人脐血基质细胞自发分泌多种造血生长因子的实验研究

目的探讨体外培养的人脐血基质细胞分泌血小板生成素(thrombopoietin,TPO)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、干细胞生长因子(stem cell factor,SCF)的能力.方法留取不同培养时相点的培养液上清,ELISA法检测上清中TPO、GM-CSF、SCF的浓度,并与骨髓基质细胞的培养上清液对照比较其特点.结果人脐血基质细胞和骨髓基质细胞均可分泌TPO、GM-CSF和SCF等造血生长因子,二者造血生长因子的分泌随着培养时间的延长而逐渐下降,其中人脐血基质细胞分泌TPO和SCF的高峰期出现在第7天,而GM-CSF的分泌则无高峰期的出现;通过与骨髓基质细胞分泌三种造血生长因子量进行对比发现,人脐血基质细胞SCF和GM-CSF的分泌量低于骨髓基质细胞,而TPO的分泌高于同期培养的骨髓基质细胞.结论人脐血基质细胞与骨髓基质细胞一样具有分泌造血生长因子,支持调控造血的作用.     

体外扩增脐血与骨髓间充质干细胞共移植对NOD/SCID鼠造血重建的研究

目的 探讨体外扩增脐血与骨髓间充质干细胞（MSC）移植对NOD／SCID鼠早期造血重建的影响。方法 在无血清无基质培养基（SCF、FL、TPO、IL-3）中体外扩增7d,MSC培养传至第3代,移植物注射给亚致死量照射NOD／SCICD鼠,FCM分析移植后2周小鼠骨髓人CD45^＋细胞表达率。结果体外扩增脐血、MSC与未扩增脐血共移植后,小鼠骨髓CD45^＋细胞比率提高3．55倍,差异有显著性（P〈0．05）,部分小鼠血小板恢复照射前水平。结论 此3种移植物共移植可能促进NOD／SCICD小鼠早期造血重建和血小板恢复。     

骨髓基质细胞与人脐血基质细胞表达造血生长因子的实验研究

目的在分子生物学水平上探讨体外培养的骨髓基质细胞与人脐血基质细胞表达TPO、GM-CSF、SCF的mRNA的能力的差异.方法收集培养28d的骨髓基质细胞与人脐血基质细胞,采用RT-PCR方法在mRNA水平上分析其造血生长因子GM-CSF、SCF、TPO的表达,比较二者表达TPO、GM-CSF、SCF等造血生长因子的mRNA能力的差异.结果体外培养的人脐血基质细胞与骨髓基质细胞均能表达:(1)TPO的mRNA,人脐血基质细胞表达能力强于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为1.57;(2)SCF的mRNA,人脐血基质细胞表达能力弱于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为0.83;(3)GM-CSF的mRNA,人脐血基质细胞表达能力弱于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为0.68.结论人脐血基质细胞和骨髓基质细胞均可以表达造血生长因子TPO、GM-CSF、SCF的mRNA,具有支持调控造血的物质基础.     

骨髓基质干细胞多能性研究进展

骨髓分为造血系和基质系 ,造血系由造血干细胞 (hepatoeiticstemcells,HSCs)产生和维持 ,基质系由基质干细胞 (stromalstemcells,SSCs)产生和维持。骨髓基质干细胞有两个重要的功能 :第一 ,在合适的环境和诱导因子的存在下 ,它可以分化为骨、软骨及其他中胚层来源的组织 ;第二 ,骨髓基质干细胞可与造血干细胞表面蛋白直接反应并通过分泌生长因子 ,从而调节造血干细胞的分化 ,支持和维持造血微环境。由于在特定的培养条件下 ,骨髓基质干细胞可分化为成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、网织细胞、脂肪细胞、内皮细胞、肌肉细胞等间充质细胞 …     

联合脐血或脐带间充质干细胞异基因移植术后观察

目的观察联合脐血或脐带间充质干细胞（MesenchymalStemCell,MSC）的异基因造血干细胞移植的安全性、有效性及相关并发症发生情况。方法15例联合脐血或脐带MSC的异基因造血干细胞移植患者与15例未联合脐血或脐带MSC的异基因造血干细胞移植患者进行造血免疫重建、骨髓植入水平、骨髓恢复及移植相关并发症比较。结果实验组平均回输脐血或脐带间充质干细胞数为1．077×10^7／kg,移植过程顺利,血象恢复白细胞〉0．5×10^7／L平均13．07d,血小板〉20×10^9/L平均13．6d,较对照组血象恢复快（P〈0．05）。实验组较对照组严重广泛性慢性移植物抗宿主病（cGVHD）发生率低（P〈0．05）,但两组之间aGVHD、肺部及病毒感染、1年复发率、死亡率比较无统计学意义（P〉0．05）。结论联合脐血或脐带MSC的异基因造血干细胞移植成功率高,如何提高1年总生存率值得进一步研究。     

胎盘问充质干细胞对骨髓、脐血、胎盘不同来源造血干细胞的体外扩增支持作用比较

目的研究胎盘间充质干细胞（PDMSC）对骨髓、脐血、胎盘来源的CD34^＋造血干细胞体外扩增的支持作用。方法用酶消化方法从胎盘组织分离出贴壁细胞。流式细胞仪测定。用免疫磁珠法从骨髓、脐血、胎盘的单个核细胞里分离出CD34^＋细胞,建立以HPDMSC饲养层的CD34^＋细胞培养体系,并以无饲养层的培养体系作为对照。结果人胎盘中可以分离出hpdmscs,并可以证明其为间充质干细胞。以HPDMSCS作为以上三种来源的造血干细胞的滋养层,对胎盘来源的造血干细胞支持作用明显优于其他两组,脐血次之,骨髓来源的造血干细胞最差。结论胎盘间充质干细胞具有体外造血支持作用,可以作为骨髓、脐血、胎盘不同来源造血干细胞体外扩增的滋养层,尤其适于胎盘来源的造血干细胞。     

猪造血微环境体外模型对人HSC分化作用的实验研究

目的 研究猪造血微环境对人造血干细胞(HSC)向红系分化的影响.方法 分别抽取健康志愿者骨髓6ml、实验用猪骨髓10ml,分离骨髓间充质干细胞(MSCs),接种DMEM/F12培养基,形成单层贴壁的成纤维样细胞后,作为人、猪造血微环境体外模型.按5×104/ml分别将人脐血CD34 细胞接种于人、猪造血微环境体外模型,以不含MSCs的培养系统为阴性对照,按3U/ml分别加入重组人EPO(rhEPO).于接种10 d后,取悬浮细胞,用流式细胞仪检测人CD71,以CD71阳性细胞率作为CD34 细胞向红系分化的分化率.结果 人MSCs支持下的人CD34 细胞在扩增的同时,(86.15±0.69)%细胞向红系分化;猪MSCs支持下的(82.46±1.46)%人CD34 细胞向红系分化,阴性对照(44.62±1.20)%人CD34 细胞向红系分化(P＜0.01).结论 与阴性对照相比,人/猪造血微环境体外模型均能显著促进人CD34 细胞向红系分化.     

人骨髓间充质干细胞对脐血干细胞体外扩增支持作用的研究

目的：探讨以人骨髓间充质干细胞(bone nlarrow-mesenchymal stem cells，BM-MSC)为基质的无血清培养方法，体外扩增脐血造血干细胞(cord blood stem cells，CBSC)，研究BM—MSC支持造血的功能，以能最终用于临床。方法：用含血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、fit3／flk2配体(FL)和粒细胞-集落刺激因子(G—CSF)的无血清培养液，比较有或无MSC条件下，体外扩增脐血CD34^ 细胞两周后检测总细胞TC、CD34^ 细胞、集落形成单位(CFU)和长期培养-起始细胞(LTC—IC)增加倍数。结果：在TPO、FL、SCF、和G-CSF的作用下，经两周体外扩增后有MSC组的TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C和LTC—IC数较起始分别增加了427、39、125、104和16倍。单纯用上述4种细胞因子的无MSC组，TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C数分别增加了62、11、25、24倍，但LTC-IC只有扩增前的0．8倍。结论：以人BM—MSC为基质的无血清体外培养体系可以更有效扩增CBSC，有潜在的临床应用价值。     

糖尿病大鼠来源骨髓间充质干细胞体外培养观察及其生物学特性

目的：研究糖尿病是否会导致在体外培养条件下自体骨髓间充质干细胞的增殖、分泌和抗凋亡能力的改变。方法：利用链脲佐菌素（STZ）诱导制作成年大鼠糖尿病模型（n=6）,正常大鼠作为对照组（n=6）,分别于体外利用全骨髓贴壁法来扩增和纯化骨髓间充质干细胞后,取生长良好的第2代细胞作为本实验的研究对象。采用Cell Count kit-8（CCK-8）分别绘制两组细胞的生长曲线来评价增殖能力;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血管内皮生长因子（VEGF）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的分泌量;应用Hoechst33342染色和膜联蛋白V/PI双染流式细胞术观察细胞在低氧无血清条件下的抗凋亡能力。结果：来源于糖尿病大鼠的骨髓间充质干细胞的增殖较正常的大鼠显著性减慢（P〈0.01）,在形态学上则表现为较正常的细胞更扁平。VEGF和IGF-1的分泌量较正常大鼠来源的明显降低,其中VEGF的分泌量为（80.7±13.1）pg/mL和（67.9±12.3）pg/mL（P〈0.05）,IGF-1的分泌量分别为（374.8±41.2）pg/mL和（281.8±26.8）pg/mL（P〈0.01）。在低氧无血清条件下,糖尿病来源的干细胞抗凋亡能力显著性降低,两组早期细胞凋亡指数分别为28.7±3.4和37.1±2.42（P〈0.01）。结论：糖尿病大鼠来源的骨髓间充质干细胞可以成功地在体外进行增殖培养,但是其在增殖能力、分泌、抗凋亡能力等一系列生物学性状上有不同程度的损害。     

间充质干细胞:生物学性状和潜在临床应用

基质细胞系统是由能自我更新并分化成不同结缔组织的骨髓间充质干细胞组成 ,多种间充质细胞系均可从一种间充质干细胞集落而来。前期临床移植研究表明 ,基质细胞的输入不仅能防止移植物失败的发生 ,而且还具有免疫调节作用。早期临床研究为间充质干细胞进一步应用于造血支持、移植物的免疫调节铺平了道路。1　基质细胞系统1 1　概念　基质细胞系统包括支持造血的骨髓基质细胞 ,即间充质干细胞及其后代 ,以及结缔组织细胞如骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞和平滑肌细胞。基质细胞系统最早由Ｏｗｅｎ1985年报道 ,并很快成为结缔组织动力…     

成人脂肪源间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用

目的：研究人脂肪间充质干细胞培养上清对人脐带血（HUCB）中所含有间充质干细胞（MSCs）的影响。方法：取脐带血,肝素抗凝,Percoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,低糖DMEM培养获得贴壁细胞层。与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育。流式细胞仪检测表面抗原。结果：脐带血的单个核细胞与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育经体外培养贴壁后出现形似纤维状细胞形态并表达与MSCs相关的抗原（CD13,CD44,CD71,CD166）,但不表达造血细胞抗原（CD34,CD45）,这与源于骨髓的MSCs一致。结论：人脐血间充质干细胞与脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用。     

脐血间充质干细胞治疗肝衰竭的研究进展

肝干细胞按其来源可划分为肝源性干细胞和非肝源性干细胞,而非肝源性肝干细胞主要指骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞和脐血间充质干细胞等,脐血间充质干细胞作为非肝源性肝干细胞的一种,具有低免疫原性、来源丰富、可扩增及多向分化的特点,在诱导剂的作用下可向肝细胞分化,表达肝细胞特异性标志物及相关功能,这为移植脐血间充质干细胞治疗肝衰竭提供了实验依据。     

无血清培养基分离培养脐带间充质干细胞的研究

目的探讨应用无血清培养体系分离培养脐带间充质干细胞,明确其成骨生物学特性,为临床应用奠定实验基础。方法在无血清干细胞培养体系下,利用组织块贴壁培养法分离培养,扩增脐带间充质干细胞,在倒置显微镜进行形态学观察,流式细胞检测鉴定其表面标记CD34、CD44、CD90及CD45的表达,成骨诱导液培养2～3周后观察其细胞形态学变化,茜素红染色鉴定其成骨情况。结果脐带组织块接种后第1次更换培养液12h后,有少量梭形的细胞从脐带组织边缘爬出,培养5～6d左右成单层状生长,12d左右梭形状细胞呈现复层生长趋势,细胞表面标记CD44、CD90均呈阳性为间充干细胞来源,CD34、CD45均呈阴性为非造血干细胞来源;细胞经成骨诱导2～3周后具有良好的分化成骨能力。结论利用无血清的人间充质干细胞专用培养基培养体系,脐带组织培养法能够分离培养出大量的脐带间充质干细胞,避免了培养中异种蛋白的混入而降低临床排异反应。     

人羊膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞对外周血淋巴细胞的免疫调节作用比较

目的 比较人羊膜间充质干细胞(hAMSC)与骨髓间充质干细胞(hBMSC)对异体外周血淋巴细胞的免疫调节功能,为临床应用hAMSC治疗移植物抗宿主病提供实验依据.方法 通过酶消化法和Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分别分离出人羊膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞,体外扩增培养间充质干细胞(MSC),获取第4代细胞,建立MSC与经植物血凝素(PHA)刺激的异体人外周血单个核细胞(PBMC)共培养体系,采用流式细胞术分析比较两种不同共培养体系中T淋巴细胞亚群的变化情况,采用ELISA法比较两种MSC共培养体系中细胞因子白介素2(IL-2)及白介素10(IL-10)的分泌水平.结果 (1)hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PBMC+PHA共培养组Treg、Th2、Tc2细胞亚群的比例均较PBMC+PHA组明显上升(P<0.05),Th1、Tc1细胞亚群的比例均较PBMC+PHA组明显下降(P<0.05),且hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PBMC+PHA共培养组T细胞亚群的变化差异无统计学意义(P>0.05);(2)ELISA结果提示,与PBMC+PHA组相比,hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PHA+PBMC共培养组上清液中IL-2的水平均明显下降(P<0.05),hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PHA+PBMC共培养组上清液中IL-10水平均明显上升(P<0.05),hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PBMC+PHA共培养组上清液中IL-2、IL-10含量的变化无统计学差异(P>0.05).结论 hAMSC、hBMSC对外周血淋巴细胞具有相似的免疫调节功能,提示hAMSC可能为移植物抗宿主病的预防和治疗提供一种新的选择.     

米诺环素微环境对体内外骨髓间充质干细胞的影响

 目的研究米诺环素在体内外干扰骨髓间充质干细胞后对其生长的影响。方法大鼠脊髓损伤后,经口给予米诺环素,并将带有GFP基因的SD大鼠骨髓间充质干细胞局部移植到损伤脊髓,在体外培养大鼠骨髓间充质干细胞并给予不同剂量的米诺环素进行干预。利用荧光显微镜计数细胞,采用MTT法描绘细胞生长曲线来观察干细胞的生长状况。结果米诺环素联合骨髓间充质干细胞治疗实验性脊髓损伤,在损伤中心可以观察到更多的移植细胞,体外培养的骨髓间充质干细胞在合适剂量米诺环素的干预下呈现出更加旺盛的生长趋势。结论合适剂量的米诺环素可以促进体内移植的骨髓间充质干细胞在损伤脊髓内更多地迁移到损伤中心,而对于体外培养的骨髓间充质干细胞米诺环素会促进其增殖。     

人脐血间充质干细胞的改良分离培养

目的探讨人间脐血来源的充质干细胞在体外分离培养与扩增的方法。方法用重力离心-密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离细胞,用含15%FBS的DMEM低糖培养基培养并传代,流式细胞仪检测P3代间充质干细胞的表面标志。结果脐血来源的单个核细胞24 h即开始贴壁,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞。经自然纯化法传代后,可得到形态单一的长梭形间充质干细胞。流式细胞仪检测结果显示该细胞表达CD44。结论脐血来源的MSCs可以在体外分离培养和扩增,细胞表面标记与骨髓来源间充质干细胞一致。     

骨髓和脂肪源多潜能间充质干细胞的比较研究

①目的比较骨髓源间充质干细胞和脂肪源间充质干细胞的生物学特性。②方法分离人的骨髓源间充质干细胞和脂肪源间充质干细胞进行体外培养，通过绘制生长曲线，比较细胞的增殖能力；利用流式细胞仪分析细胞表型，并与诱导培养比较细胞的分化潜能进行比较。③结果脂肪源间充质干细胞与骨髓源间充质干细胞具有相当的生物学特性，且在增殖能力方面优于骨髓源间充质干细胞。④结论人脂肪组织可能成为一种新的间充质干细胞来源。     

骨形态发生蛋白激活自身肌肉间质细胞拯救骨髓衰竭

目的探讨骨形态发生蛋白(BMP)激活自身肌肉间质细胞以拯救骨髓造血衰竭的作用。方法采用5-氟脲嘧啶与白消安合用诱导大鼠致死性再生障碍性贫血模型,于诱导再障前3d肌肉内植入重组人-BMP-2(rh-BMP-2),并以肌肉内植入琼脂为对照。观察血象、病理形态等变化以及两组再障大鼠的死亡率。同时,给正常小鼠大腿肌肉内植入rh-BMP-2,动态观察植入后局部的形态变化、形成骨及骨髓的形态特点,脾集落形成单位以及基质细胞干细胞生长因子(SCF)的表达。结果小鼠在BMP肌肉内植入1周内,在BMP周围有大量间质细胞增殖,随后形成骨及骨髓,其骨髓基质细胞的SCF表达明显高于自体骨髓;BMP植入组的再障大鼠,不仅血象与对照相比有明显改善,而且死亡率也明显下降,有56.3%大鼠存活超过3个月,其血象完全恢复正常,骨髓和脾脏的组织形态学改变也恢复正常。对照大鼠除1只存活超过3个月外(占4.3%),其余均死于急性再生障碍性贫血。结论BMP肌肉内植入可拯救骨髓造血衰竭,其机制可能与BMP诱导成年自体肌肉内存在的干细胞向造血分化有关;本研究结果为应用成体自身干细胞进行细胞治疗提供了新的途径。