HDAC8过表达慢病毒载体构建、转染及表达的研究

目的:构建大鼠组蛋白去乙酰基转移酶(histone deacetylase 8,HDAC8)基因过表达的慢病毒载体,转染大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)后观察HDAC8的表达。方法:采用DNA重组技术将HDAC8基因插入到慢病毒表达载体质粒pGC-FU中,重组获得慢病毒载体pGC-FU-HDAC8。重组慢病毒载体经过测序鉴定后,转染293T细胞生产病毒液,用得到的病毒液转染大鼠BMSCs,实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法分析转染前后HDAC8表达情况。结果:测序结果证实HDAC8基因正确插入载体中,成功构建大鼠HDAC8基因过表达载体。大鼠BMSCs转染后HDAC8 mRNA及蛋白表达显著上调。结论:针对大鼠HDAC8基因过表达慢病毒载体构建成功,并能有效增强BMSCs中HDAC8基因的表达。     

bFGF真核表达载体的构建及骨髓基质细胞转染

目的：探讨bFGF基因转染骨髓基质干细胞的方法及可行性。方法：构建bFGF基因真核表达质粒,用脂质体法介导转染骨髓基质细胞,通过免疫组织化学、RT-PCR及Western blot方法检测bFGF基因转染骨髓基质细胞的成功性。结果：bFGF基因成功转染大鼠骨髓基质细胞,并能持续稳定地分泌bFGF蛋白。结论：bFGF基因可以转染骨髓基质细胞,并能在骨髓基质细胞内稳定表达。     

pIRES2-EGFP-IGF-1真核表达载体转染骨髓基质细胞的动物实验

目的构建表达胰岛素样生长因子1（IGF-1）的骨髓基质细胞（MSC）的动物模型，为进一步将其用于修复牙周组织缺损奠定基础。方法将真核表达载体pIRES2-EGFP—IGF-1转染MSC，获得阳性细胞克隆，免疫组化、Western blot鉴定IGF-1蛋白表达水平，ELISA方法检测转染细胞上清液中IGF-1蛋白含量；用转染细胞上清液培养牙周膜细胞（PDLC），甲基噻唑基四唑（MTT）法检测对细胞增殖的影响。结果免疫组化和Westernblot结果证实，转染细胞内有IGF-1蛋白的高表达。ELISA方法检测显示，IGF-1能分泌至细胞外，且能明显促进PDLC的增殖。结论IGF-1基因可成功     

构建过表达hBMP-7基因重组腺病毒及体外转染犬骨髓基质细胞的研究

目的：构建携带人骨形态发生蛋白7（hBMP-7）基因的重组腺病毒载体,体外转染犬骨髓基质干细胞（dMSCs）,检测hBMP-7的表达。方法：利用AdEasy腺病毒表达系统,体外构建高效表达hBMP-7重组腺病毒载体,酶切电泳鉴定后体外转染dMSCs,检测转染情况及目的基因的表达。结果：酶切鉴定表明pAd-hBMP-7已成功构建,体外可高效转染dMSCs,RT-PCR方法及免疫细胞化学检测表明hBMP-7可在dMSCs中表达。结论：成功克隆hBMP-7基因并构建重组腺病毒表达载体,证实了其在dMSCs中的表达,为火器伤致颌骨缺损的早期局部基因治疗打下基础。     

Satb2过表达对牙髓干细胞增殖和迁移能力的影响

目的:通过慢病毒介导Satb2(special AT-rich binding protein 2,Satb2)感染人牙髓干细胞(human Dental pulp stem cells,hDPSCs),观察Satb2过表达对人牙髓干细胞迁移和增殖能力的影响。方法:构建Satb2过表达慢病毒感染人牙髓干细胞,通过筛选得到稳定过表达Satb2细胞克隆。CCK8实验检测过表达Satb2对人牙髓干细胞的增殖能力的影响。划痕实验和Transwell细胞迁移实验观察细胞迁移能力的变化。免疫荧光染色观察细胞骨架微管的变化。结果:过表达Satb2的人牙髓干细胞相比对照组增殖能力增强(P＜0.05),微管更粗大,细胞的迁移能力增强。结论:过表达Satb2能使人牙髓干细胞的增殖和迁移能力增强。     

骨髓基质细胞中Von Hippel-Lindau基因的siRNA表达载体构建及其检测

目的:构建骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells BMSCs)中Von Hippel-Lindau(VHL)基因的siRNA表达载体并检测其对BMSCs细胞中VHL基因的干扰作用.方法:根据犬的VHL基因序列设计并合成4对siRNA oligo,然后用载体构建试剂盒进行重组克隆,将4对双链的siRNA oligo分别插人到siRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4个siRNA表达质粒(SR144-1,SR144-2,SR144-3,SR144-4).用载体通用引物进行菌落PCR筛选,筛选得到的阳性克隆进行测序,以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的oligo序列一致.干扰载体瞬时转染BMSCs,通过qPCR和Westerm印迹分别检测干扰载体对目的基因的沉默效果.为了提高转染效率及VHL基因的沉默效果,对SR144-4进行慢病毒干扰载体(pLenti-mi-VHL)构建.结果:通过对构建质粒克隆进行测序,证实重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列一致.转染BMSCs细胞24h和48h后分别用qPCR与Western印迹检测,显示SR144-4干扰效果最理想.通过测序结果比对,插入序列完全正确.pLenti-mi-VHL构建成功.结论:成功构建了BMSCS的siRNA-VHL表达载体,为进一步实验研究奠定了基础.     

骨髓基质细胞与骨骼疾病的关系

骨髓基质细胞是指从骨髓中分离出来后,在体外长期的细胞培养中能够附着生长的、非造血系统源的细胞。它具有多种分化潜能,是一种基质干细胞。骨髓基质细胞与骨的形成密切相关,对其研究不但可以深入地了解骨代谢机制和骨内稳定的机理,并对骨疾病的基因治疗以及口腔疾病的防治均有裨益。     

microRNA-223过表达与抑制表达 慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建 microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,并验证其过表达或抑制表达microRNA-223的效率。方法 设计针对microRNA-223前体的过表达基因片段及针对microRNA-223成熟体的反义片段,应用聚合酶链反应（PCR）调取目的基因及通过退火反应获得双链DNA寡聚核苷酸片段。并通过基因重组技术将目的 基因片段及反义片段分别克隆到GV229及GV232慢病毒载体中,进行PCR鉴定及DNA测序比对分析,构建相应的 microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体。利用荧光定量PCR法检测microRNA-223表达水平。结果 对阳性克隆进行PCR鉴定及DNA测序证明,microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体构建成功。microRNA-223过表达慢病毒载体能显著提高细胞中microRNA-223表达水平,microRNA-223抑制表达慢病毒载体能明显抑制细胞中microRNA-223表达水平。结论 成功构建microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,为进一步研究microRNA-223对口腔癌发生发展的影响及其机制提供了稳定的细胞转染载体。     

特殊富含AT序列结合蛋白-2的生物学特性

特殊富含AT序列结合蛋白(SATB)-2是一种核基质蛋白,在颅面部发育和成骨细胞分化方面起着重要的作用.本文就SATB-2的分子生物学特点、作用以及在牙周病治疗中的展望作一综述.     

骨髓基质干细胞诱导内皮细胞与自体骨髓基质干细胞低氧条件下培养后的成骨能力

目的:探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导内皮细胞(ECs)与自体BMSCs低氧条件下联合培养对BMSCs成骨能力的影响.方法:体外分离培养兔BMSCs并向ECs诱导培养,用CD34免疫细胞化学染色鉴定内皮细胞表型:实验分组为BMSCs常氧成骨诱导培养组,BMSCs低氧成骨诱导培养组,BMSCs+ ECs常氧成骨诱导联合培养组BMSCs+ECs低氧成骨诱导联合培养组,持续培养7d,前6d应用PNPP法每天固定时间测定碱性磷酸酶(ALP)活性并作统计学分析;茜素红染色观察第7d矿化结节形成情况.低氧组为1.0％O2浓度.采用SPSS11.0软件包对数据进行方差分析和q检验.结果:BMSCs在一定诱导条件下可诱导为ECs,CD34免疫细胞化学染色为阳性;统计学分析表明,BMSCs+ ECs低氧成骨诱导联合培养组的ALP活性表达显著高于其他3组(P＜0.05).只有BMSCs+ ECs低氧成骨诱导联合培养组有钙化结节形成,茜素红染色呈橘红色.结论:在一定时间内,由BMSCs诱导来源的ECs与自体BMSCs低氧条件下联合培养,BMSCs的成骨活性可显著提高.     

富含血小板的血浆(PRP)促进骨髓基质细胞DNA合成的实验研究

目的 探讨富含血小板的血浆（PRP）对骨髓基质细胞DNA合成和细胞周期变化的影响。方法 以贴壁筛选法分离、培养狗的骨髓基质细胞，应用流式细胞仪观察PRP对骨髓基质细胞DNA合成和细胞周期变化的影响；通过透射电镜观察细胞的超微结构改变。结果 PRP对培养48小时的骨髓基质细胞S期的DNA含量明显增高，并促使细胞内线粒体更丰富，粗面内质网增多。结论 PRP可通过刺激骨髓基质细胞的DNA合成，促进其分裂、增殖及细胞的合成分泌。     

骨保护素修饰的Beagle犬骨髓基质细胞表达体系的建立与鉴定

目的利用pSecTag2/B-OPG真核分泌表达穿梭载体,建立经骨保护素基因（OPG）修饰的Beagle犬骨髓基质细胞（BMSC）瞬时表达体系并检测其表达能力,为基因工程与组织工程联合治疗牙周病提供细胞基础。方法体外分离、培养Beagle犬BMSC,通过脂质体法将已鉴定的目的基因瞬时转染至BMSC,并用RT-PCR鉴定OPG是否有录,同时通过Western blot方法检测OPG在6周内的表达水平。结果重组质粒pSecTag2/B-OPG经HindⅢ单酶切及EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切,电泳显示切下的片段均与预期大小相符,经测序证实此基因与GeneBank中[gi：33878056]提供的序列一致;鉴定正确的重组质粒在BMSC中有转录,并且在39 d内都明显有OPG表达。结论建立了骨保护素基因修饰的骨髓基质细胞瞬时表达体系。     

腺病毒介导的骨形成蛋白-2基因修饰促进羊骨髓基质细胞成骨分化的实验研究

目的研究腺病毒介导的骨形成蛋白-2(AdBMP-2)基因转染对羊骨髓基质细胞生长、成骨分化的影响。方法抽取成年健康山羊骨髓,以贴壁培养法培养骨髓基质细胞。以AdBMP-2基因转染体外培养的羊骨髓基质细胞,倒置显微镜观察,计算基因转染效率,绘制细胞生长曲线,并行碱性磷酸酶染色及骨钙素定量分析。采用SAS6.2统计软件包对数据进行SNK法分析。结果细胞转染率达70%±3%,转染目的基因的细胞胞体肥大,呈多边形。生长曲线在AdBMP-2基因转染组、LacZ基因转染组和空白对照组之间无显著差别。目的基因转染后12d,碱性磷酸酶阳性染色面积较对照组增加。转染目的基因后6d,骨钙素含量显著增高,与对照组相比有统计学差异(P<0.01)。结论AdBMP-2基因转染促进了体外培养的骨髓基质细胞向成骨细胞表型转化,可望成为颌骨缺损修复的新型种子细胞。     

神经生长因子对骨髓基质细胞成骨活性的影响

目的 探讨神经生长因子（nerve growth factor,NGF）对骨髓基质细胞成骨活性的影响.方法 原代培养SD大鼠四肢骨骨髓源性骨髓基质细胞.通过检测细胞增殖、定量检测碱性磷酸酶的表达及茜素红矿化结节染色,观察NGF对骨髓基质细胞增殖及成骨活性的影响.结果 实验组与对照组细胞增殖无统计学差异,NGF对骨髓基质细胞增殖无促进作用.第3天时,实验组细胞分化及碱性磷酸酶的表达高于对照组（P＜0.05）.钙结节茜素红染色及钙结节量实验组大于对照组.结论 NGF可直接促进骨髓基质细胞的成骨向转化及矿化作用,对细胞增殖无促进作用.     

应用骨髓基质细胞片层构建组织工程骨的实验研究

目的 应用犬骨髓基质细胞片层构建组织工程骨,为临床提供组织工程骨来源.方法 分离培养传代犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell,BMSC).将经成骨诱导的第3代BMSC接种于温度反应性培养皿中,制备BMSC细胞片层.制备犬同种异体脱钙骨基质(decalcification bone matrixes,DBM).实验用16只犬分为4组,每组4只,采用自身对照.将复合体BMSC片层-人重组骨形态生成蛋白2( rhBMP-2) -BMSC-DBM植入犬左侧背阔肌肌筋膜下为实验侧,同法右侧植入DBM-rhBMP-2-BMSC为对照侧.术后4、8、12、16周取材行组织学观察,评价体内异位成骨的情况.结果 实验侧成骨优于对照侧,成骨面积实验侧＞对照侧,两侧差异有统计学意义(P＜0.05).术后16周,实验侧板层骨连接成片,可见骨单位,骨髓腔内可见红骨髓.结论 BMSC细胞片层可促进功能性组织工程骨的形成.     

实时定量PCR检测Nel样Ⅰ型分子基因对大鼠骨髓基质细胞成骨相关基因表达的影响

目的：研究Nel—like 1型分子（Nell-1）基因对体外培养大鼠骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,bMSCs）成骨相关基因表达的影响。方法：取6周龄雄性Fischer 344大鼠胫骨和股骨骨髓体外培养。以腺病毒为载体。进行基因转染，绘制生长曲线并测定转染效率。以转染β-半乳糖苷酶（β—Galactosidase，LacZ）基因的bMSCs为对照组，转染Nell-1的bMSCs为试验组，用实时定量PCR（real—timePCR）测定成骨相关基因碱性磷酸酶基因（alkaline phosphatase，ALP）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、骨钙素（osteocalcin，OC）、骨桥蛋白（osteopontin，OP）和Sox9的表达。以2^-△△CT法计算基因表达的相对比值。结果：随着Nell-1基因转染滴度的增高。细胞增殖速度减慢。基因转染效率随滴度增加而增高。Nell-1基因转染大鼠bMSCs．早期下调、中期和晚期上调ALP的表达。晚期上调OC的表达,整个成骨周期中均上调OP和BSP的表达。结论：Nell-1基因可能通过影响各成骨相关基因的表达而促进大鼠bMSCs的成骨分化。