呼吸道合胞病毒单克隆抗体用于纸上桥联酶标诊断的初步探讨

为了呼吸道合胞病毒(RSV)能够在基层及时帮助诊断和控制其流行,作者旨在更加简化RSV的快速诊断,将RSV-McAb移在微孔滤膜上以搭桥法和RSV抗原结合,由碱性磷酸酶催化底物,在膜上显色。作者将RSV-McAb用于RSV培养物的检测,并作了异种动物血清封闭试验以及vero细胞等阴性对照,证实RSV-Mc-Ab用于纸上桥联是特异性显色,对23例患儿鼻咽部脱落细胞同时作纸上桥联,免疫荧光及APAAP 3种RSV的快速诊断的比较,获得初步满意结果。     

抗合胞病毒单克隆抗体用于IFAT供临床快速诊断的研究

本文以8株合胞病毒单克隆抗体(RSV-McAb)和北京地区近三年RSV地方株结合,选其中7株敏感性、特异性高的McAb进行混合,以RSV多价动物抗血清以下简写RSV-PolyAb)和双份血清学作为对照,用免疫间接萤光染色法(IFAT)检测69例患儿鼻咽部脱落细胞内的RSV-Ag。证实了McAb对RSV快速诊断敏感性高,特异性强,具有极大实际应用价值。它可以完全作为一种RSV快速诊断的新试剂来代替PolyAb。     

单克隆抗体免疫酶检测法早期快速诊断合胞病毒感染

本文报道以辣根过氧化物酶自行标记抗合胞病毒单克隆抗体(RSV-McAb)结合物,建立了免疫酶直接法;同时以单抗鼠酶结合物建立了间接法,检测患儿呼吸道分泌物上皮细胞中的合胞病毒抗原。以间接法测定RSV-McAb效价分别为1:100及1:1000,PBS及正常鼠血清对照均为阴性,而RSV参考Long株抗原片阳性。共检测35例临床标本,结果仅婴幼儿呼吸道     

抗合胞病毒单克隆抗体用于(IFA)临床快速诊断的研究

本文以8株合胞病毒单克隆抗体(以下简写RSV-McAb)和北京地区近三年RSV地方株结合,选其中7株敏感性、特异性高的McAb进行混合,以RSV多价动物血清(以下简写RSV-Poly Ab)和双份血清学作对照,用免疫间接萤光法(IFA)检测100例患儿鼻咽部脱落细胞内的RSV-Ag。证实了McAb对RSV快速诊断敏感性高,特异性强,具有极大实际应用价值。它可以完全作为一种RSV快速诊断新试剂来代替Poly Ab。     

APAAP桥联酶标McAb用于RSV Hep-2细胞培养基质片产生假阳性反应的实验

呼吸道融合病毒(RSV)-McAb用于患者鼻咽部脱落细胞APAAP桥联酶标快速诊断,经300例临床对照应用,证实其特异性与敏感性均优良,且不需要昂贵的荧光显微镜等设备。但是,作者在作RSV基质片阳性对照时,出现只加二抗或者三抗也可产生阳性的非特异反应,为慎重起见我们作了系列实验,证实APAAP假阳性只产生在RSV的Hep-2病毒培养细胞内,此反应不发生在患者鼻咽部脱落细胞内的RSV-Ag中,兹将实验方法报告如下。 1.3张RSV基质片:A片按APAAP全过程操作。B片:不滴加一抗(即RSV-McAb),其它同APAAP法。C片:不滴加一抗及二抗(即兔抗鼠IgG)直接在基质片上加三抗后,即加底物显色。     

应用离子交换层析法纯化抗RSV-McAb的实验报告

由于常规方法制备的McAb,因其制备过程中常混有大量的杂蛋白,因而在一定程度上影响了McAb的应用。如何获得高纯度的单克隆抗体仍然是研究的重点课题之一。根据应用目的和实验要求不同,已有多种单克隆抗体的纯化方法。本文从本实验室现有条件出发,应用离子交换层析法对本室自制的小鼠抗RSV-McAb进行了初步纯化。     

应用离子交换层析法纯化抗RSV-McAb的实验报告

由于常规方法制备的McAb，因其制备过程中常混有大量的杂蛋白，因而在一定程度上影响了McAb的应用。如何获得高纯度的单克隆抗体仍然是研究的重点课题之一。根据应用目的和实验要求不同，已有多种单克隆抗体的纯化方法。本文从本实验室现有条件出发，应用离子交换层析法对本室自制的小鼠抗RSV-McAb进行了初步纯化。     

重组嵌合表达G蛋白中和表位的流感病毒载体RSV疫苗构建和免疫保护效果

目的构建和拯救重组嵌合表达G蛋白表位的流感病毒载体RSV疫苗株,并通过动物实验评价其免疫原性及免疫保护性。方法利用流感病毒反向遗传学技术,以流感病毒为载体,将RSV保护性抗原G蛋白表位的基因插入到流感病毒非结构蛋白NS1基因,拯救重组嵌合表达G蛋白中和表位的流感病毒载体RSV疫苗株rFLU/RSV/G,进而对rFLU/RSV/G的特性进行全面鉴定。rFLU/RSV/G滴鼻免疫Balb/c小鼠,通过检测中和抗体效价、血清抗体(IgG、IgG1、IgG2a)和黏膜抗体sIgA效价以及细胞因子(IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ和TNF-α)的分泌量来评价机体产生的体液、细胞和黏膜免疫反应。攻毒实验评价rFLU/RSV/G的免疫保护性,观测小鼠的体质量变化、病毒载量、存活情况以及肺病理变化。结果成功拯救出重组嵌合表达G蛋白表位的流感病毒载体RSV疫苗株rFLU/RSV/G。重组病毒rFLU/RSV/G与流感病毒颗粒形态和大小分布相符,并且表达针对RSV的特异性蛋白NS1-G。动物实验表明rFLU/RSV/G诱导小鼠机体产生较高的中和抗体、RSV特异性的Th1型细胞免疫反应以及黏膜免疫反应。攻毒实验显示rFLU/RSV/G对RSV A2株和PR8流感病毒野毒株具有一定免疫保护效果,能够有效降低肺鼻的病毒载量,肺组织病变情况明显减轻,且无小鼠死亡。结论重组嵌合表达G蛋白表位的流感病毒载体RSV疫苗株rFLU/RSV/G是一个有前景的RSV候选疫苗株,具有较高的免疫原性和免疫保护性,值得在棉鼠和猴子进行进一步研究。     

小发卡RNA抗呼吸道合胞病毒效应的研究

目的 为从基因水平抑制呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）的复制，针对RSV的M2-2基因构建小发卡结构状RNA（short hairpin RNA，shRNA）重组质粒，在细胞水平观察shRNA对RSV复制的影响。方法 将成功构建的针对RSV M2-2基因的重组质粒pshRNA8260转染HEp-2细胞，利用光镜观察pshRNA8260对RSV致HEp-2细胞病变效应（cytopathogenic effect，CPE）的影响并计算CPE抑制率，空斑形成实验检测RSV滴度变化。结果 成功构建了针对人RSV M2-2基因mRNA的pshRNA8260重组质粒，研究发现pshRNA8260能明显改善RSV所致的病变效应，降低RSV在细胞内复制的病毒滴度。结论 针对RSV M2-2基因的pshRNA82（g）重组质粒具有明显的特异性抗RSV效应的作用。     

脂多糖对呼吸道合胞病毒感染小鼠气道炎症及气道高反应性的影响及其机制研究

目的探讨脂多糖(LPS)对呼吸道合胞病毒(RSV)感染小鼠的气道炎症及气道高反应性的影响及其机制。方法将6~8周龄雌性Balb/c小鼠分为4组:对照组、LPS组、RSV组及RSV+LPS组,于首次处理后第7天收取肺组织、肺泡灌洗液标本,QPCR检测肺组织病毒拷贝数,计数肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数及分类计数,HE染色观察肺部病理损伤,肺功能测定AHR,Western blot检测TRIF和MyD88蛋白表达,ELISA检测BALF中IFN-γ、KC、IL-1β、IL-6质量浓度。结果 RSV+LPS组病毒拷贝数与RSV组基本一致。RSV+LPS组BALF中细胞总数较LPS组、RSV组增加,且RSV组以淋巴细胞为主,RSV+LPS组以中性粒细胞为主。LPS组、RSV组、RSV+LPS组肺组织炎症及评分均较对照组明显增高。RSV+LPS组AHR较RSV组、LPS组增高。RSV+LPS组肺组织中TRIF表达较LPS组、RSV组增高,各组MyD88基本无变化。RSV组BALF中IFN-γ明显增高,RSV+LPS组KC明显增高,IL-1β、IL-6各组基本无变化。结论 LPS刺激可通过TRIF-KC途径加重RSV感染小鼠气道炎症及AHR。     

分泌抗合胞病毒(RSV)单克隆抗体的杂交瘤细胞系的建立(简讯)

呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿急性下呼吸道感染的最重要病原体之一。抗RSV单克隆抗体的杂交瘤细胞系的建立,将会对RSV的临床诊治,流行病学调查以及抗原超微结构分析等产生重要意义。 本文应用RSV国际标准Long株感染Hela细胞,经冻融和离心纯化作为抗原,将BALB/c小鼠麻醉后从鼻孔内注入抗原,作基础免疫,细胞融合前三天采取脾脏直接注入抗原的方法,进行免疫,取其脾细胞与Sp2/0瘤细胞在50％PEG(MW1000)作用下,进行细胞杂交,应用免疫荧光法筛选抗RSV阳性孔,其细胞融合率为85.4％,阳性孔数为46/501(9.2％)。[注:有8孔和细胞对照有交叉反应,不计算在内,丢弃。]46个抗RSV阳性孔均进行了扩     

呼吸道合胞病毒感染中性粒细胞Toll样受体-4表达及其功能

目的:观察呼吸道合胞病毒(RSV)感染中性粒细胞Toll样受体- 4(TLR4)的表达及对炎症介质产生的影响, 探讨地塞米松(DEX)干预对RSV感染后中性粒细胞TLR4表达及炎症介质的作用.方法:RSV感染中性粒细胞, 流式细胞术(FCM)检测中性粒细胞TLR4表达及代表中性粒细胞呼吸爆发功能的过氧化氢(H2O2), ELISA检测中性粒细胞培养上清的IL-6和IL-8水平, 并观察阻断TLR4信号通路及DEX干预对RSV感染中性粒细胞功能的影响.结果:(1) RSV感染中性粒细胞TLR4表达增加;RSV感染中性粒细胞IL-6的产生增加, 阻断TLR4信号传导, RSV感染组IL-6产生减少 (阻断组IL-6:391.307±43.45 ng/L;RSV感染组IL-6:466.03±36.478 ng/L;对照组IL-6:21.205±15.059 ng/L);RSV感染中性粒细胞IL-8和H2O2的产生均明显增加, 阻断TLR4信号传导对IL-8和H2O2的产生没有影响.(2)DEX下调RSV感染后中性粒细胞TLR4表达, 减少RSV感染的中性粒细胞产生IL-6、 IL-8和H2O2的产生;阻断TLR4, 与DEX协同抑制RSV感染中性粒细胞IL-6的产生, 逆转DEX对RSV感染中性粒细胞H2O2产生的抑制作用.结论:TLR4信号通路在RSV感染后中性粒细胞炎症介质产生及呼吸爆发功能中起重要作用;阻断TLR4信号通路和DEX联合作用可能成为临床治疗的新靶点.     

急性呼吸道感染住院患儿RSV和ADV与病情严重程度相关性研究

目的 通过对呼吸道合胞病毒(RSV)及腺病毒(ADV)临床检测阳性率来评价儿童急性呼吸道感染病情严重程度的相关性分析.方法 将82例患急性呼吸道感染的儿童(感染组)及30例健康儿童(健康组)作为观察对象,比较两组RSV和ADV阳性率;同时根据感染严重程度,将感染组患儿分为28例的非肺炎组、33例的普通肺炎组及21例的重症肺炎组,对比三组间RSV和ADV阳性率.此外,对感染组患儿中RSV和ADV阳性率与感染严重程度、血常规白细胞计数(WBC)、中性粒细胞百分比(N％)及淋巴细胞百分比(L％)的相关性.结果 感染组RSV和ADV阳性率明显高于健康组(P ＜0.05),而不同严重程度感染组中,以重症肺炎组RSV和ADV阳性率最高(P＜0.05),同时感染组中,RSV和ADV阳性率与患者的感染严重程度存在显著的直线相关性,但与WBC、N％及L％无直线相关性.结论 RSV和ADV阳性率可作为评价急性呼吸道感染患儿病情严重程度的指标.     

白藜芦醇对新生大鼠神经元缺血缺氧时SDF-1/CXCR4通路抗凋亡作用的调控机制

目的:探究白藜芦醇(RSV)对缺血缺氧诱导的新生大鼠脑神经元凋亡及基质细胞衍生因子1(SDF-1)/CXC趋化因子受体4(CXCR4)通路的作用和机制。方法:体外培养新生大鼠皮质神经元,给予氧糖剥夺(OGD)模拟新生儿缺血缺氧性脑病(HIE)模型。首先将细胞随机分成4组:对照(control)组、HIE组、HIE+RSV低剂量(10μmol/L)组和HIE+RSV高剂量(50μmol/L)组。OGD处理2 h后加入相应剂量的RSV继续培养24 h,通过流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白及SDF-1和CXCR4的蛋白表达水平,real-time PCR检测SDF-1和CXCR4的mRNA表达水平。然后使用CXCR4抑制剂AMD3100与RSV共同处理OGO损伤的细胞24h,检测SDF-1/CXCR4通路阻断后RSV对细胞凋亡和凋亡相关蛋白表达水平的影响。结果:RSV能够抑制OGD诱导的神经元凋亡,下调活化的caspase-3和细胞色素C的水平,上调Bcl-2/Bax比值(P0.05)。与对照组相比,OGD导致SDF-1和CXCR4表达增加;与模型组相比,RSV能够上调SDF-1和CXCR4的表达(P0.05);使用AMD3100阻断SDF-1/CXCR4通路减弱了RSV抑制OGD诱导的细胞凋亡的作用。结论:RSV可抑制缺血缺氧诱导的新生大鼠神经元凋亡,其机制可能是通过上调SDF-1/CXCR4通路发挥作用的。     

定喘汤及宣降清分解剂对RSV感染Hela细胞的实验研究

呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体，我院儿科采用定喘汤加减治疗RSV感染，取得了好的疗效。为探讨定喘汤的作用机理，我们进行了定喘汤及宣、降、清分解剂在Hela细胞上抗RSV的实验研究，现报道如下。     

Ⅰ型变态反应与呼吸道合胞病毒毛细支气管炎喘鸣的关系

本文从RSV特异的IgE抗体(RSV-IgE),嗜硷粒细胞和组织胺三方面,探讨了RSV毛细支气管炎喘鸣的发病机理。实验发现,RSV毛细支气管炎患儿的鼻咽分泌液(NPS)中RSV-IgE和组织胺显著升高,外周血嗜硷粒细胞绝对数升高,对 RSV抗原敏感性高,脱颗粒阳性率高。初步证实 IgE介导Ⅰ型变态反应参与了 RSV毛细支气管炎的发病。同时发现,RSV-IgE在患儿体内持续存在,这可能是 RSV毛细支气管炎喘鸣患儿在病后数年中反复出现喘鸣的原因之一。     

利巴韦林对呼吸道合胞病毒感染诱导宿主细胞凋亡及相关基因表达的影响

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是婴儿和儿童呼吸道疾病中的最常见的病原体之一，也是各年龄成人呼吸道感染的病原之一。利巴韦林是美国FDA批准治疗RSV的药物，为了观察利巴韦林在发挥抗RSV的作用过程中，对RSV诱导宿主细胞凋亡及对FasL、Fas和Survivin等凋亡相关基因表达的影响，探讨其治疗RSV感染的分子机制。将A549细胞以10^8 cell／L分种于25ml的培养瓶或内含飞片的6孔板，待细胞生长至80％融合时，换成含0．5％ FBS的培养液静息24h。     

白藜芦醇通过减弱中性粒细胞迁移和浸润改善LPS诱导的急性肺损伤

目的：探究白藜芦醇（RSV）通过减弱中性粒细胞迁移和浸润改善脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）。方法 ：将BALB/c小鼠随机分为对照组、RSV组、模型组及模型+RSV组（LPS+RSV）,模型组和LPS+RSV组采用LPS诱导小鼠ALI模型,RSV组和LPS+RSV组以40 mg/kg RSV灌胃,连续灌胃7 d。末次给药后,收集小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）,检测BALF中白细胞、中性粒细胞和蛋白含量,评估肺组织髓过氧化物（MPO）活性,H-E染色观察肺组织病理损伤,检测肺组织和BALF中炎症细胞因子、趋化因子的表达。体外培养中性粒细胞,分别以1μg/mL LPS、1μg/mL RSV处理细胞,流式细胞术检测中性粒细胞凋亡、趋化因子受体（CXCR2、Mac-1）表达,活性氧荧光探针（DCFH-DA）检测细胞内活性氧（ROS）水平,评估中性粒细胞趋化性和迁移能力,免疫印迹检测核因子NF-κB p65磷酸化水平。结果：与模型组比较,LPS+RSV组BALF中细胞总数、中性粒细胞数、蛋白量、TNF-α、IL-6及CXCL2表达降低,肺组织MPO活性、TNF-α、IL-1β、IL...     

可诱导性表达呼吸道合胞病毒蛋白细胞系的快速构建方法研究

目的 研发用以快速构建多种可诱导性表达呼吸道合胞病毒(RSV)蛋白的细胞系创新性的技术路线.方法 将不同的RSV病毒蛋白基因分别连接到含有PiggyBac转座子位点的Cumme诱导表达载体上,与PiggyBac转座酶质粒共转染HEK293细胞,利用嘌呤霉素进行筛选,并用Cumate诱导病毒蛋白表达.结果 流式细胞仪及Westernblot检测结果均表明,加入诱导剂Cumate后,筛选的细胞系中开始表达相应的病毒蛋白,提示细胞系构建成功.结论 利用PiggyBac转座子可以高效率的构建诱导性表达RSV病毒蛋白的细胞系.     

RSV毛细支气管炎患儿血液CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg与CD40/CD40L关系的研究

探讨CD40/CD40L信号通路对不同病原体毛细支气管炎(以下简称:毛支炎)患儿血液CD4~+CD25~+Foxp3~+ Treg的增殖分化及其分泌抑制性细胞因子TGF-β1、IL-10的影响。取呼吸道合胞病毒(RSV)及非RSV感染毛支炎患儿血液并检测CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg的百分率;并将血液中分离的单个核细胞(PBMC)接种于24孔板内,加入CD40L McAb进行阻断,作用72h后采用流式细胞仪检测培养板内CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg的百分率,激光共聚焦检测CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞表面Foxp3的平均密度,酶联免疫吸附法检测培养上清中TGF-β1、IL-10的含量。RSV毛支炎患儿血液中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg百分率显著低于非RSV毛支炎患儿及正常对照组(P<0.05);RSV毛支炎患儿体外培养PBMC中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg百分率均显著低于非RSV毛支炎患儿、正常对照组和抗CD40L McAb组(P<0.05)。毛支炎患儿PBMC经过体外培养72h后,抗CD40L McAb组培养的细胞中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg表面Foxp3的平均密度显著高于RSV毛支炎患儿组(P<0.05)。PBMC培养上清中IL-10和TGF-β1的水平抗CD40L McAb组明显高于非RSV毛支炎组,非RSV毛支炎组明显高于RSV毛支炎组,差异有统计学意义(P<0.05)。RSV毛支炎患儿体内存在严重的CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg数量不足;体外用抗CD40L McAb阻断CD40/CD40L通路可促进RSV毛支炎PBMC中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg的增殖。