列腺癌(53例)和前列腺增生(79例)两组患者外周血中定量表达,分析其差异&#65377; 【结果】 PSM-E相对表达量在PCA组(-8.22 ± 0.32)高于BPH组(-9.99 ± 0.41),P < 0.001;PSMA相对表达量在PCA组(-12.51 ± 0.31)高于BPH组(-13.72 ± 0.48),差异有统计学意义,P < 0.05; PCA组和BPH组内PSMA与PSM-E相对表达量有相关性(r = 0.36,P < 0.05; r = 0.65,P < 0.01),与血清PSA均不相关&#65377; 【结论】 外周血定量检测PSM-E表达差异可用于区分良性前列腺增生和前列腺癌;与PSMA相比PSM-E表达量更高,其检测的灵敏度更高,PSM-E诊断前列腺癌的敏感性和特异性更好&#65377;     

前体mRNA剪接因子基因突变与视网膜色素变性的研究进展

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)是一种遗传性进行性视细胞损伤性疾病,具有基因型和表型异质性。目前已鉴定的RP致病基因达到103个,其中有一类基因(PRPF3、PRPF4、PRPF6、PRPF8、PRPF31、SNRNP200、RP9和DHX38)与前体mRNA剪接相关,该类基因全身广泛表达,但其突变后引起RP这种组织特异性表型疾病的机制目前尚不清楚。现汇总近年来国内外研究进展,介绍前体mRNA的剪接过程、前体mRNA剪接因子在剪接过程中的作用及前体mRNA剪接因子导致RP的疾病模型,并探讨前体mRNA剪接因子突变导致RP的致病机制。     

Survivin基因及其主要剪接变构体mRNA在大肠癌组织中的表达

目的:探讨大肠癌组织中Survivin基因及其主要剪接变构体与癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)CAM5 mRNA表达的临床意义.方法:39例大肠癌切除标本,采集肿瘤组织、癌旁2.5 cm组织和距离肿瘤10 cm以上的正常大肠组织各1块,采用RT-PCR方法检测总survivin、survivin-ΔEx3、survivin-2B、survivin-3B、survivin,2α和CEA CAM5 mRNA的表达.用凝胶图像分析系统或SYBR Green I实时荧光定量PCR检测上述基因mRNA的表达水平.结果:总survivin、survivin-ΔEx3、survivion-2B、survivin-3B、survivin 2α和CEA CAM5 mRNA在大肠癌组织中的阳性表达率分别为100.0%、92.3%、92.3%、79.5%、87.2%和97.4%,均高于癌旁2.5 cm组织中的38.5%、25.6%、28.2%、7.7%、12.8%和12.8%,差异均有统计学意义(P<0.01).正常肠壁组织中上述mRNA的阳性表达率分别为17.9%、5.1%、7.7%、0.0%、2.6%和11 10.3%,与癌旁2.5 cm组织比较,总survivin、survivin-△Ex3和surrvivin-2B差异有统计学意义(p<0.05).总 survivin及其剪接变构体和CEA CAM5 mRNA的表达水平,大肠癌组织高于癌旁2.5 cm组织(p<0.01);癌旁2.5 cm组织与正常组织的差异均无统计学意义(p>0.05).survivin剪接变构体mRNA的表达水平与-些临床病理参数有关(p<0.05).结论:survovin和其剪接变构体mRNA在大肠癌组织中呈高表达,表达水平与恶性临床病理参数有关.检测survivin和其剪接变构体mRNA表达对大肠癌前预报与早期诊断比cEA mRNA更有价值.     

选择性剪接变异体的RT-PCR检测及结果分析

目的 利用RT-PCR方法检测并分析mRNA选择性剪接变异体.方法 针对糖原合成酶激酶(GSK)3β和B细胞转位基因( BTG)3基因变异体差别设计引物,利用RT-PCR扩增后进行电泳和克隆DNA测序.结果 GSK3β和BTG3的RT-PCR产物电泳均出现3条带,经过电泳和克隆DNA测序发现GSK-3β中上面2条带为同一产物.对BTG3上(位于319 bp)、下(位于70 bp)2条带进一步PCR扩增后测序,结果发现3个条带均为同一产物.结论 RT-PCR法检测选择性剪接产物操作方便,对Western蛋白印迹结果评价具有指导意义,但是产生的非特异条带可能是由于某种特殊原因造成,如选择性剪接部位的特异核酸序列,需DNA测序做进一步确定.     

前列腺特异性膜抗原新型剪接变异体PSM-E在外周血的定量表达

【目的】检测分析前列腺特异性膜抗原（PSMA）及其新型剪接变异体（PSM．E）在前列腺癌（PCA）及良性前列腺增生（BPH）患者外周血中的表达,探讨其意义。【方法】通过实时荧光定量PCR方法对PSM—E、PSMA在前列腺癌（53例）和前列腺增生（79例）两组患者外周血中定量表达,分析其差异。【结果】PSM．E相对表达量在PCA组（-8．22&#177;0．32）高于BPH组（-9．99&#177;0．41）,P〈0．001;PSMA相对表达量在PCA组（-12．514-0．31）高于BPH组（-13．72&#177;0．48）,差异有统计学意义,P〈0．05;PCA组和BPH组内PSMA与PSM—E相对表达量有相关性（r=0．36,P〈0．05;r=0．65,P〈0．01）,与血清PSA均不相关。【结论】外周血定量检测PSM—E表达差异可用于区分良性前列腺增生和前列腺癌;与PSMA相比PSM．E表达量更高,其检测的灵敏度更高,PSM—E诊断前列腺癌的敏感性和特异性更好。     

两个新的人Flt3配体差异剪接体的克隆

目的:寻找新的人Flt3配体(hFL)的差异剪接体.方法:从健康志愿者外周血中分离单个核细胞,一步法提取总RNA,逆转录成cDNA,应用胞外区特异性引物PCR扩增hFL的胞外区并克隆至真核表达质粒,进行序列测定分析.结果:序列分析发现了两个新的hFL的差异剪接体,均发生在重要的第5外显子功能域,分别在434 bp处有一个胞嘧啶的插入和在426～478 bp之间缺失了53个bp.结论:hFL存在两个新的差异剪接体,此项发现为进一步的功能研究提供了基础.     

EOLA1基因突变体的克隆和鉴定

目的 对ECV304细胞株EOLAI基因进行克隆测序以及mRNA水平检测。方法 采用RT-PCR扩增EOLAI基因片断，连接到T载体进行测序。结果 测序发现一种目的基因mRNA剪接突变体，其第3外显子起始部分比Genebank数据库相应序列多出19个碱基。RT-PCR显示剪接突变体与野生型EOLAI基因具有不同的表达水平和LPS反应性。结论 发现一个EOLA1基因剪接突变体，其生物学功能尚不清楚。     

肝癌相关基因的分子克隆和可变剪切分析

目的: 获取肝癌相关基因(hepatoma associated gene,HTA)的mRNA分子全长序列并对其可变剪接进行分析,检测其转录本在各肝癌细胞系中的表达,为进一步研究该基因在肝癌发生、发展中的作用奠定基础。方法: 用3'RACE 和5'RACE方法扩增HTA基因的全长序列并对其序列信息和可变剪接进行扩增和测序分析,用Northern印迹检测该基因转录本在不同肝癌和正常肝细胞系中的表达。结果: HTA基因全长序列为1414 bp,经分析该序列包含3个外显子,2个内含子,其中2号内含子在可变剪接中被作为外显子表达。Northern印迹显示HTA基因1.7 kb转录本和1.4 kb转录本均表达于恶性肝癌细胞系,而不表达于正常细胞系。结论: 成功获得了HTA基因的全长序列并对其可变剪接进行了分析,2个大小不同的转录本均在肝癌细胞系中特异性表达,作为一个肝癌相关基因值得进一步深入研究。     

Modification of Alternative Splicing of Bcl-x Pre-mRNA in Bladder Cancer Cells

The development , progression, and mainte-nance of cancer involve deregulation of apoptosis .Genetic and biochemical studies have revealed thatPCDis under complex and delicate regulation. Ani mportant level of such regulation may be pre-mR-NAsplicing. Many apoptotic regulatory genes un-dergo alternative splicing to control the gene ex-pressionlevel .Forinstance ,Bcl-x has two alterna-tive 5' splice sites and produces two distinct pro-teins :Bcl-xL and Bcl-xS.Bcl-xL,like Bcl-2 ,is a-ble t…     

表达工程化剪接因子腺病毒的构建及其在调控乳鼠心肌细胞中的YAP1可变剪接中的应用

目的 构建人工剪接因子,实现调控心肌细胞YAP1的可变剪接。方法 本研究根据Pumilio1的序列特异性,针对YAP1的Exon6构建不同序列的剪接因子。实验分为3组：野生型PUF-SR作为阴性对照组、人工化的PUF-SR腺病毒转染组、质粒转染组。实验流程：使用同源重组的方法构建腺病毒,将人工化的PUF-SR的PCR片段克隆到pAd-Track质粒中,再将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中进行质粒扩增。扩增后的质粒经PacⅠ酶切后,转染到293A细胞,进行腺病毒包装。将得到的腺病毒载体转染到培育的乳鼠心肌细胞中。选用Ad-Track质粒用于对照转染组,通过载体转染法将其转染到乳鼠心肌细胞中。定量和半定量PCR法检测YAP1的可变剪接,Western blot法检测融合蛋白Flag的信号,并使用GAPDH抗体检测GAPDH作为加载对照。结果 腺病毒转染组对心肌细胞的转染效率接近100%,质粒转染组中并没有发现荧光蛋白。在Western blot实验中,阴性对照和靶向YAPExon6XULIE 序列的Flag-SR-NLS-PUF都能够检测到融合Flag的蛋白的表达。在反转录PCR和PCR检测YAP1的可变剪接实验中,结果都显示YAP1的第4个target序列所构建的人工剪接因子能够有效调控YAP1 Exon 6的剪入（P<0.05）。结论 本实验成功构建出能够调控YAP1可变剪接的腺病毒,并且在SD大鼠的心肌细胞中得到了验证。     

Novel splicing variant of the human orphan nuclear receptor Nurr1 gene

Theorphannuclearreceptor,Nurr1,isamemberofthesteroid/thyroidhormonenuclearreceptorsuperfamily Thegenehasbeenmappedtochromosome2 q2 2 2 3,andcontainseightexonsandsevenintrons ,withatotalsizeof 9 82 2kb 1　IthasbeendemonstratedthatNurr1isnotonlyessentialforfinaldifferentiationofventralmesencephalicdopaminergic(DAergic) precursorneuronsintothematureDAergicphenotype,butisalsorequiredforthenormalfunctionofmatureDAergicneurons 2 ,3　SeveralstudieshavesuggestedthattheNurr1genemaybeinvolvedin…     

不同剪切形式的小鼠Era对L-929细胞的影响

目的: 构建两种完全可调控诱导不同剪接形式小鼠era的真核表达载体,检测不同剪接形式的鼠Era蛋白对细胞生长状态的影响.方法: 构建两种不同剪接形式鼠era的完全可调控诱导表达载体,分别与受体表达载体pERV3稳定共转染鼠成纤维细胞系L-929.用PonA进行诱导表达后,以Western Blotting检测Era蛋白表达水平,以MTT法测定细胞生长曲线,以流式细胞仪检测细胞周期.结果: 成功获得稳定的可完全诱导表达两种不同剪接形式鼠Era蛋白的细胞系;经过PonA诱导后,过表达两种剪接形式Era蛋白的L-929细胞,生长速度加快,G2/M期细胞数量明显减少.结论: 两种剪接形式鼠Era蛋白在真核细胞周期中发挥重要作用.     

DNA重新甲基化酶3b在成年及新生小鼠部分组织中的选择性？…

目的 探讨哺乳动物ＤＮＡ重新甲基转移酶３ｂ（Ｄｎｍｔ３ｂ）在新生及成年小鼠多种组织中的选择性剪接表达。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ结合毛细管电泳分析新生及成年小鼠主要器官中Ｄｎｍｔ３ｂ的选择性剪接表达产物,并通过计算机分析Ｄｎｍｔ３ｂ外显子１０和外显子２１、２２选择性剪接对该基因功能可能产生的影响。结果 成年小鼠肝组织中大部分Ｄｎｈｍｔ３ｂ转录本保留外显子１０,而其它组织的大部分转录本中此序列被剪切掉。     

利用5''''-RACE技术进行人肝再生增强因子相互作用肽cDNA5''''末端快速扩增及序列分析

目的:利用5'-RACE技术进行人肝再生增强因子(hALR)相互作用肽cDNA5'末端快速扩增并进行序列分析.方法:按照5'-RACE试剂盒(Takara)操作流程进行hALR相互作用肽cDNA5'末端快速扩增,用BLAST技术对扩增序列进行生物信息学分析.结果:成功获取487bp的5'-RACE反应产物,其中5'端延伸了275bp,同源序列分析表明与人Citron激酶mRNA高度同源.结论:5'-RACE技术可以用于快速有效扩增已知部分cDNA序列的5'末端,Citron激酶可能是与hALR具有相互作用的蛋白.