rhHSP70对食管癌细胞RNA转染的脐血树突状细胞诱导CTL抗肿瘤功能的影响

目的研究重组人热休克蛋白70(rhHSP70)联合食管癌细胞RNA转染脐血树突状细胞(DCs)对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)特异性抗肿瘤作用的影响。方法分离脐血单个核细胞,经rhSCF、rhGM-CSF和IL-4诱导和食管癌RNA转染形成成熟DCs,加入rhHSP70,检测DCs表面标志及DCs诱导的T细胞增殖、CTL杀伤活性。结果食管癌RNA转染后DCs高表达抗原提呈分子、协同刺激分子和黏附分子,对T细胞的促增殖作用和CTL杀伤活性显著增强(P<0.01),rhHSP70能显著促进DCs功能。结论 rhHSP70具有增强食管癌细胞RNA转染的DCs对T细胞的促增殖和CTL杀伤活性的作用。     

含未甲基化CpG寡脱氧核苷酸对人外周血树突状细胞抗肿瘤作用的影响

目的：研究含未甲基化CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)对人外周血树突状细胞(dendritic cells，DC)分化、成熟及其抗肿瘤作用的影响。方法：分离正常人外周血DC,透射电镜观察CpG ODN刺激组和未刺激组DC的超微结构，流式细胞仪分析其表面HLA-DR、CD86的表达，MTT法检测其对同种异体混合淋巴细胞反应(mixed—lymphocyte reactor，MLR)中T细胞增殖的影响及调节T细胞杀伤肿瘤的能力。结果：与未刺激组相比，CpG ODN刺激组DC表面突起细、长且规则，粗面内质网增多，空泡减少甚至消失；同时DC表面HLA-DR、CD86的表达上调，能明显促进MLR中T细胞的增殖，增强DC调节T细胞杀伤肿瘤活性：结论：CpG ODN可诱导人外周血DC分化成熟，增强DC调节T细胞杀伤肿瘤活性。     

胶质瘤RNA致敏的人脐血树突状细胞诱导细胞毒T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

目的:制备人脐血来源的树突状细胞(DCs),用胶质瘤RNA诱导其成熟,并观察DCs诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)体外杀伤肿瘤细胞的活性.方法:以rhGM-CSF、IL-4诱导人脐血单个核细胞向DCs分化并鉴定.提取胶质瘤RNA与DCs混合,使DCs致敏,未致敏的DCs为对照组.观察细胞形态并检测致敏前后DCs的表型.将DCs与外周血T细胞共培养,以胶质瘤细胞为靶细胞,采用MTT比色法检测T细胞抗肿瘤活性差异.结果:人脐血单个核细胞于诱导第5 d呈现典型的DCs形态;经rhGM-CSF、IL-4诱导培养后,CD86、CD11c、CD54、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子表达与培养前比较均明显增高(P＜0.01).负载抗原后,MHC-Ⅰ和CD54表达与负载抗原前相比进一步增高(P＜0.05).以DCs诱导活化的T细胞与胶质瘤细胞共培养可使胶质瘤细胞的生长受到抑制,并最终导致其死亡;杀伤率与未负载抗原的对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01).结论:人脐血单个核细胞在细胞因子的诱导下扩增并分化为DCs.经抗原致敏后,能增强淋巴细胞对相应肿瘤细胞的体外杀伤效应.     

人胃癌BGC823细胞RNA转染脐血树突状细胞分泌的exosomes对T细胞增殖及杀瘤活性的影响

目的:探讨肿瘤细胞RNA转染脐血树突状细胞(DCs)分泌的exosomes对细胞毒T细胞(CTL)特异性抗肿瘤作用的影响.方法:分离脐血单个核细胞,经干细胞因子(SCF)、粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)诱导和BGC823 RNA转染形成成熟DCs,收集DCs培养上清,采用超速离心法分离exosomes,并用透射电镜、SDS-PAGE和Western blot进行鉴定;利用MTT比色分析法观察exosomes诱导T细胞增殖和CTL的杀瘤活性.结果:经诱导和BGC823 RNA转染后DCs分泌的exosomes表达MHC-Ⅱ、CD54、CD86,对T细胞的刺激指数(SI)为(2.53±0.09),CTL杀瘤活性(64.92±0.37)%,较转染前的(1.26±0.07)和(35.28±0.16)%均增高(P＜0.01).结论:从脐血中诱导的DCs经肿瘤细胞RNA转染后分泌的exosomes,能在体外活化T细胞,有望成为新型非细胞结构的DCs亚单位疫苗.     

脐静脉内皮细胞诱导脐血单个核细胞向树突状细胞的分化

目的探讨人脐静脉内皮细胞对人脐血单个核细胞(UBMCs)向树突状细胞(DC)分化的影响,建立更便捷、更经济体外培养DC的方法。方法胶原酶消化分离出脐静脉内皮细胞(HUVEC),经鉴定和体外培养扩增后,使其平铺生长于Tran-swell板上室底部,将UBMCs接种到Transwell小室内,同时加入EC9706细胞冻融形成的蛋白质抗原,与HUVEC共培养,使UBMCs与HUVEC紧密接触并从Transwell板上室迁移到下室,收集Transwell板下室细胞,流式细胞术检测下室细胞DC相关表面标志CD80、CD40、CD83、CD1a和MHC分子;通过MTT法检测肿瘤负载的UBDC诱导CTL对靶细胞的特异性杀伤作用。结果经HUVEC诱导并负载了肿瘤细胞抗原的DC CD80、CD40、CD83、CD1a和MHC-Ⅱ类分子表达增加,产生的细胞毒性T细胞(CTL)可特异性杀伤食管癌细胞EC9706;与细胞因子诱导DC活化的CTL对EC9706的杀伤率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用Transwell小室以人原代脐静脉内皮细胞诱导脐血单个核细胞分化的DC是可行的一种实验方法。     

RNA转染树突状细胞诱导特异性抗前列腺癌免疫反应的实验研究

目的 研究前列腺癌细胞RNA转染树突状细胞(DCs)诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对前列腺癌细胞的特异性杀伤作用.方法 联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4 (IL-4) 诱导培养小鼠骨髓单个核细胞向DCs分化,脂质体法转染RNA,流式细胞术测定转染后树突状细胞共刺激分子表达的变化,MTT法测定DCs对T淋巴细胞的刺激能力.ELISA法检测IFN-γ的分泌水平.LDH法测定DCs诱导的CTL对前列腺癌细胞的杀伤效果.结果 用GM-CSF和IL-4诱导培养小鼠骨髓来源的单核细胞,体外诱导培养6 d后获得大量DCs;RNA转染后,DCs表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子表达提高(P<0.05),刺激T淋巴细胞增殖能力明显提高(P<0.01);前列腺癌RNA转染的DCs诱导CTL对前列腺癌细胞和肝癌细胞的杀伤作用有明显差异(P<0.01).结论 前列腺癌细胞RNA转染DCs后诱导的CTL对前列腺癌有特异性杀伤作用,为进一步抗肿瘤疫苗的实验研究奠定了基础.     

mRNA疫苗冲击树突状细胞诱导抗肿瘤免疫反应的研究

目的：以消化道肿瘤组织mRNA冲击自体DC，诱导特异性免疫应答。方法：20例消化道肿瘤患者外周血分离PBMC(外周血单核细胞)，在IL-4、GM-CSF联合作用下诱导DC，从消化道肿瘤组织中提取mRNA并分别在有脂质体或无脂质体介导下冲击DC，与未经纯化的T细胞混合培养，诱导CTL(细胞毒性T淋巴细胞)。以CTL作为效应细胞，以胃癌细胞系803为靶细胞，LDH释放实验检测杀伤活性。结果：细胞表面标记检测显示诱导前后CD3、CD4、CD14显著下降，CD40、CD86、CD1a、CD83、HLA-DR显著升高，表明IL-4、GM-CSF、联合作用下有效诱导出DC，混合淋巴细胞增殖实验表明该DC具有抗原递呈，刺激淋巴细胞增殖的功能。经脂质体介导的mRNA冲击DC诱导的特异性杀伤反应与未经脂质体介导的mRNA冲击DC诱导的特异性杀伤反应比较，其杀伤率经统计学分析无显著性差异。而二者与单纯经IL-2诱导的未经纯化的T细胞产生的非特异性杀伤比较均有显著性差异。结论：以肿瘤细胞mRNA冲击DC诱导CTL可有效杀伤肿瘤细胞，有可能成为一独特的免疫治疗方法。     

人外周血及脐血树突状细胞的体外诱导及抗肿瘤作用比较

目的:比较人外周血和脐血体外诱导扩增的树突状细胞在冻融抗原激活后的抗肿瘤作用.方法:分离正常人外周血或脐血单个核细胞,用重组粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素4(IL-4)将其分别诱导为外周血树突状细胞(PbDC)及脐血树突状细胞(CbDC),2者分别于诱导前、诱导第7 d及抗原刺激3 d后用流式细胞仪检测DC表面共刺激分子的改变;分别将PbDC、CbDC与外周血T细胞共孵育,以K562为靶细胞,采用MTT比色法检测T细胞抗肿瘤活性的差异.结果:PbDC于诱导第7 d、CbDC于诱导第5 d呈现典型的DC形态.外周血和脐血单个核细胞经GM-CSF、IL-4诱导培养后,CD86、CD11c、CD54、MHC-I类分子表达均增高,脐血单个核细胞MHC-Ⅱ类分子表达增高,与培养前相比差异有统计学意义(P＜0.01).负载抗原后,MHC-I和CD54表达进一步增高,与负载抗原前比较差异有统计学意义(P＜0.05).分别以PbDC或CbDC诱导活化的T细胞为效应细胞,均可使肿瘤细胞的生长受到抑制,并最终导致其死亡,杀伤率与未负载抗原的对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01).PbDC组及CbDC组对肿瘤细胞均有杀伤活性,2组对比差异无统计学意义(P＞0.05).结论:经肿瘤抗原激活的外周血及脐血DC具有相似的抗肿瘤活性.     

脂质体包裹RNA和裸RNA在肿瘤RNA疫苗中作用的比较

目的:比较有脂质体包裹的肿瘤RNA与无脂质体包裹的裸RNA转染未成熟树突状细胞(DC)后DC的成熟情况及其诱导的CTL对靶细胞的杀伤作用,以确定裸RNA能否有效转染DC.方法:从肺癌细胞系CALU-6中提取总RNA.采集肺癌患者PBMC富集血分离单个核细胞培养DC,第5天时将DC分成3组,A组用阳离子脂质体DMRIE-C与RNA共同转染DC,B组只用RNA转染DC,C组为DC对照组,继续培养5d后测定转染后3组DC的表面标志.转染后的A、B两组DC与自体淋巴细胞混合,诱导特异性CTL,LDH法测定诱导出的CTL的特异性杀伤活性.结果:与未进行转染的DC相比,A、B两组肿瘤细胞RNA转染DC后,CDla、CD83及CD86、HLA-ABC都出现大幅度上调表达,说明两种方法转染RNA都可诱导DC的成熟.上述DC与自体淋巴细胞混合培养均可诱导出CTL,LDH释放实验显示,在效靶比40:1、20:1及10:1时两组DC诱导的CTL对同种靶细胞的杀伤活性比较无统计学差异,提示脂质体包裹RNA和裸RNA转染DC均可诱导特异性抗肿瘤免疫反应.结论:不需脂质体包裹的裸RNA与用脂质体包裹的RNA转染未成熟DC都能实现肿瘤细胞RNA信息进入DC,并一过性表达相应抗原,诱导DC成熟.二者都具有在体外诱导出自体CTL的特异性杀伤靶细胞的能力.     

TLR9在非小细胞肺癌患者外周血单个核细胞抗肿瘤免疫中的调控作用

目的 研究TLR9激动剂--含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)对非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血单个核细胞(PBMC)抗肿瘤免疫的影响.方法 分离36例NSCLC患者PBMC和肺癌细胞,RT-PCR检测TLR9 mRNA表达.PBMC分别经空白培养、不含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列的寡脱氧核苷酸(non-CpG ODN)和CpG ODN共培养72 h.3H-TdR掺入法测定PBMC增殖变化.流式细胞仪检测T细胞表面CD69分子变化、T细胞亚群比例以及CD8+T胞内IFN-γ和IL-4的表达.ELISA法测定PBMC上清液IFN-α的浓度,并评价抑制性ODN和氯喹对IFN-α产生的影响.分别以自体肿瘤细胞和K562细胞为靶细胞(T),以PBMC为效应细胞(E)流式细胞仪检测不同E/T时PBMC的细胞毒活性.结果 NSCLC患者PBMC表达TLR9 mRNA,其表达强度(0.76±0.09)与健康者(0.77±0.09)差异无统计学意义(t=0.00,P=1.00).CpG ODN诱导肺癌患者PBMC增殖(P<0.01),上调CD3+T细胞表面CD69分子表达(P<0.01),增加CD4+T/CD8+T比值(P<0.01),增强CD8+T产生IFN-γ的能力(P<0.01).CpG ODN促进PBMC分泌IFN-α(P<0.01),抑制性ODN和氯喹抑制CpG ODN诱导产生的IFN-α.CpG ODN增强PBMC对K562和自体肿瘤细胞的细胞毒活性(均P<0.01).结论 TLR9参与调控NSCLC患者的抗肿瘤免疫,TLR9的激活效应主要包括促进PBMC活化、增殖并诱导产生IFN-α,增加PBMC中CD4+T的比例并促进CD8+T分泌IFN-γ,增强PBMC对肿瘤细胞的细胞毒活性.     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的 为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞.方法 以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1.传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能.结果 hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长.经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织.结论 SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能.     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

干细胞来源的胰岛素分泌细胞的研究进展

Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞被自身免疫系统攻击、破坏,不能正常释放胰岛素,导致血糖升高.患者需终生注射胰岛素,由于给药过程缺乏理想的血糖感应系统,常导致糖尿病大血管病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、神经病变及糖尿病足等慢性并发症的发生,是糖尿病死亡的主要原因[1].为了有效控制血糖,防止糖尿病并发症的发生,提高糖尿病患者的生存质量,目前主要采用两种治疗策略来改进胰岛素的治疗,一是胰岛素输入方式的改进:临床上广泛应用的胰岛素泵就是通过24 h不停地向患者体内输入微量胰岛素,模拟正常胰岛素分泌模式,控制血糖水平,减少并发症的发生.其次是寻找方法替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞,包括胰腺或胰岛移植、对非β细胞进行基因修饰以及对干细胞的诱导分化.70年代初,Lacy等成功地证明了移植胰岛细胞能够改善糖尿病大鼠的高血糖状态,胰岛细胞移植开始蓬勃开展起来.     

肝脏NK/NKT细胞及其生物学意义

对天然杀伤细胞（NK cell）的研究近年受到高度关注。研究发现，肝脏NK/NKT细胞含量在机体天然免疫反应时可增加10倍，可能是机体最大的专职天然免疫的器官，对抵御病理、寄生菌、恶性转化细胞等的侵害具有十分重要的意义。本文就肝脏NK/NKT细胞的功能特点和生物学特性、当前的研究进展及热点问题以及进一步研究的思路和切入点作一述评。     

牙周膜干细胞对脐血单个核细胞分化为破骨样细胞的影响

目的研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制。方法有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞。建立直接共培养和Transwell间接共培养体系。实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1 h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1×10-8mol/L)和前列腺素E2(1×10-6mol/L)。采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞(osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能。结果各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P<0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P<0.01)。结论牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显。     

Periodontal ligament stem cells improve peripheral blood mononuclear cells differentiation into osteoclast-like cells

目的 研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制.方法 有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞.建立直接共培养和Transwell间接共培养体系.实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1 ×10-8 mol/L)和前列腺素E2(1×10-6 mol/L).采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞( osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能.结果 各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P＜0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P＜0-01).结论 牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显.     

肝干细胞－卵圆细胞的研究进展

卵圆细胞是肝脏干细胞的代表细胞,主要存在于幼肝及成人受损的肝脏中,是一种双潜能的肝脏干细胞,多种因素调节其分化,在此过程中动态表达一系列表面标志物。卵圆细胞的分化异常与肝癌的发生关系密切。在体外大量扩增卵圆细胞并使之分化为成熟的 有功能的肝细胞,为终末期肝病、肝脏的组织工程研究及基因治疗开辟了新的途径。 