Expression of TAT-EGFP Fusion Protein and Verification of Its Transmem-brane Activity Into Bladder Cancer Cells and Tissues

目的 构建穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白(TAT-EGFP)融合蛋白的原核表达系统,研究该融合蛋白在体外对人膀胱癌细胞(EJ细胞)和膀胱癌组织的跨膜作用.方法 以pEGFP-1载体为模板,设计包含TAT序列的引物,用PCR技术扩增TAT-EGFP基因,扩增产物插入载体pET30a,构建成重组质粒pET30a-TAT-EGFP.将重组质粒转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,Ni-NTA Superflow Cartvidge亲和层析柱纯化融合蛋白.将融合蛋白TAT-EGFP加入培养的EJ细胞和膀胱癌组织,荧光显微镜观察TAT-EGFP融合蛋白进入EJ细胞和膀胱癌组织的情况.结果 成功构建了高表达pET30a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为31 kD的融合蛋白TAT-EGFP.不同浓度的TAT-EGFP融合蛋白对膀胱癌细胞均无明显毒性.TAT-EGFP融合蛋白具有穿过膀胱癌细胞和膀胱癌组织的作用.结论 通过对TAT-EGFP融合蛋白表达纯化及活性分析,证实TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础.     

TAT-EGFP融合蛋白的表达及在PC12细胞的转导活性

目的:构建pET28a-TAT-EGFP重组子,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的转导活性.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后再连接EGFP基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达,组氨酸亲和层析柱纯化.将融合蛋白加入培养的PC12细胞,观察荧光进入细胞的情况.结果:成功地构建了高表达pET28a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为29 ku的融合蛋白TAT-EGFP,并在体外培养的PC12细胞中证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力.结论:通过对TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础.     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

DMSO增强原核表达TAT-EGFP（Apoptin）穿膜效应的研究

目的：构建pET15b-TAT-EGFP和pET15b-TAT-Apoptin,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的定位及TAT-Apoptin的诱导Caski凋亡活性。方法：人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET15b后再连接EGFP和Apoptin基因,组成pET15b-TAT-EGFP（Apoptin）重组子。转化大肠杆菌,1mMIPTG诱导TAT-EGFP（Apoptin）融合蛋白表达,His亲和层析柱纯化。培养的Caski细胞经过10%DMSO处理1h后,加入融合蛋白孵育1h,观察TAT-EGFP进入细胞的情况。同时用TUNEL检测TAT-Apoptin诱导Caski凋亡的情况。结果：成功地构建了高表达pET15b-TAT-EGFP（Apoptin）重组子,纯化了分子质量约为30KD的融合蛋白TAT-EGFP和17KD的TAT-Apoptin融合蛋白,并在体外培养的Caski细胞经10%DMSO处理后证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力明显增强。结论：通过对TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了DMSO能够增强TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。     

TAT-NDPK-A蛋白的构建表达及穿膜初步研究

目的 构建pET-TAT-nm23-H1质粒,表达TAT-核苷二磷酸激酶A(TAT-nucleoside diphosphate kinase A,TAT-NDPK-A)融合蛋白,并研究融合蛋白穿膜进入A549细胞.方法 人工合成编码TAT蛋白转导区域的11个氨基酸序列于NDPK-A引物的上游,PCR扩增后将融合基因克隆到pET28(a)原核表达载体上,经IPTG诱导表达、镍离子树脂色谱纯化TAT-NDPK-A蛋白,Westen-blot鉴定分析重组蛋白的抗原性,将TAT-NDPK-A蛋白加入到A549细胞中,荧光免疫组化检测蛋白穿膜进入细胞内.结果 TAT序列与NDPK-A正确融合并插入pET28(a)载体上,经诱导表达纯化成功获得纯度为97%的TAT-NDPK-A蛋白,在培养的A549细胞中加入重组蛋白4 h后在细胞内检测到穿膜的蛋白.结论 构建表达TAT-NDPK-A蛋白,TAT序列能够引导重组蛋白穿过细胞膜进入细胞内,为进一步研究基因的功能奠定了基础.     

CPPs-BDI-1-载蟾酥白蛋白纳米微球三联体杀伤 EJ人膀胱癌细胞实验研究

目的：探讨CPPs-BDI-1-载蟾酥白蛋白纳米微球三联体杀伤 EJ人膀胱癌细胞的实验研究。方法采用异型双功能连接剂SPDP耦联穿膜肽增强型绿色荧光蛋白（ TAT-EGFP）、抗人膀胱癌单克隆抗体（BDI-1）、载蟾酥白蛋白纳米微球（Bufalin-NS）,构建载蟾酥白蛋白纳米微球三联体（CPPs-BDI-1-Bufa-lin-NS）。取CPPs-BDI-1-Bufalin-NS三联体实验组和蟾酥对照组,终浓度分别为1×10-8mol/L、1×10-6mol/L,通过MTT法检测培养12小时、24小时、36小时、48小时的EJ人膀胱癌细胞存活率,检测CPPs-BDI-1-Bufalin-NS三联体对EJ人膀胱癌细胞的抑制作用。结果 CPPs-BDI-1-Bufalin-NS三联体实验组杀伤人膀胱癌细胞作用明显强于蟾酥对照组。结论 CPPs-BDI-1-Bufalin-NS三联对人膀胱癌细胞有明显的杀伤效果,为后续动物实验奠定基础。     

GST-TAT-GFP融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 获得融合TAT短肽的融合蛋白GST—TAT-GFP，以用于阐明TAT短肽的跨膜递送机理。方法 以质粒pGEX—GFP为模板，扩增目的基因TAT—GFP，将其克隆至质粒pGEX-2T，用所构建的质粒pGEX—TAT—GFP转化大肠杆菌BL21并诱导表达，利用GS-4B亲和柱进行纯化，所得产物进行SDS-PAGE、Western blot及细胞跨膜实验鉴定。结果 大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约54．3kD的蛋白，其相对分子质量与GST—TAT-GFP融合蛋白相符；Western blot显示该融合蛋白能够被抗GFP的抗体特异性识别；细胞实验表明融合TAT短肽的融合蛋白能跨膜进入细胞L-02、SMMC-7721、Hela和BEL-7402。结论 在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GST—TAT—GFP融合蛋白。     

PEP-1介导的重组肝细胞核因子4α蛋白转导对肝癌细胞的抑制作用

目的 利用细胞穿膜肽PEP-1介导重组肝细胞核因子4α（HNF4α）蛋白进入肝癌细胞,并明确外源融合蛋白P-HNF4α对肝癌细胞的作用。方法 构建表达质粒pET28a-P-HNF4α,优化原核表达体系的诱导条件,经大量表达、亲和层析纯化以及浓缩、透析后获得纯度较高的带有细胞穿膜肽PEP-1的融合蛋白P-HNF4α;P-HNF4α转导人肝癌细胞,Western blot检测其穿膜效率,核浆分离和细胞免疫荧光检测P-HNF4α的亚细胞定位,Real-time PCR检测肝癌细胞基因表达,CCK-8法检测肝癌细胞的增殖,细胞划痕实验以及小室侵袭实验检测P-HNF4α对肝癌细胞转移能力的影响。结果 细胞穿膜肽PEP-1成功介导融合蛋白P-HNF4α进入Huh7细胞并定位于细胞核;P-HNF4α蛋白可促进Huh7细胞肝功能基因的表达,抑制干细胞相关基因的表达,并显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结论 P-HNF4α可诱导肝癌细胞向成熟肝细胞分化,降低肝癌细胞的恶性程度,提示利用P-HNF4α转导肝癌细胞是诱导分化治疗肝癌的潜在手段。     

细胞穿膜肽-抗人膀胱癌单克隆抗体-载丝裂霉素白蛋白纳米微球三联体的靶向性和穿膜活性研究

目的：探讨细胞穿膜肽（TAT-EGFP）一抗人膀胱癌单克隆抗体（BDI-1）一载丝裂霉素白蛋白纳米微球（MMC-NS）三联体的靶向性和穿膜活性。方法：采用异型双功能连接剂SPDP,偶联TAT-EGFP、BDI-1、MMC-NS形成三联体偶联物,进行EJ人膀胱癌靶向结合及穿膜试验,通过激光共聚焦、扫描电子显微镜及透射电子显微镜检测其靶向结合特异性和穿膜活性。结果：成功地应用异型双功能连接剂SPDP偶联TAT-EGFP、BDI-1、载MMC白蛋白纳米微球制成三联体。TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS偶联物能够成功进入细胞发挥细胞毒作用。首次发现TAT-EGFP内化MMC-NS入EJ人膀胱癌细胞内部后微绒毛消失的现象。结论：TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS三联体有可能应用于膀胱肿瘤的靶向治疗。     

反式激活蛋白转导结构域介导绿色荧光蛋白在小鼠体内的跨膜转运

目的探讨HIV-1反式激活蛋白（TAT）的蛋白转导结构域（PAD）介导绿色荧光蛋白（EGFP）在小鼠体内的跨膜转运作用。方法采用PCR及克隆技术构成表这载体pET28a—TAT—EGFP，在大肠杆菌中表达TAT—EGFP融合蛋白。将纯化后的融合蛋白注入小鼠尾静脉，取脑、心肌、肝、脾和肾等器官冰冻切片，荧光显微镜下观察融合蛋白在组织中的分布。结果表达和纯化了分子量为28KD的TAT—EGFP融合蛋白。在小鼠的肝、心肌、脑、肾和脾等组织切片荧光检测呈阳性。结论TAT可介导EGFP在广泛组织内的跨膜转导，这一研究为外源活性大分子物质进入组织细胞提供了一个新的途径。     

TAT-Apoptin融合蛋白分泌表达载体的构建及其活性检测

 目的构建具有自主跨膜能力的Apoptin融合蛋白表达载体,使其分泌表达,避开包涵体复性,简化制备工艺。方法人工合成TAT序列,与Apoptin序列融合,连接到pET22b+载体上,构建原核分泌表达载体pET22b+-TAT-Apoptin,IPTG诱导目的蛋白分泌表达到大肠杆菌周质空间,提取蛋白行SDS-PAGE分析,MTT法检测分泌表达的融合蛋白对胃癌823细胞的抑制作用。结果重组TAT-Apoptin蛋白可分泌至大肠杆菌周质空间中,以可溶状态存在,对胃癌823细胞的最大抑制率为83.95%。结论成功构建重组TAT-Apoptin蛋白表达载体,分泌表达的可溶性融合蛋白具有生物活性。     

鹦鹉热嗜衣原体CPSIT_0018融合蛋白原核表达载体的构建、表达及其在Hela细胞中的定位

目的构建鹦鹉热嗜衣原体（Cps）CPSIT_0018原核表达载体,表达并纯化该融合蛋白,观察其在感染的Hela细胞中的定位。方法采用PCR技术从Cps 6BC基因组中扩增CPSIT_0018基因,并构建pET30a-CPSIT_0018原核表达载体,然后转化到宿主菌E.coli BL21中,IPTG诱导His-CPSIT_0018融合蛋白表达,进一步用该融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,间接免疫荧光法分析His-CPSIT_0018蛋白在Hela细胞中的分布特征。结果成功构建了pET30a-CPSIT_0018原核表达载体,并表达和纯化较稳定的重组蛋白;在Cps感染的Hela细胞中CPSIT_0018的分布与主要外膜蛋白MOMP相似,而与包涵体膜蛋白IncA的分布模式不同。结论成功克隆表达了His-CPSIT_0018,该蛋白定位在Cps包涵体内。     

TAT-SOD融合蛋白表达载体的构建

目的:构建pET28a-TAT-SOD原核表达载体,纯化并测定其活性。方法:PCR法扩增TAT-SOD片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT-SOD重组表达子,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导TAT-SOD融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE电泳鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白,利用SOD活性测定试剂盒测定其活性。结果:构建了高表达重组子pET28a-TAT-SOD,获得了相对分子质量约为25000的具有活性的融合蛋白TAT-SOD,纯度达90%。纯化的蛋白浓度为700mg/L,活性为197.54U/L。结论:成功构建了具有活性TAT-SOD融合蛋白的表达载体。     

重组免疫毒素hlL-2-Luffin P1的构建及表达

目的构建人分泌型IL-2与免疫毒素Luffin P1的重组基因原核表达载体,并对其产物进行鉴定及纯化.方法采用基因工程原理,将IL-2-Luffin P1的重组基因片段克隆入表达载体pET20b( )中,经酶切及DNA序列测定鉴定正确,转化表达宿主菌Origami(DE3)pLysS中,经IPTG诱导表达含His标签的融合蛋白-重组免疫毒素hlL-2-Luffin P1.结果成功构建了免疫毒素表达载体pET20b( )-hIL-2-Luffin P1,获得纯化的重组免疫毒素,并经Western blot鉴定正确.结论hIL-2-Luffin P1的成功构建,为进一步研究它在抗移植排斥中的作用奠定了基础.     

间日疟原虫MSP1-19基因的克隆与表达

目的:构建间日疟原虫MSP1-19(Plasmodium vivax merozoite surface protein-1-19,Pv MSP1-19)基因克隆及表达的载体.方法:将MSP1-19基因克隆入原核表达载体pET28a中,构建重组表达载体.以重组载体转化大肠埃希菌BL21,在IPTG诱导下表达重组Pv M...     

融合蛋白ScFv（3G11）-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a（＋）-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a（＋）质粒,构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5ɑ中,利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达融合蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a（＋）-ScFv-mms13构建成功。 SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达,且确定了在IPTG终浓度为0．2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。 Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合,提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a（＋）-ScFv-mms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。     

PCR产物靶向克隆法构建pET15b-CAT及His-tag-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的:将人过氧化氢酶(Catalase,CAT)cDNA的PCR扩增产物定向克隆到pET15b载体上以构建重组质粒pET15b-CAT,并表达和纯化出His-tag-CAT融合蛋白。方法:扩增目的基因的PCR引物的5′端加上与线性化载体同源的碱基序列,以使PCR的扩增产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列。以pZeoSV2(+)-CAT为模板进行靶向克隆所需的人CAT cDNA扩增。将纯化的人CAT cDNAPCR产物与经XhoⅠ和BamH Ⅰ酶切的线性化载体pET15b以6∶1摩尔数之比混合于含重组酶的反应液中,25℃反应30min,将PCR产物定向克隆于目标载体pET15b上,获得重组质粒pET15b-CAT。重组质粒经PCR,XhoⅠ酶切和DNA测序鉴定。pET15b-CAT转化BL21(DE3)宿主菌,用IPTG诱导表达出His-tag-CAT融合蛋白,采用Ni2+-NTA树脂进行亲和层析。结果:人CAT cDNA的PCR扩增产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b发生了同源重组反应,经鉴定采用PCR产物靶向克隆法成功构建了pET15b-CAT。SDS-PAGE和Western blot结果表明,转化了pET15b-CAT的宿主菌表达出了His-tag-CAT融和蛋白,经Ni2+-NTA树脂亲和层析得到了纯化的His-tag-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶的活性,活性值为80.23U/g。结论:采用PCR产物靶向克隆法成功地构建了pET15b-CAT,并表达和纯化出了His-tag-CAT融和蛋白,为采用外源性CAT防治与氧化应激损伤相关性疾病奠定了基础。     

PMAP-23-LK-CBM3融合蛋白的原核表达、纯化与鉴定

目的构建抗菌肽-23与3型碳水化合物结合分子（CBM3）融合蛋白的原核表达载体并进行诱导表达、纯化和鉴定。方法PCR扩增PMAP-23-LK-CBM3融合蛋白,产物经酶切、纯化、回收后与经同样双酶切并回收后的pET21a原核表达载体相连接,连接产物转化感受态DH5α菌,经菌落PCR筛选出阳性菌落并提取质粒进行初步酶切鉴定后进一步行双向测序鉴定,插入序列完全正确者命名为pET21a-PMAP-23-LK-CBM3重组载体,并将其转化感受态大肠埃希菌BL21（DE3）,加入IPTG诱导PMAP-23-LK-CBM3融合蛋白表达后提取菌体蛋白行亲和层析纯化,并对纯化产物进行SDS-PAGE鉴定和Western Blot鉴定。结果成功构建了pET21a-PMAP-23-LK-CBM3融合重组质粒,成功诱导、纯化并鉴定出PMAP-23-LK-CBM3融合蛋白,分子量与理论值相符。结论成功表达并纯化、鉴定出了PMAP-23-LK-CBM3融合蛋白,为进一步将其应用于抗菌机制和药理实验的研究奠定了基础。