GST-LMO1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

 目的构建GST-LMO1 融合蛋白表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌（Ecoli ）中诱导表达。方法以人胎脑文库为模板,用PCR方法法扩增出LMO1基因全长及各个截短突变体,通过BamH Ⅰ和EcoRⅠ酶切位点分别将其定向插入pGEX-5X-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,通过酶切电泳鉴定和DNA 序列测定正确后,转入Ecoli BL21中,经异丙基硫代茁-D 半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE 和Western blot 鉴定。结果酶切电泳及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,并用Western blot 方法证实了GST-LMO1 全长及各个截短突变体融合蛋白的表达。结论成功构建了LMO1 全长及其截短突变体原核表达载体,并证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为LMO1 结构与功能的研究提供了前提基础。     

GST/RIPX融合蛋白表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的 构建GST/RIPX融合蛋白基因表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 以质粒pcDNA3.1.RIPX为模板,通过BamH1和Xho1酶切位点将RIPX定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并转化E.coil DH5а,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入化E.eoli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达.鉴定.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并用SDS-PAGE方法证实了GST/RIPX融合蛋白的表达.结论 成功构建了RIPX原核表达载体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化RIPX蛋白和研究RIPX的生物学功能奠定了基础.     

人内皮抑素基因的质粒构建及在大肠杆菌中的表达

目的:将人内皮抑素(endostatin)基因插入表达载体并进行原核表达.方法:将endostatin基因定向插入表达载体pQE-31 BamH I/Kpn I位点,构建重组质粒pQEN,转化E.coli M15,进行原核表达.结果:在IPTG的诱导下,endostatin基因在重组转化株E.coli M15 (pQEN) 中获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子量为22×103 u,表达产物主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的34.6%.结论:从组织中克隆endostatin基因并进行原核表达是可行的方法.     

My027融合蛋白表达载体构建及其在大肠杆菌的表达

目的探索My027蛋白的体外表达,通过原核表达获得大量可溶性My027融合蛋白。方法逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增出My027片段,插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建质粒pGEX-My027。转化BL-21菌,IPTG低温诱导表达融合蛋白,亲和层析法获得融合蛋白,采用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)、Western印迹法及质谱进行鉴定。结果融合蛋白以水溶形式分泌于大肠杆菌BL-21胞质中,纯化后的目的蛋白经SDS-PAGE、Western印迹法及质谱证实高效表达,氨基酸序列正确。结论人脂肪细胞新蛋白My027在pGEX-4T-2原核表达载体可获高效表达,为进一步研究其功能奠定基础。     

肺炎嗜衣原体CPAF原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的对肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子（CPAF）基因进行原核表达,为肺炎嗜衣原体的诊断及疫苗研究奠定基础。方法利用PCR技术从肺炎嗜衣原体标准株AR-39中扩增CPAF基因,将其克隆于原核表达载体pGEX-6p-2中,构建重组表达载体。并用双酶切、PCR及序列测定等方法进行鉴定后,在大肠杆菌中诱导表达GST融合蛋白。结果重组质粒中CPAF基因序列与肺炎嗜衣原体AR-39的同源性达到100％,CPAF在大肠杆菌中表达高效的GST融合蛋白。结论成功构建肺炎嗜衣原体CPAF基因的原核表达系统,并成功表达重组蛋白．为肺炎嗜衣原体疫苗的研究和临床检测试剂盒的研制打下基础。     

hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的: 构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。 方法: 以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)-hISO。经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。 结果: 经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68860,将融合蛋白进行纯化,经40和60mmol·L^-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白。 结论: 成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达。     

原核表达载体pKpL5的构建及应用研究

目的构建基因工程生产用高效原核融合表达质粒载体。方法在原核表达质粒pKpL4起始密码下游嵌入人工合成的六聚组氨酸编码区、16s RNA3端互补区、凝血酶识别位点编码区接头,构建成原核表达质粒pKpL5,并将人生存素单体、双体及利什曼原虫LACK抗原基因编码区分别克隆入pQE32、pKpL4和pKpL5进行表达,SDS-PAGE电泳分析各目的蛋白的表达量。结果人生存素单体、双体及利什曼原虫LACK抗原基因读码框在pQE32和pKpL4质粒载体内均不表达,而在pKpL5内,其目的蛋白表达量分别占细菌总蛋白量的5.1%,19%和35%。结论pKpL5可用作通用原核高效表达质粒载体表达各种目的基因。     

人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法：用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2．0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98．73％,氨基酸序列同源性为99．68％。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28．4％。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。     

GST-hCAP融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的:构建GST标签的人c-Cbl相关蛋白(GST-hCAP)融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导其表达.方法:从COS-1细胞中提取mRNA,反转录为cDNA.用PCR方法扩增出hCAP基因全长,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-hCAP,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定.结果:酶切电泳及测序结果证明,原核表达质粒GST-hCAP构建成功,用Western blot方法也证实了GST-hCAP融合蛋白的表达.结论:成功地构建了GST-hCAP原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化CAP及研究其结构与功能提供了前提基础.     

福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达与纯化

目的表达和纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC,研究福氏志贺菌的致病机制。方法将含有ipaC基因的pET32a-i-paC表达质粒载体转化大肠杆菌BL21(λDE3),在异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导下表达,对诱导后的表达产物进行SDS-PAGE鉴定,并采用QIA expressionistTM蛋白纯化系统来纯化目的蛋白。结果诱导后的表达产物经SDS-PAGE发现有一相对分子质量约为63 000的条带,其含量约占总蛋白量的11%,以350 mmol/L咪唑洗脱液洗脱,目的蛋白纯度可达90%以上。结论pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后,可稳定、高效地表达目的蛋白,QIA-expressionistTM蛋白纯化系统是一种简便、高效的纯化系统,可获得高纯度的目的蛋白。     

福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达、纯化及免疫活性鉴定

目的表达、纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC并对其免疫活性进行鉴定。方法将含有ipaC基因的pET32a．ipaC表达质粒载体转入大肠杆菌BL21（kDE3）中表达,表达产物进行SDS—PAGE鉴定,并采用QIA expressionist^TM蛋白纯化系统纯化IpaC蛋白;用纯化的蛋白免疫动物获得抗血清,Western-blot检测抗原的免疫活性。结果诱导后的表达产物经SDS—PAGE发现有一相对分子量约为63000的条带,其含量约占总蛋白量的11％,对融合蛋白进行纯化纯度可达90％以上,抗His的抗体Western-blot分析,发现特异性区带出现在63000u处,证明该蛋白是所要表达的融合蛋白,制备的免疫血清可与Ipac发生特异免疫反应。结论pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后,可稳定、高效地表达毒力蛋白IpaC,且纯化后的蛋白具有免疫活性。     

组氨酸蛋白激酶EnvZ抑制剂对福氏志贺菌毒力影响的初步研究

目的初步研究福氏志贺菌组氨酸蛋白激酶EnvZ抑制剂对福氏志贺菌毒力的影响。方法通过构建志贺菌：EnvZ胞内段（SF-EnvZc）蛋白的原核表达质粒,表达并纯化SF-EnvZc蛋白,在SPECS公司的小分子化合物库中模拟筛选出的10个候选EnvZ抑制剂的基础上,通过体外磷酸化的方法筛选出能够有效地抑制SF- EnvZc蛋白磷酸化的小分子化合物（EnvZ抑制剂）,然后采用表面等离子共振（SPR）技术检测EnvZ抑制剂与SF-EnvZc蛋白的结合力,并采用小鼠角结膜志贺菌感染模型检测EnvZ抑制剂对福氏志贺菌株Sf9380毒力的影响。结果在10个候选EnvZ抑制剂中,化合物1、2、3能够有效地抑制SF-EnvZc蛋白的磷酸化,其IC50值分别为（70．17±5．83）、（10．18±0．86）和（37．66±9．64）μmol／L,且上述3个化合物表现出对SF-EnvZc蛋白的高亲和力,其平衡解离常数（Kd）分别为4．08、3．57和2．94μmol／L,其中化合物1和2能够明显抑制福氏志贺菌株Sf9380导致的小鼠角结膜炎症反应（由＋＋＋变为-）,化合物3能够明显降低其炎症反应（由＋降为＋）,化合物1、2、3的最小有效浓度分别为12．5、12．5和100μmol／L结论筛选出3个EnvZ抑制剂,化合物1、2、3能够不同程度地抑制或降低福氏志贺菌导致的小鼠角结膜炎症反应,提示EnvZ抑制剂能够降低福氏志贺菌的毒力。     

具有伤寒杆菌和痢疾杆菌抗原的杂交菌株GW_1的构建

以福氏痢疾杆菌２ａ为供体菌，以伤寒沙门菌口服疫苗Ｔｙ_（２１ａ）株为受体菌，通过质粒诱动，将福氏痢疾杆菌的菌体抗原基因转移至伤寒沙门菌口服疫苗灯Ｔｙ_（２１ａ）株中，构建了既表达福氏痢疾杆菌ｏ抗原，又表达伤寒沙门菌Ｏ_９、Ｏ_（１２）和Ｈｄ抗原的杂交子，并将此杂交子命名为ＴＳＧＷ_１株。     

人分化抑制因子3基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的:在大肠埃希菌中表达和纯化人分化抑制因子3(Id3),为进一步研究Id3的生物学活性打下基础. 方法:PCR扩增人Id3基因编码区的DNA片段,将PCR产物克隆至pGEM-T Esay载体中并测序鉴定.将Id3 cDNA片段重组入原核表达质粒pET-32a( ),转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达,表达产物经Western blot 鉴定,并通过镍亲和层析柱纯化His-Tag标记的融合蛋白. 结果:成功地构建了Id3的原核表达载体.Western blot分析证实,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了His-Tag融合蛋白,亲和层析法纯化后获相对分子质量为34 000的Id3融合蛋白. 结论:重组质粒pET32a( )-Id3能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白.     

福氏痢疾杆菌感染后不同治疗方法对大鼠肠功能的影响

目的：观察福氏痢疾杆菌感染后大鼠肠道感觉运动功能的改变及不同治疗方法的作用,探讨预防急性肠道感染后肠功能紊乱的方法,从而为感染后肠易激综合征(PI-IBS)的预防提供指导。方法：将40只雌性Wistar大鼠分为正常对照组、模型组、抗生素治疗组、微生态制剂治疗组和抗生素与微生态制剂联合治疗组5组。后4组应用福氏痢疾杆菌造成肠道感染后,分别行相应治疗。在感染后16～22d,所有大鼠进行直肠气囊扩张,测定肠道感觉阈值和离体肠道平滑肌的肌张力,并行远端结肠病理学检查。观察肠道感觉运动功能的改变和组织学改变。结果：各组大鼠组织学均无明显变化;模型组、抗生素治疗组和微生态制剂治疗组的肠道感觉阈值较正常组明显降低(P<0.05),离体平滑肌收缩的张力积分明显增高(P<0.05);联合治疗组肠道感觉阈值及离体平滑肌收缩的张力积分与正常组无明显差异。结论：① 大鼠在福氏痢疾杆菌感染炎症消失后还存在着肠功能紊乱,表现为肠道感觉运动功能的异常;② 单纯应用抗生素或微生态制剂治疗,无法使肠道的感觉运动功能恢复正常;③联合应用抗生素和微生态制剂治疗,可以使肠道感觉运动功能恢复正常,从而预防急性肠道感染后肠功能紊乱的发生。     

成都地区痢疾杆菌散发、暴发菌株的质粒分析及耐药谱测定

作者对81株散发、暴发痢疾杆菌进行质粒分析和耐药谱测定。结果发现:痢疾杆菌对氨苄青霉素、四环素等耐药率较高,对庆大霉素等敏感。50％的菌株含有质粒,大多数质粒DNA分子量小于6Md,各菌株呈不均一的质粒模式。提示:成都地区痢疾的流行是由许多在遗传学上同源相关性较远的痢疾杆菌引起。通过对暴发菌株所进行的分析可见:1或2株痢疾杆菌导致了此次暴发。质粒分析及耐药谱测定适合于痢疾暴发菌株的鉴定,是痢疾流行病学研究的有用工具。     

Multi-drug resistance and characteristic of integrons in Shigella spp. isolated from China

Objective To investigate the characteristic of integrons and the relationship between integrons and antimicrobial resistance in Shigella spp. Methods Ninety Shigella strains (83 S. flexneri and 7 S. sonnei) were isolated from the stools of patients in China. Susceptibility to 8 antimicrobials was tested for all isolated strains. PCR, RFLP and sequencing analysis of integrons were applied to all of them. Results High prevalence of multi‐drug resistance (95.6%) was identified. Of the isolates 79 (87.8%) carri...     

CEA的多表位疫苗基因的设计及构建的表达载体在原核表达系统中的表达

目的 本研究设计肿瘤相关抗原CEA的多表位疫苗基因和构建的重组表达载体在原核表达系统中成功表达融合蛋白.方法 根据预测分析得到的表位氨基酸序列,选取预测分值较高的CTL表位(IMIGVLVGV)和B细胞表位(SNNSKPVEDK),并结合“非选择性”辅助T细胞表位(AKFVAAWTLKAAA)串联起来,按原核系统偏爱的氨基酸密码子优化,委托生物技术公司合成寡核苷酸,退火获得目的基因,并将目的基因克隆至原核表达载体pET32a(+)多克隆位点内.将此重组载体转化E.coli BL21(DE3)表达融合蛋白,并经SDS-PAGE、Western blot分析鉴定.用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化表位融合蛋白ozlf-86/87.结果 嵌合有多表位目的基因的原核重组质粒pET32a(+)/ozlf-86/87,进行酶切和测序鉴定,构建成功.SDS-PAGE分析表明,重组质粒在37℃1.0mmol/L IPTG条件下诱导6h能很好地表达目的蛋白,相对分子质量(Mr)约为20kDa,与预期Mr大小吻合;蛋白表达量均约占细菌总蛋白量的20％.,并经Western blot鉴定为目的蛋白.用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化成功获得表位融合蛋白,即ozlf-86/87,纯度达到90％以上.结论 本研究获得的多表位融合蛋白对胃肠道恶性肿瘤诊断试剂的研究和进一步的疫苗研究奠定了基础.