结核分枝杆菌Mtb81蛋白的表达及应用研究

目的克隆结核分枝杆菌Mtb81蛋白的编码基因Rv1837c,并在大肠杆菌中表达、纯化,获得重组蛋白Mtb81。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv1837c基因序列,克隆入原核表达载体pET-28a,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达,纯化表达产物,获得重组Mtb81。ELISA检测重组Mtb81蛋白的敏感性和特异性。结果重组质粒pETRv1837c测序表明具有正确的编码序列,质粒构建成功,重组蛋白Mtb81在大肠杆菌中以包涵体和可溶性形式稳定表达。以Mtb81为抗原ELISA检测结核病患者血清抗体总敏感性为20.83%,特异性为95.83%。结论结核分枝杆菌Mtb81重组蛋白能在大肠杆菌工程菌种成功表达,为进一步的应用研究奠定基础。     

重组结核分枝杆菌 MPT64的克隆与表达

目的：克隆和表达结核分枝杆菌抗原 MPT64,并分析其免疫活性。方法：以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增 mpt64基因,克隆至 T 载体 pMD18-T,转化入 E.coli DH5α,菌落 PCR 鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的 pMD18-T-mpt64的 mpt64基因亚克隆至表达载体 pET-28a,构建重组质粒 pET-28a-mpt64,转化 E.coli BL21中,PCR 和双酶切鉴定阳性重组子,IPTG 诱导 MPT64表达,亲和层析纯化,western-blot 分析其免疫活性。结果：成功构建 pET28a-mpt64重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约为26kDa 的 MPT64,并能被结核病人血清识别。结论：克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌 MPT64蛋白。     

结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析

目的 构建结核分枝杆菌rv1837c、rv3803c基因原核表达重组质粒,进行表达、纯化,并分析其免疫原性.方法 PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv rv1837c、rv3803c基因,并克隆入pTA2质粒.测序正确后,再亚克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c重组体.然后转化入表达宿主大肠杆菌B121(DE3),经0.4 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导;分别与组氨酸标签单克隆抗体及结核患者血清进行Western blot,鉴定Rv1837c、Rv3803c重组蛋白.经镍离子螫和氮川乙酸-组氨酸标签亲和树脂纯化,将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,取兔血清与纯化蛋白通过Western blot方法,检测家兔血清中的抗体.结果 pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c重组体表达相对分子质量为92000及38 000的重组蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量分别占全菌蛋白质的30%及50%.获得纯度为90%的重组蛋白.纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的 蛋白,有较强的免疫原性.结论 成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c,并获得Rv1837c及Rv3803c重组蛋白,为血清学诊断活动性结核病奠定了基础.     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆、表达与鉴定

目的 :构建表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT6 4重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 .方法 :用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出MPT6 4基因片段 ,插入 pGEM T easy载体中 ,序列测定正确后 ,将其亚克隆到表达载体pProEXHTb中 ,在大肠杆菌DH5α中表达 .结果 :获得结核分枝杆菌MPT6 4成熟蛋白基因 ,经序列测定与GenBank公布的序列完全一致 ;表达蛋白经SDS PAGE分析 ,相对分子质量与文献报道一致 ;重组蛋白经蛋白印迹实验 ,在Mr2 .6× 10 4位置有特异条带 .MPT6 4蛋白在宿主菌中表达量约占菌体总蛋白的 13.5 % .结论 :基因重组表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于结核病的预防疫苗的研制和皮肤免疫诊断试剂的制备 .     

结核分枝杆菌Rv0901基因原核表达质粒的构建及其表达

目的　为研究结核分枝杆菌基因Rv0 90 1的功能提供材料。方法　PCR扩增Rv0 90 1基因编码序列 ,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX 1λT获得重组表达质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,通过SDS PAGE、GST 纯化试剂盒鉴定并纯化表达产物。结果　从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv0 90 1基因 ;成功构建了融合表达质粒pGEX Rv0 90 1;重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 4 5kDa的GST Rv0 90 1融合蛋白。结论　本实验成功表达并纯化GST Rv0 90 1融合蛋白 ,为Rv0 90 1基因功能的研究打下了基础。     

结核分枝杆菌Rv2994基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的构建结核分枝杆菌假想药物外排泵蛋白编码基因Rv2994的重组穿梭质粒pMV-2994,并对其进行鉴定。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,应用PCR技术扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT,获得重组表达质粒pGEX-2994,测序鉴定。酶切该基因片段,定向重组入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,构建重组质粒pMV-2994,通过限制性内切酶酶切及PCR鉴定。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出的Rv2994基因与GenBank公布的序列一致,经过酶切及PCR鉴定,表明Rv2994基因成功插入了pMV261穿梭载体。结论成功构建了重组穿梭质粒pMV-2994,为进一步研究Rv2994基因功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌毒素蛋白 higB 的原核表达及分析

目的：克隆编码结核分枝杆菌毒素基因higB并在大肠杆菌中表达。方法利用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增higB基因;构建重组表达质粒pET-32a（＋）-higB;筛选出阳性重组质粒后转化大肠杆菌,诱导目的蛋白表达;利用SDS-PAGE与Western-blot鉴定目的蛋白的表达。结果成功扩增出了higB基因,克隆于载体pET-32 a（＋）质粒中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确;转化大肠杆菌BL21后higB蛋白没有发生表达。结论已成功构建结核分枝杆菌毒素基因higB的原核表达载体,但大肠杆菌BL21不能表达出higB蛋白。     

重组结核分枝杆菌CFP10的克隆与表达

目的:克隆和表达结核分枝杆菌CFP10,并分析其免疫学活性。方法:自结核分枝杆菌标准株H37Rv提取基因组DNA,PCR扩增cfp10基因,克隆至T载体pMD18T,转化入大肠杆菌JM109,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的pMD18-cfp10的cfp10基因亚克隆至表达载体PQE30,构建重组质粒PQE30-cfp10,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,PCR和双酶切鉴定阳性重组体,IPTG诱导CFP10表达,亲和层析纯化,western-blot分析其免疫活性。结果:成功构建PQE30-cfp10重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约10kDa的CFP10,并能被结核病人血清识别。结论:克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌CFP10。     

结核分枝杆菌Rv2450c基因的克隆和原核表达

目的: 研究结核分枝杆菌Rv2450c基因是否能促进其复活和生长. 方法: 培养结核分枝杆菌,提取其基因组,PCR扩增出Rv2450c基因,克隆入pSP73载体,测序分析. 将该目的基因亚克隆入pGEX-4T-2表达载体,测序证实正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),30℃用IPTG诱导5 h然后进行SDS-PAGE分析. 结果: 测序结果证实获得了Rv2450c基因,其序列与GenBank中报道完全一致. SDS-PAGE分析表明,Rv2450c基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了重组蛋白,表达的蛋白量约占菌体蛋白的22.9%. 结论: 成功克隆了结核分枝杆菌Rv2450c基因,并在大肠杆菌中获得了高效表达.     

重组结核分枝杆菌ESAT-6的克隆与表达

目的:克隆和表达结核分枝杆菌ESAT-6。方法:以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序。将esat-6基因亚克隆至pET-28a,构建pET-esat-6重组质粒,转化入大肠杆菌BL21感受态,PCR和双酶切鉴定阳性克隆,经IPTG诱导表达,用His-bindTM亲和层析柱纯化ESAT-6,SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果:PCR扩增出esat-6基因的特异片段,成功构建重组表达质粒pET-esat-6,并在BL21获得表达,纯化的ESAT-6能被结核病人血清所识别。结论:成功克隆和表达获得重组蛋白ESAT-6。     

结核分支杆菌MPT63抗原的表达及其血清学诊断价值的研究

目的：获得结核分支杆菌重组MPT63蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。寻找更有效的结核病诊断试剂,方法：应用基因工程技术表达,纯化MPT63蛋白,通过Western blotting和免疫双扩散试验春抗原性,通过斑点免疫试验,结明试验和结核病一步法检测血清中的抗结核抗体。结果：重组质粒pET24b-MPT63测序表明具有正确的编码序列,MPT63蛋白在大肠杆菌细胞内以可溶性蛋白的形式高效率表达,表达量占菌体总蛋白的40％左右,分子量的kDa,Western blotiing和免疫双扩散试验检测抗结核,抗体的阳性率分别为46．7％和50％,结核病一步法检测的阳性率为70％,结明试验的阳性率为80％,在34例正常血清中,MPT63和PPD斑点免疫试验检测抗结核抗体的阳性率分别为38．2％和35．3％,结论病一步法检测的阳性率也为23．5％,结论：pET24b-MPT63大杆菌工程菌能以可溶性蛋白的形式高效表达,重组的MPT63也许可作为结核病血清学诊断的一组抗原之一。     

结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒的构建及其表达

目的：构建结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒，并在真核细胞中表达。方法：从H37Rv基因组中扩增出MPT64基因，经限制性内切酶消化后，定向插入pcDNA3.1( ）中，用脂质体法将pcDNA-MPT64转染COS-7细胞。采用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：扩增出的MPT64基因正确插入pcDNA3.1中，DNA序列测定无突变产生。重组质粒在COS-7细胞中表达MPT64。结论：成功地构建了pcDNA-MPT64质粒，其真核表达的蛋白具有良好的抗原性，为进一步研究MPT64在抗结核菌感染中的预防作用奠定了基础。     

结核分支杆菌MPT64基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达、纯化和诊断运用

目的利用大肠杆菌表达系统大量获得重组MPT64蛋白,分析其生物学、免疫学特性,并初步评估其在结核病血清学诊断方面的价值.方法用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分支杆菌H37Rv中获得了MPT64基因,并构建大肠杆菌表达株;聚丙烯酰胺凝胶电泳重组蛋白;Western印迹及酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析重组蛋白免疫原性,并检测血清的抗结核抗体.结果构建了能表达重组MPT64的大肠杆菌工程菌,表达的重组蛋白蛋白为可溶性形式,表达量占细胞总蛋白的30%,分子量约23kD.经离子交换柱纯化后,重组蛋白纯度达90%以上.Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应.ELISA分析表明该纯化的重组抗原能区别抗结核抗体阳性患者血清及正常人血清.结论该实验获得了能高效表达MPT64蛋白抗原的大肠杆菌工程菌.纯化的该重组蛋白具有特异的免疫原性,有一定的诊断运用价值.     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建表达

目的：构建结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达．方法：采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT64编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3经PCR扩增融合，定向克隆入pcDNA3．1( )中。采用脂质体转染法将pcDNA／Ag85B—MPT64(pcDNA／AM)转染COS-7细胞，用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：Ag85B-MPT64融合基因经双向DNA序列测定，碱基突变率为0．11％(2／1707)，突变为无意义突变；重组质粒转染COS-7细胞后经检测证实，该融合基因能在真核细胞中表达。结论：成功地构建了Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达，融合蛋白具有良好的抗原性。     

结核分枝杆菌Ag85B与MPT64真核共表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Ag85B和MPT64编码基因的共表达载体pBud85B-MPT.方法:将结核分枝杆菌Ag85B、MPT64基因同时克隆进多启动子共表达载体pBudCE4.1中,得到真核共表达质粒pBud85B-MPT;将pBud85B-MPT转染COS-7细胞,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达.结果:在COS-7细胞中同时检测到Ag85B、MPT64的表达.结论:pBud85B-MPT共表达质粒构建成功,为进一步研究新型结核病疫苗奠定基础.     

SZ—63单链抗体的基因构建、表达及免疫性研究

目的：基因构建与表达SZ-63单链抗体(SZ-63scFv)，降低单克隆抗体对人体的免疫源性。方法：运用基因工程手段通过一段小分子连接肽(Gly4Ser)3将SZ-63抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因连接，构建成pET22b-63scFv表达载体，并导入大肠杆菌BL21（DE3）plys中进行表达，同时进行表达特性的研究。结果：pET22b-63scFv在BL21（DE）3plys中经IPTG诱导后，SZ-63scFv以包涵体形式存在，经复性处理后具有与纤维蛋白D—二聚体结合的活性，其表达量占菌体总蛋白的18％，SZ-63scFv具有13mg／g湿菌的表达量。结论：成功地获得了SZ-63scFv单链抗体并保留了与亲本抗体同一的抗体结合特性。     

结核分枝杆菌候选抗原基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆并构建编码结核分枝杆菌(MTB)ESAT6，Ag85B和MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中分别扩增出ESAT6，Ag85B和MPT64基因(288bp，978bp and 687bp)，并克隆到T载体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌E．coli Dh5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与献报道一致，证实符合表达框架。结论 成功地克隆并构建了ESAT6，Ag85B和MPT64基因的重组表达质粒pGEX-ESAT6,pGEX-Ag85B和pGEX-MPT64。     

结核分支杆菌MPT64 DNA疫苗的纯化及免疫效果

目的：研究结核分支杆菌MPT64 DNA疫苗经肌肉注射免疫小鼠的效果。方法：通过Qiagen质粒纯化试剂盒纯化质粒DNA;将25只BALB/c小鼠随机分为四组,生理盐水组、载体质粒组和重组质粒组于第0周、第3周、第6周经肌肉注射免疫小鼠各1次,卡介苗组只在0周时皮内注射卡介苗1次;通过ELISA方法检测小鼠血清中抗MPT64抗体。结果：纯化后的JW4303和JW4303-MPT64质粒DNA经电泳证实无RNA污染,OD260/OD280大于1.8,每2000ml培养菌可获得2mg左右的质粒DNA。以三个对照组15只小鼠的血清抗MPT64抗体OD值经x^- 2s为正常界限值,免疫4周时重组质粒组10只小鼠中有4只血清中抗MPT64抗体阳性;免疫7周时有5只小鼠抗体阳性,抗体水平较前略微增高。结论：结核分支杆菌MPT64 DNA疫苗经肌肉注射免疫小鼠只能诱导部分小鼠产生特异的体液免疫应答,免疫效果存在明显的个体差异。     

Construction and transfection of sense／antisense eukaryotic expression vectors for human cathepsin L gene

Objective: To obtain sense/antisense eukaryotic expression vectors for human cathepsin L gene, and study the biological effects on human osteosarcoma cell line MG-63 after transfection. Methods:Cathepsin L gene sense/antisense eukaryotic expression vectors were constructed with recombinant technology and transfected into the human osteosarcoma cell line MG-63. The expression of cathepsin L gene mRNA was examined with RT-PCR and the expression of cathepsin L was examined with Western blot. Results: The sense/antisense recombinant eukaryotic expression vectors for cathepsin L were successfully constructed and transfected into MG-63 cell. Conclusion: Antisense cathepsin L gene can significantly inhibit the expression of cathepsin L mRNA and protein.