人类睾丸生精细胞凋亡相关基因TSARG3的克隆

目的：克隆人类睾丸生精细胞凋亡相关基因TSARG3。方法：从已获得的小鼠稳睾和正常睾丸对照中表达量有明显差异的表达序列标签片段（BE644537）入手，构建人同源表达序列标签重叠群，应用基因特异性引物和载体特异性引物，在睾丸cDNA文库的DN或进行巢式PCR扩增、测序，对测序结果进行生物信息学分析。结果：从睾丸cDNA文库中分离出人类睾丸凋亡相关基因的5’末端而获得全长cDNA,命名为TSARG3，GenBank登录号为AF419291（保密期为1年），同时应用相同方法克隆了该基因在小鼠中的同源基因，GenBank登录号为AF419292。结论：获得人类睾丸生精细胞凋亡相关基因TSARG3，该基因可能与人类睾丸生精细胞凋亡有关。     

轮状病毒1,2血清型VP7蛋白基因的扩增及其克隆

用聚合酶链反应扩增了轮状病毒Ｗａ株（第１血清型）和ＤＳ－１株（第２血清型）的全长ＶＰ７蛋白基因，利用两引物５＇末端的多接头位点，以ｐＵＣ１８质粒为载体构建了含两株ＲＶＶＰ７基因ｃＤＮＡ拷贝的重组体。经ＰＣＲ扩增制备得１～４血清型ＲＶＶＰ７基因高变区（５１－３９２核苷酸）￣（３２）Ｐ标记核酸探针，对重组质粒型别进行了Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和斑点杂交鉴定，结果Ｗａ株ＶＰ７基因重组体只与１型探针呈强杂交信号，ＤＳ－１株重组体只与２型探针呈强杂交信号。     

一个新的小鼠腭裂候选基因cDNA序列的克隆

目的 克隆并筛选与小鼠腭裂发生相关候选新基因。方法 利用聚合酶链反应改良扣除杂交技术，克隆正常组与腭裂组小鼠腭突组织中差异表达的基因，经反向点杂交鉴定后挑选阳性克隆并测序及同源性分析，Northern印迹杂交检测所获的新基因mRNA的全长。结果 经大规模测序后得4个新的表达序列标签，其中1个片段全长为809bp，Northern印迹杂交结果显示为该基因的eDNA全长。结论 获得一个新的与小鼠腭裂发生相关的候选基因的cDNA全长。     

程序死亡蛋白1基因的克隆及原核表达

目的 克隆人程序死亡蛋白(PD-1)基因并构建PD-1蛋白的原核表达质粒,在大肠埃希菌中进行表达.方法 用RT-PCR的方法从慢性乙肝患者外周血淋巴细胞总RNA中逆转录得到PD-1基因的cDNA,构建PD-1基因的原核表达质粒,在大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达并纯化.用SDS-PAGE、DNA测序、氨基酸测序等方法对表达蛋白进行鉴定.结果 克隆到PD-1基因编码区全长序列cDNA,经DNA测序与已报道的序列同源性达99.8%.构建得到PD-1的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达,纯化获得纯度较高的PD-1蛋白.氨基酸测序证明表达蛋白的正确性.结论 成功克隆人PD-1基因,在大肠埃希菌中获得表达,得到纯化的PD-1蛋白,为进一步研究PD-1蛋白的功能及应用打下基础.     

普氏立克次体14kD蛋白基因的扩增与克隆

根据普氏立克次体弱毒株－Ｅ株１４ｋＤ表面蛋白基因的ＤＮＡ序列设计合成了一对寡核苷酸引物，二引物的５＇端分别加上了限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点。采用此引物对成功地扩增了普氏立克次体强毒株－－Ｂｒｅｉｎｌ株（国际标准株）的１４ｋＤ表面蛋白基因，基因的分子大小为０．７２ｋｂ。扩增获得的基因ＤＮＡ经限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏＲＩ酶切后与经相同酶切的质粒载体ｐＵＣ１９连接，转化受体大肠杆菌工程菌ＪＭ１０３，经酶切和ＤＮＡ斑点杂交鉴定，成功地克隆了扩增的普氏立克次体强毒株（Ｂｒｅｉｎｌ株）的１４ｋＤ表面蛋白基因。     

56609株钩体lipL32基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的初步表达

钩体病是一种临床表现多样的人兽共患疾病 ,致病性钩端螺旋体 (钩体 )根据交叉凝集反应被分为2 5个血清群和大约 2 5 0个血清型。如此多血清型的钩体所引起的临床症状和体征复杂多样 ,经常造成误诊而延误治疗。因此 ,建立一种简单、快捷、敏感、特异的诊断方法很有必要。钩体的诊断或依赖于检测血清中的抗体或检测组织或体液中的病原体。由于分离钩体不但困难而且费时 ,所以血清学的诊断是一种应用最广泛的方法。与经典的MAT等方法相比 ,ELISA方法具有简单、快捷、敏感、特异等优点 ,但是检测用抗原的选择是决定该方法特异性和敏感性的…     

中国上海丁型肝炎病毒部分基因的克隆与序列分析

从我国上海无症状乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）携带者混合血清中提取ＲＮＡ，通过逆转录聚合酶链反应获得丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）的长约３７０个碱基对的ｃＤＮＡ片段，将其克隆测序并与已知的ＨＤＶ各基因型代表株序列比较，结果表明，它与意大利株的同源性较高（９８．１％），与台湾株（Ｉａ型）及美国－１（Ｉｂ型）的同源性相近（９１．０％，９２．０％），与日本－１株（Ⅱ型）及秘鲁株（Ⅲ型）的同源性为７９．３％（     

核糖体蛋白基因及其与人类疾病的研究进展

核糖体(ribosome)作为细胞内负责蛋白质合成的重要细胞器一直为人们所熟知。它由4条rRNA和80种核糖体蛋白(ribosomal protein,RP)构成。长期以来,对核糖体功能的认识仅仅停留在蛋白质合成上。近年来,随着技术手段的进步,研究的不断深入,RP的生理功能以及在人类疾病发生和发展中的作用得以揭示,RP研究逐渐成为热点。     

猪戊肝病毒的克隆和部分序列分析

目的：调查戊型肝炎病毒（HEV）对猪的感染情况。方法：用HEV抗体试剂盒检测猪血清中的抗体；用逆转录聚合酶链方法（RT－PCR）检测猪血清中的HEV RNA，对PCR阳性产物进行克隆测序，并对序列进行分析。结果：10份猪血清中有1份为HEV抗体阳性，2份为HEV RNA阳性，其中1份为抗体和RNA均阳性。序列分析显示，从猪中克隆的2株序列（G6和G8）之间在ORF1（102－387bp）和ORF2（6007－6354bp)区域的核苷酸序列的同源性分别为94％和93％，该2株序列在ORF1区在HEVⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ型的同源性分别为76％－79％、80％、79％－80％、88％－90％、75％－76％、79％、78％－79％和75％－78％；在ORF2区与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型的同源性为75％－77％、74％－77％、77％－78％和84％－99％，与ⅣA亚型的同源性为93％－97％。结论：猪感染的HEV的基因序列与人群中散发性戊型肝炎病毒的ⅣA亚型同源性最高。     

同源基因定量PCR方法快速产前诊断Down综合征

目的　探讨同源基因定量PCR方法在预防Down综合征患儿出生及无创性产前诊断中的应用价值。方法　对178名正常对照和38例Down综合征患者同时扩增位于2 1号染色体Down综合征致病关键区域的人肝型磷酸果糖激酶基因(PFKL- CH2 1)和位于1号染色体的人肌型磷酸果糖激酶基因(PFKM- CH1) ,计算机软件(Fluor Chem V2 .0 Stand- Alone)分析PFKM- CH1及PFKL- CH2 1产物的相对比。结果　正常人比值为1.4 0±0 .36 7,Down综合征患者比值为0 .4 6±0 .2 1,经t检验差异有统计学意义。结论　这种定量PCR方法不但能检测2 1三体型,也可检测易位型Down综合征。     

Genomic cloning and partial characterization of human chymotrypsinogen gene

Summary Chymotrypsinogen is a principal precursor of pancreatic proteolytic enzymes. We previously isolated a cDNA clone for human prechymotrypsinogen from a human pancreatic cDNA library. In the present study, we used this cDNA sequences to isolate genomic DNA clones. Three overlapping cosmid clones spanning approximately 65-kb genomic sequences were isolated from a human cosmid library. The genomic DNA clones were characterized by restriction enzyme mapping and by hybridizing them to subfragments of the cDNA. The sequence tagged sites for human chymotrypsinogen gene were created by designing two oligonucleotides. Furthermore, the isolated genomic clones were confirmed to be localized on chromosome 16q23 by fluorescencein situ hybridization and G-banding analysis.     

人肺癌相关抗原基因ALT04ag的分子克隆及其转化活性的初步研究

本文旨在克隆人肺癌相关抗原基因ALT04ag cDNA全长序列并对其生物信息学特性及转化活性进行初步探讨。采用5'RACE实验程序克隆靶基因全长cDNA，借助生物信息学分析方法对其序列进行初步分析，以细胞生长曲线、FCM分析及RT-PCR技术分别观察重组。ALT04ag表达质粒转染细胞的生长特性及相关基因的表达。结果表明ALT04ag cDNA序列全长1115bp，含有编码194个氨基酸的开放阅读框架，计算预测其分子量为21KD，等电点为5．51。该序列登录Genbank(AF026816)时未发现同源序列(2001-1-30)。该基因转染的细胞有ALT04ag基因表达，ALT04ag基因表达可上调c-myc基因表达及加速细胞增殖速率，但对bcl-2及p53基因表达无影响，提示ALT04ag基因表达可能是细胞癌变的重要因素之一。本研究为探索人肺癌诊断及治疗的分子靶标提供了新的线索。     

人类胚胎干细胞特异表达新基因HPESCRG1的克隆和特性分析

目的克隆一个人类胚胎干细胞特异表达的新基因并对其特性进行分析。方法从一个在人类胚胎干细胞(embryonicstem,ES)中特异表达的表达序列标签CF948547出发,应用生物信息学方法和分子生物学技术克隆一个新基因,采用逆转录-聚合酶链反应分析新基因的表达谱,并应用增强型绿色荧光蛋白真核表达系统分析新基因的亚细胞定位。结果成功克隆了一个新基因HPESCRG1,GenBank登录号为AY283672。该基因cDNA长1395bp,包含9个外显子和8个内含子,开放阅读框为250～1146bp,定位在3q13.13,预测编码297个氨基酸,预计分子量为33784,等电点为9.35。其编码蛋白有一个SAP功能域,该蛋白定位在细胞核内。该基因仅在人类ES细胞中表达,而在其分化细胞不表达,在人胚胎成纤维细胞、人间充质干细胞、成人和流产胚胎的多种正常组织中不表达。结论HPESCRG1基因是一个人类ES细胞中表达特异性新基因,很可能与人类ES细胞的自我更新和维持其未分化状态密切相关。     

人神经营养因子3基因的分子克隆、表达及其产物的生物活性鉴定

以正常中国人血淋巴细胞染色体DNA为模板,PCR扩增出神经营养因子3（NT3）编码基因。将所得基因片段重组于M13噬菌体载体,筛选得到含中国人NT3基因的克隆。采用单链末端终止法测出其全部的核苷酸序列,该序列与国外文献所报道的完全一臻。将NT3编码基因亚克隆于杆状病毒表达载体,以在大肠杆菌内转座后的重组Bacmid大分子DNA转染悬浮培养的昆虫细胞后,在培养上清中检测到大量成熟型的NT3,后者对人神经母细胞瘤SH－SY5Y－T3具有较强的促进神经突起生长的作用,其生物学效应可被抗人NT3多克隆抗体所阻断。     

人白细胞硫氧还蛋白还原酶的分子克隆和序列分析

目的：克隆人白细胞硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase,TR)编码区的cDNA并进行序列分析。方法：采用RT－PCR方法获得TR基因cDNA，选择阳性克隆并测序。结果：通过分子克隆和序列分析，发现TR基因长1554bp,ORF为1494bp，编码498个氨基酸，结论：确定了中国人白细胞TR的cDNA序列，并据此推导出相应的氨基酸序列。     

人芳香二烷基磷酸酯酶基因丛基因多态性快速分析法

目的建立一种人芳香二烷基磷酸酯酶（PON）基因丛等位基因快速分型法。方法在Multiplex-PCR-RELP基础上，通过引物设计错配，在一体系中同时扩增分别含PON1-192、PON1-55和PON2-31l位密码子的DNA片段，当等位基因为PON1-192R／PON1-55L／PON2-31lS时，PCR扩增产物中均被引入唯一的限制性内切酶HinfⅠ的识别位点G^＋ANTC。PCR扩增产物经酶消化，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，相互分开的不同组合的片段，确认为不同的基因型组合，同时对3个位点进行基因分型。结果在检测的80例健康个体中，等位基因频率为PON1-192：Q46．9％．R53．1％：PON1-55：L95．6％，M4．4％；PON2-31l：S78．8％，C21．2％。结论此方法快速分析3个位点的基因多态性，省时省力、节约经费，便于3个位点之间的连锁分析，具有推广价值。     

一种简便快速构建基因突变体的有效方法

目的 介绍一种简便、快速、准确构建定点诱导突变体的新技术。方法 设计3条引物，一条突变引物，另外两条引物位于突变引物的两侧，并带上合适的酶切位点，以供突变片段构建完成以后可以克隆进入合适载体。然后以突变引物与其附近的反向引物一起扩增带突变位点的片段，再以此PCR产物片段为引物与剩下的另一条引物一起扩增，扩增出的片段带有合适的酶切位点可以克隆进入合适载体。结果 用该方法成功地在Parkin基因的7196bp处C→T和913bp处C→T构建成两种突变。结论 该方法简便、快速、准确，确保100％的突变率，可在任何基因上构建所需的点突变，且不需要购买任何试剂盒。     

Improved detection of loss of heterozygosity at retinoblastoma gene locus in human breast carcinoma

Loss of heterozygosity (LOH) at the retinoblastoma (Rb) gene locus was investigated in 33 breast carcinomas by polymerase chain reaction single-strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) analysis after tumor cell enrichment by cell sorting. The efficacy of cell sorting was evaluated by comparing the results of PCR-SSCP with and without cell sorting. Ten of 17 (59%) informative cases showed LOH at this locus by cell sorting combined with PCR-SSCP, although LOH was detectable in six (35%) cases without cell sorting. Flow cytometry and histologic examination revealed that this underestimation may occur when the tumor cell population is less than 50% in the specimens analyzed. It is concluded that LOH of the Rb gene occurs more frequently in human breast carcinoma than previously thought, and thus may contribute significantly to the development and/or progression of this tumor.