含内标的荧光PCR—荧光定量PCR

1.前言 PCR技术应用于体外基因检测是临床诊断学上的一项重大突破,但由于传统的PCR检测易污染、假阳性率高等原因,被国家明令禁止使用于临床检验。为了克服传统PCR的上述缺点,发挥它早期、快速诊断的优点,近年来,发展了多种将传统PCR技术与其它技术结合起来的新型PCR技术,最成功的有PCR与ELISA结合的PCR-ELISA技术和PCR与荧光检测结合的荧光PCR技     

Taqman荧光定量PCR是核酸水平对管家基因GAPDH进行定量的好方法

目的比较Taqman荧光定量PCR法、SYBR Green I荧光定量PCR法和普通PCR法制作3-磷酸甘油醛(GAPDH)标准曲线的检出下限、线性范围的差异,确定一种较好的GAPDH绝对定量方法。方法构建含GAPDH全长的质粒,经PCR和EcoR I限制性酶切鉴定确认后,紫外定量并连续稀释10倍作为标准品。分别用Taqman法和SYBR Green I法于荧光定量PCR仪上制作标准曲线,同时用普通PCR结合琼脂糖凝胶电泳利用Quantity One软件定量并制作标准曲线。结果Taqman法检出GAPDH的下限为2.0×104拷贝,线性范围:2.0×104~2.0×1010拷贝;SYBR Green I法检出GAPDH的下限为2.0×107拷贝,线性范围:2.0×107~2.0×1010拷贝;普通PCR检出GAPDH的下限为2.0×106拷贝,线性范围:2.0×107~2.0×109拷贝。结论Taqman荧光定量PCR法比SYBR Green I荧光定量PCR法和普通PCR法的灵敏度高,线性范围宽,是核酸水平对GAPDH定量的好方法。     

念珠状链杆菌Taqman MGB荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

目的 建立念珠状链杆菌的实时荧光定量PCR检测方法, 实现该菌在多种实验动物中的快速检测。方法 根据NCBI公布的念珠状链杆菌序列, 设计特异性引物和探针, 通过对24株标准参考菌株的扩增, 验证其特异性、敏感性和重复性。运用所建立的方法对小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、长爪沙鼠和树鼩的共823份呼吸道样本进行检测。结果 用所建Taqman MGB荧光定量PCR方法在小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和兔中未检出念珠状链杆菌;检出普通级长爪沙鼠和树鼩中念珠状链杆菌的阳性率分别为1.5%(1/65)和61.7%(37/60)。结论 本研究所建立的念珠状链杆菌Taqman MGB荧光定量PCR检测方法, 能够对实验动物中念珠状链杆菌进行快速准确的检测, 敏感性优于国标方法, 为实验动物质量检测体系的完善奠定了基础。     

HBVDNA荧光定量PCR检测及临床意义

血清HBV-DNA浓度与乙型肝炎病毒感染的严重程度和传染性有关,可用于判断病情和预后,以及观察抗病毒药物的治疗效果.通常血清 HBV-DNA持续阳性超过6个月会转为慢性肝 炎.抗-HBc阳性患者血清HBV-DNA持续阳性常提示肝受损严重,50%以上抗-HBc阳性慢性活动性肝炎患者,经平均4.5年发展为肝硬化,常与HBV-DNA持续阳性有关.     

荧光定量PCR在乙肝检测中的应用

目的 :探讨 5‘ -核酸酶法荧光定量技术在乙肝检测中应用状况。方法 :采用荧光定量PCR方法 ,检测2 0份阳性对照考核批内及批间变异 ;采用 5 0份HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAg(+)的血清 ,结合肝功能及HBeAg滴度考核阳性率、病毒含量范围以反映病毒复制状况 ;对 5份本法检测阳性的标本 ,4℃保存 ,并隔日检测 ,确定最佳检测时间。结果 :批内CV为 4 1 % ,批间CV为 4 0 %。阳性标本为 4 6份 (92 % ) ,其中 4份肝功能正常 ;阴性标本为 4份 (8% ) ,其中 1份肝功能异常。病毒量有较大的变化范围 ,从 0 .1 1× 1 0 4～ 5 .1× 1 0 4CID/ml。阳性标本所测病毒量与HBeAg滴度相关系数为 0 .77。在 1 5d内隔日所测病毒量相近。结论 :本法应用于乙肝检测 ,有较好的特异性 ;定量结果能够反映病毒在体内的复制状况 ;病毒含量因患者而异 ;在严格操作条件下 ,本法有一定的重复性 ;正确保存标本时 ,在半月内均可以检测病毒     

荧光探针定量PCR技术

PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增,实现目的基因的检测。荧光探针定量PCR(FQ-PCR)是一种新的基因定量检测技术,国外文献多用“实时定量PCR(real time quantitative PCR)”或“TaqMan PCR(以美国PE公司商标命名)”。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针,巧妙地把核酸扩增(PCR)、杂交及光谱技术结合在一起,从而实现了对目的基因的准确定量检测,正发展成为临床实验诊断的常规技术。     

荧光实时定量PCR的研究进展

生物机体的生长、发育、衰老和病变通常由基因在不同阶段和部位的差异表达来决定。基因表达差异最终表现为蛋白质合成量上的差异,并在一定程度上决定细胞的激活、增殖、分化、病变和凋亡。定量mRNA表达是了解机体生长发育调控和病理病变机理的一个重要方面,因此准确定量mRNA表达成为了生物医学研究中的一个重要内容。     

荧光定量PCR检测 HBV-DNA的临床意义

目的了解荧光定量PCR法检测的HBV-DNA与乙型肝炎,标志物的关系,探讨荧光定量PCR在HBV-DNA检测方面的临床价值。方法采用荧光定量PCR技术对乙肝标志物阳性血清进行HBV-DNA定量测定,对26例HBV-DNA( )(拷贝数105～109/ml)、HBeAg( )(≥10.86NCU/ml)患者贺普丁治疗前后血清HBV-DNA、HBeAg进行定量监测。结果①108例HBsAg( )/HBeAg( )/HBcAb( )者有106例HBV-DNA阳性,阳性率98%,含量为(7.65±1.06)拷贝/ml;112例HBsAg( )/HBeAb( )/HBcAb( )者有58例阳性,阳性率为51%,含量为(5.38±1.55)拷贝/ml;46例HBsAg( )/HBcAb( )者有17例阳性,阳性率36%,含量为(4.09±1.79)拷贝/ml。②HBV-DNA基因拷贝数与HBeAg水平呈正相关。③26例HBeAg( )、HBV-DNA( )患者经12个月治疗,HBeAg阴转率为42%,HBV-DNA( )阴转率为80%,明显高于HBeAg阴转率(P<0.01)。结论荧光定量PCR检测HBV-DNA,能直接反映HBV-DNA含量,在判断体内HBV是否复制,复制程度,是否被清除等方面明显优于HBV血清标志物检测,对抗病毒治疗过程监测、愈否监控以及疗效评价具有一定的实用价值。     

荧光定量PCR技术测定HBV-DNA与乙肝血清学标志分析比较

最近的研究表明 ,利用荧光定量ＰＣＲ技术[1] 检测乙型肝炎病毒核酸含量是临床预测干扰素、拉米呋啶治疗是否有效的重要指标[2 ] 。也是乙肝病毒感染、复制、传染最直接的证据。乙型肝炎病毒血清学标志物[3] 是临床分析和判断患者病程和传染性的传统依据之一。为了进一步分析乙肝病毒核酸与标志物之间的关系 ,本文对 181份血清进行了检测。现将结果报告如下。1　材料1.1　标本　标本均来自本院门诊及住院患者 ,空腹采集静脉血 3ｍｌ,离心分离血清后置 - 2 0℃保存 ,并于 1周内检测。其中男 145例 ,女 36例 ,男女比例 4∶1;年龄 18～ 74岁 ,…     

结核分枝杆菌自身淬灭探针荧光定量PCR检测方法的建立

目的利用自身淬灭探针技术建立敏感、特异、快速、价廉且能广泛应用的结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法。方法构建重组质粒PET-32a（＋）-16srRNA作为标准品,自行设计自身淬灭探针,建立、优化定量PCR体系。并进行方法学评价及临床应用。结果所建立方法的线性检测范围为102～109copies／μL,灵敏度为lcopy／μL,特异性为100％。高拷贝样品的天问CV为2．65％、批内CV为1．86％,低拷贝样品的天间CV为2．12％、批内CV为0．78％。该方法比培养方法更快速、灵敏。结论以自身淬灭探针技术为平台的结核分枝杆菌荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,对结核病的早期快速诊断有较高价值。     

鼠痘病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的 建立鼠痘病毒的荧光定量PCR检测方法,以期能快速、准确、灵敏、特异的检出鼠痘病毒。方法 经过比对和筛选,本研究选取鼠痘病毒的ERPV_027基因480-800位序列段,作为引物设计位点设计引物和探针,并对该引物对和探针的特异性、灵敏性、稳定性和重复性进行检测。结果 本研究建立的方法,对鼠痘病毒的检测极限是68.8copies/μl;该方法特异性强,只对鼠痘病毒特定片段进行特异性扩增,而对小鼠肝炎病毒、仙台病毒、沙门氏菌等其它病毒、细菌无扩增;该方法稳定性和重复性均较好。结论 本研究成功建立了检测鼠痘病毒的荧光定量PCR方法,该方法特异性强、灵敏度高,且具有较好的稳定性和重复性,具有广阔的应用价值。     

荧光定量PCR法和基因芯片分型法检测人乳头瘤病毒应用对照研究

目的:探讨荧光定量PCR法和基因芯片分型法对人乳头瘤病毒(HPV)的各自检测效果。方法:选择生殖系病变患者208例,采集其病变组织进行冻存,使用基因芯片分型法进行HPV的检查,并同时对使用基因芯片分型法检查阳性的182例患者的分泌物使用荧光定量PCR法对HPV16,18型进行检测。结果:使用基因芯片分型法检查出的HPV阳性率为87.5%,荧光定量法对HPV18,18型的阳性检查率为79.67%,具有统计学差异;阳性检出率均以22～40岁的患者最多,且在宫颈癌患者中的阳性检出率最高。结论:基因芯片检查法对HPV具有高度的敏感性,荧光定量PCR法对HPV的敏感度较基因芯片检查法低。HPV阳性多发生于22～40岁及宫颈癌患者。     

鸭乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR方法的建立及应用

目的：建立鸭乙型肝炎病毒核酸(DHBV DNA)荧光定量的方法。方法：根据DHBV DNAS基因区的序列设计扩增所需3条引物，通过偶联反应用AmpliSensor荧光信号标记半巢式引物，经过前期不对称扩增、半巢式扩增及在线检测建立DHBV DNA阳性标准品QPCR的标准曲线，并将70份鸭血清分别用荧光定量PCR方法和地高辛标记的DHBV DNA探针斑点杂交的方法检测，比较结果的相关性。结果：DHBV DNA阳性标准品经过30次循环后，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可以看出有180bp、70bp两个片段，与设计的片段大小相符，扩增产物的浓度与标准品的起始浓度成正比，扩增指数的数值大小与该循环时己合成的扩增产物的量成正比，起始浓度的大小与要合成的一定扩增产物的量所需的循环次数成反比。用荧定量PCR方法和斑点杂交的方法检测血清中DHBV DNA的结果有良好的相关性(r＝0．97，P＜0.01，ν＝58)。结论：荧光定量PCR方法可作为检测DHBV DNA含量的一个重要手段。     

荧光定量PCR检测结核分枝杆菌

目的比较荧光定量PCR与抗酸染色、结核抗体检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性,评价荧光定量PCR检测临床标本中结核杆菌的应用价值。方法对48例临床确诊的结核病患者和21例非结核呼吸系统疾病患者的痰标本应用荧光定量PCR法和痰涂片抗酸染色法检测,并分离患者外周血血清检测结核抗体,对3种检测方法的结果进行分析比较。结果抗酸染色法检测结核杆菌阳性率为22.9%,特异性为100%;血清结核抗体检测阳性率为77.1%特异性为85.7%;荧光定量PCR检测阳性率为52.1%,特异性为100%。结论荧光定量PCR是一种快速、防污染、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,在临床上有重要应用价值。     

荧光定量PCR分析胎儿脐带血中HBV的含量

目的 研究乙型肝炎病毒携带通过母婴垂直传播的概率和能量。方法用荧光定量PCR定量分析携带乙型肝炎病毒的分娩母亲和婴儿脐带血中HBV的病毒载量。结果通过荧光定量PCR定量分析母亲血液中HBV的含量显性的高于婴儿脐带血，但在婴儿脐带血中能够检出HBV的最低检出含量。结论乙型肝炎携带母亲能够通过胎盘垂直传播给婴儿，但婴儿体内的病毒含量显低于母亲，实验证实母婴垂直传播是乙型肝炎的传播途径之一。     

FQ-PCR检测乙型肝炎病毒DNA的临床价值

目的探讨荧光定量PCR(FQ-PCR)检测HBV-DNA的应用价值。方法从1000份用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙肝五项的体格检查血清标本中,抽取288份HBsAg阳性标本及100份全阴标本,进行荧光定量聚合酶链式反应HBV-DNA定量分析。结果经FQ-PCR检测,80份HBsAg、HBeAg、HBcAb均阳性的标本,HBV-DNA阳性率为100%(80/80),平均HBV-DNA拷贝数为2.5×108拷贝/m l;164份HBsAg、HBeAb、HBcAb均阳性的标本,HBV-DNA阳性率为76.2%(125/164),平均HBV-DNA拷贝数为1.5×106拷贝/m l;12份HBsAg单项阳性的标本,HBV-DNA的阳性率为83.3%(10/12),平均HBV-DNA拷贝数为1.6×105拷贝/m l;100份HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb均阴性的标本,HBV-DNA的阳性率为2.0%(2/100),平均HBV-DNA拷贝数为4.5×105拷贝/m l。结论FQ-PCR可以检测HBV的感染和复制情况,对准确报告HBV感染、指导其选择治疗方案和观察疗效具有重要的临床意义。     

结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的建立结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测方法，探讨荧光PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法根据结核分枝杆菌基因保守序列设计引物和探针，并构建标准品。对102例培养涂阳的结核痰液标本和45例非结核感染者的痰标本，应用荧光定量PCR法、痰涂片抗酸染色法检测结核分枝杆菌。结果荧光定量PCR、抗酸染色法检测结核分枝杆菌的特异性分别为100％、30％。结论荧光定量PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法，具有重要的应用价值。     

实时荧光定量PCR技术诊断肺结核的meta分析

目的系统评价实时荧光定量PCR技术对肺结核的诊断价值并作meta分析。方法检索Pubmed,EMBASE,BIOSIS,Web of Science以及维普、万方、中国知网、中国医学生物文献数据库。按照Cochrane协作网推荐的诊断试验纳入标准筛选文献,纳入的文献采用QUADAS进行质量评价,用MetaDisc 1.4进行meta分析。结果符合标准的共有21个研究,各研究间存在异质性,但不存在阈值效应。合并后的诊断优势比为105.32,敏感度为0.64,特异度为0.96,阳性似然比为19.79,阴性似然比为0.31。SROC曲线的AUC面积为0.9816,Q＊指数为0.9402。结论荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌有着较高的敏感性和很强的特异性,可作为临床肺结核诊断的重要辅助手段,但并不能完全取代痰涂片检查。     

荧光定量PCR技术检测生殖道人乳头瘤病毒6,11型结果分析

目的:了解人乳头瘤病毒6,11型(HPV6,11)的检出情况。方法:采用荧光定量PCR法对125例患者进行HPV6,11 DNA定量检测。结果:HPV6,11阳性率为32.00%(44/125);男性和女性阳性率分别为62.50%和6.56%;21～40岁年龄段患者占90.91%;2009年、2010年和2011年阳性检出率分别为55.56%、40.00%和27.78%,有下降趋势。结论:加强患者人乳头瘤病毒6,11型的检测,对其防治有重要意义。