E2F3基因沉默载体pRNAT-U6.1-siE2F3/Neo的构建及表达

【目的】构建针对E2F3基因的shRNA表达载体,通过脂质体进行膀胱癌细胞内转染,监测转染效率。【方法】通过软件设计针对E2F3基因的寡核苷酸链,化学合成一对编码短发夹RNA序列,长度为64个碱基。核苷酸链经退火,克隆到经BamHI、HindⅢ双酶切的pRNAT-U6.1/Neo载体上,构建针对E2F3基因的RNA干扰质粒。通过双酶切、PCR鉴定及基因片段序列分析验证构建效果。通过不同浓度的Lipofectamin 2000及干扰质粒混合物进行膀胱癌细胞系5637细胞转染,通过绿色荧光的表达程度摸索出细胞最佳转染浓度及转染时间。【结果】重组构建的pRNAT-U6.1-siE2F3/Neo载体经PCR分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。Lipofectamin 2000能够有效的进行pRNAT-U6.1-siE2F3/Neo质粒的转染。【结论】载体的成功构建及膀胱癌细胞系的高效转染,为进一步研究E2F3基因在膀胱肿瘤中的功能奠定基础。     

人类错配修复基因hMLH1和hMSH2错义突变真核表达载体的构建及表达

目的 构建人类错配修复基因hMLH1和hMSH2错义突变真核表达载体并检测它们在瞬时转染细胞中的蛋白表达.方法 重组pcDNA3.1-hMLH1-wt和pcDNA3.1-hMSH2-wt质粒为模板,用定点诱变的方法分别构建hMLH1基因和hMSH2基因错义突变真核表达载体,将诱变前后的重组质粒瞬时转染至HCT-116细胞(hMLh1基因缺陷型)或LoVo细胞(hMSH2基因缺陷型)中,免疫印迹法和免疫荧光法分别检测这两种基因在各自的转染细胞中的蛋白表达.结果 测序证实,定点突变成功,构建出hMLH1基因错义突变pcDNA3.1-hMLH1-T117M和pcDNA3.1-hMLH1-V384D真核表达载体以及hMSH2基因错义突变pcDNA3.1-hMSH2-L390F、pcDNA3.1-hMSH2-Q419K和pcDNA3.1-hMSH2-Q629R真核表达载体.结果 表明转染后,除hMLH1-T117M突变体蛋白表达缺失外,其余的野生型及突变型真核表达载体在转染细胞中均能表达相应的蛋白.结论 成功构建了在人的肿瘤细胞系中能有效表达的两种hMLH1基因错义突变和三种hMSH2基因错义突变的真核表达载体,为进一步研究这些错义突变的病因学作用和功能意义奠定了实验基础.     

肿瘤细胞内特异表达TRAIL载体的构建及其在喉癌细胞株Hepa2中的表达

目的: 克隆人可溶性TRAIL(sTRAIL)基因并构建肿瘤细胞特异性真核表达载体,为肿瘤基因治疗的靶向性奠定实验基础. 方法: 提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区的融合基因,克隆入真核表达载体pGL3-181 hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建可分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL3-181 hTERT /TRAIL.用Western Blotting鉴定喉癌细胞株Hepa2中表达产物.结果: RT-PCR扩增得到了613 bp的cDNA片段.经酶切及测序鉴定,与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致,成功构建了肿瘤特异性高效分泌表达可溶性人TRAIL的重组真核表达载体pGL3-181hTERT /TRAIL.Western Blotting结果显示,获得的瞬时转染TRAIL在喉癌Hepa2肿瘤细胞中能有效表达.结论: 重组真核表达载体pGL3/TRAIL的成功构建,为肿瘤基因治疗的靶向性提供了可行的理想工具.     

重组人肿瘤抑素分泌型真核表达载体的构建及其表达

目的 构建重组人肿瘤抑素分泌型真核表达载体并检测其在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达.方法 以人胚肾293细胞为材料,提取总RNA,用RT-PCR方法合成人tumstatin cDNA,将该cDNA克隆到pGEM-T载体获得重组质粒pGEM-T/tumstatin.以pGEM-T/tumstatin为模板扩增含Ⅳ型胶原信号肽sig基因的sig-tumstatin基因片段,sig-tumstatin 片段经酶切后,插入经同样酶切的pIRESneo3质粒,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的sig-tum-statin基因片段及重组载体进行验证.将重组sig-tumstatin 真核表达载体转染到CHO-K1对其表达状况进行检测.结果 所获得的sig-tumstatin片段(822 bp)序列与报道的序列完全一致.酶切鉴定的结果表明含重组人肿瘤抑素的pIRESneo3/sig-tumstatin表达载体构建成功.转染重组pIRESneo3/sig-tumstatin的CHO-K1分泌表达了重组人tum-statin.另外,从生长曲线结果来看,转染了 pIRESneo3/sig-tumstatin真核表达载体和空载体的CHO-K1比未转染的CHO-K1细胞的生长速度要慢一些.结论 成功地构建了重组人tumstatin分泌型真核表达载体并获得能稳定表达tumstatin的CHO-K1,为开展下一步的实验奠定了基础.     

人p27kip1基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆人p27kipl,基因并构建其真核表达载体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 根据p27kip1已知序列设计引物,分别在上下游引入Mlu I和Spe I酶切位点,从人肾脏组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到cDNA,亚克隆入携带GFP报告基因的pWPXL真核载体中,经筛选获得正确的克隆,并通过双酶切凝胶电泳及测序鉴定.将成功构建的质粒在脂质体介导下转染肾癌786-0细胞,并通过RT-PCR及Western-blot检测表达情况.结果 克隆了人p27kip1基因,与GenBank中序列比对无误;真核表达载体经酶切鉴定表明为正确重组子,成功构建了真核表达载体.转染肾癌786-0细胞48 h后,p27kip1蛋白出现高表达.结论 成功克隆了p27kip1基因,构建了其真核表达载体并在肾癌细胞中成功表达,为p27kip1在肾肿瘤中的进一步研究提供了工作基础.     

重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α分泌型真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的构建重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α的分泌型真核表达载体并检测其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的稳定表达。方法以人胚肾293细胞为材料,提取总RNA,用RT-PCR方法合成人tumstatin cDNA,将该cDNA克隆到pGEM-T载体获得重组质粒pGEM-T/tumstatin。利用PCR从pGEM-T/tumstatin和PBV220-TNF-α载体中分别扩增出sig-tumstatin-linker和linker-TNF片段,将其克隆得到sig-tumstatin-linker-TNF片段,sig-tumstatin-linker-TNF片段经酶切后,插入经同样酶切pIRESneo3质粒,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的sig-tumstatin-linker-TNF基因片段及重组载体进行验证。将重组sig-tumstatin-linker-TNF真核表达载体转染到CHO-K1对其表达状况进行检测。结果所获得的sig-tumstatin-linker-TNF片段(1.32kb)序列与报道的序列完全一致。酶切鉴定的结果表明含肿瘤抑素基因的重组pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF表达载体构建成功。转染重组pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF的CHO-K1表达了肿瘤抑素融合蛋白tumstatin-linker-TNF。从生长曲线结果来看,转染pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF真核表达载体和转染pIRESneo3的CHO-K1比未转染的CHO-K1细胞的生长速度要慢。结论成功地构建了重组人肿瘤抑素融合蛋白的真核表达载体,并获得能稳定表达人肿瘤抑素融合蛋白的CHO-K1。     

靶向性重组TRAIL基因诱导人黑色素瘤细胞株A375凋亡的效应

目的研究TRAIL基因结合端粒酶启动子特异性靶向治疗的作用。方法刺激人外周血淋巴细胞增殖,提取总DNA。采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL功能区的融合基因,克隆入pGL3-181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL。将该重组载体经阳离子脂质体转染入人黑色素瘤细胞株A375中,以台盼蓝拒染法和电镜下细胞形态变化,观察转染的A375细胞的凋亡。结果构建了肿瘤人可溶性TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL,其表达产物能诱导人黑色素瘤细胞株A375凋亡。结论成功地构建了重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL,为肿瘤的基因靶向治疗提供了可能性。     

肝细胞生长因子基因转染对淋巴瘤细胞的生物学效应

目的:克隆肝细胞生长因子(HGF)基因,构建重组真核表达载体,并观察HGF基因转染对Raji细胞的生物学效应.方法:从人肝组织中提取总RNA,反转录后行PCR获得HGF基因cDNA,与载体pVITRO2-mcs构建重组真核表达载体,转染Raji细胞.行潮霉素B筛选,连续传代,采用实时荧光定量PCR、ELISA和细胞免疫组化及半固体培养等方法,观察HGF基因转染后的表达与对Raji细胞生物学性状的影响.结果:成功克隆HGF基因并构建了重组真核表达载体pVITRO2-mcs-HGF.经RT-PCR证实HGF基因成功转染Raji细胞.HGF基因转染后可在Raji细胞稳定表达HGF mRNA和蛋白,且可促进其增殖和迁徙及侵袭.结论:HGF基因获成功克隆并构建了重组真核表达载体,转染Raji细胞后可稳定表达,并对其生物学性状具促进作用.     

大鼠Pdcd4基因真核载体的构建与表达

目的 构建大鼠程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4, Pdcd4)基因真核表达载体,为进一步研究该基因的功能提供条件。方法 提取E3大鼠肺组织总RNA,RT-PCR扩增大鼠Pdcd4基因全长cDNA;经过双酶切、连接等反应,构建pEGFP-C1-Pdcd4重组表达载体。将该载体转染大鼠巨噬细胞系NR8383细胞,通过RT-qPCR与Western blot法检测NR8383细胞Pdcd4基因的表达。结果 RT-PCR扩增的大鼠Pdcd4全长cDNA为1410bp;pEGFP-C1-Pdcd4重组真核表达载体中插入片段与NCBI GenBank文库中大鼠Pdcd4 cDNA的序列完全一致;倒置荧光显微镜下观察转染后NR8383细胞中绿色荧光蛋白的表达确定转染成功;RT-qPCR与Western blot法检测NR8383细胞中Pdcd4基因的表达水平明显上调。结论 成功构建pEGFP-C1-Pdcd4重组真核表达载体,为进一步研究Pdcd4基因的作用机制奠定基础。     

人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平。方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2cDNA片段,与pMD-18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2;将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2。应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照;用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2mRNA及蛋白表达水平。结果正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DNA Polδ2cDNA序列完全一致。RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组;Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性。结论人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功。     

人淋巴细胞趋化因子真核表达质粒的构建及其在细胞中的表达

目的构建人淋巴细胞趋化因子(human lymphotactin，hLpm)真核表达质粒，并在膀胱肿瘤细胞株BIU-87中的表达重组质粒。方法用RT—PCR法自活化的人外周血淋巴细胞扩增hLpm的含编码区序列的cDNA，克隆至pGM—T Easy T载体，测序正确后，将目的片段插入pcDNA3．1( )载体，获得阳性克隆pcD—NA3．1( )-hLpm，用脂质体将其转染BIU-87细胞，经G418筛选稳定表达克隆，用免疫荧光染色技术鉴定经筛选的克隆。结果克隆的cDNA序列与GenBank中U23772的序列编码区内第225位碱基不同．系同义突变；构建了真核重组表达载体pcDNA3．1( )-hLptn；筛选获得了稳定表达转染hLpm的BIU-87细胞株。结论成功构建的hLpm真核表述系统可在人膀胱肿瘤细胞株BIU-87中稳定表达，为研究hLpm基因介导的人膀胱肿瘤特异性主动免疫治疗奠定了基础。     

人肿瘤MUC1/Y基因真核表达载体的构建及在BIU-87细胞中的表达

目的:克隆人肿瘤MUC1/Y全长基因及构建真核表达载体 pEGFP MUC1/Y并观察 pEGFP MUC1/Y在 BIU 87细胞中表达以用于进一步生物学功能及肿瘤生物学治疗的研究。方法: 取新鲜膀胱肿瘤组织提取总RNA,采用随机引物进行反转录,将特异引物扩增的MUC1/Y全长 PCR产物克隆至真核表达载体 pEGFP C1,测序鉴定后命名为 pEGFP MUC1/Y,用脂质体转染膀胱肿瘤细胞BIU 87,以 Western Blot检测其表达情况。结果:酶切鉴定和序列分析证实构建质粒含人MUC1/Y全长cDNA编码序列, Western Blot检测和转染实验,表明构建的 pEGFP MUC1/Y基因在BIU 87真核细胞中表达,其绿色荧光蛋白瞬时表达率为 20%。结论:人肿瘤 MUC1/Y全长cDNA基因克隆及其真核表达载体 pEGFP MUC1/Y 构建成功,可用于肿瘤生物学治疗的研究。     

PTEN基因转染对人膀胱癌细胞BIU-87凋亡的影响

目的：研究外源性抑癌基因PTEN转染对人膀胱癌细胞系BIU-87凋亡的影响,探索膀胱癌基因治疗的新途径.方法：将携有PTEN基因的真核表达载体体外转染BIU-87细胞,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,用逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测PTEN的表达情况,应用细胞原位凋亡检测试剂盒和流式细胞仪分别研究PTEN基因转染前、后膀胱癌细胞凋亡的变化.结果：转染PTEN基因的膀胱癌细胞系BIU-87中PTEN mRNA能稳定表达,肿瘤细胞凋亡明显增多,与对照组比较有显著性差异.结论：转染外源性PTEN基因能显著诱导膀胱癌细胞凋亡,从而达到抑制肿瘤发生、发展的目的.     

CH50多肽在膀胱癌细胞系BIU-87中的表达和鉴定

目的：研究CHS0多肽真核表达载体pCH510体外转染膀胱癌细胞系BIU-87以及CHSO多肽的表达和鉴定。方法：以脂质体Lipofectimine^TM2000为介导，将pCH510质粒体外转染给BIU-87细胞，用免疫组化S-P法、Western Blot法鉴定CH50多肽的表达，RT—PCR法鉴定导入基因的表达。结果：转染pCH510质粒的BIU-87细胞明显阳性表达CH50多肽，对照组则不表达。结论：BIU-87细胞体外转染pCH510质粒后能表达CH50多肽，改变了癌细胞的黏附属性，为临床治疗膀胱癌提供了新的途径。     

转基因法建立膀胱癌多药耐药细胞株

目的:建立高效、稳定的人膀胱癌多药耐药性细胞模型。方法:采用基因重组技术构建真核表达载体pcDNA3.1( )/bcl-2,通过脂质体将人bcl-2基因转染膀胱癌细胞BIU-87,RT-PCR检测基因转录水平,应用MTT比色法进行耐药性检验。结果:酶切鉴定和基因测序证明真核表达载体pcDNA3.1( )/bcl-2构建成功;RT-PCR分析表明,转染bcl-2基因的BIU-87/bcl-2细胞的bcl-2基因表达水平较BIU-87细胞和转染空载体的BIU-87/neo细胞显著提高;与BIU-87细胞和BIU-87/neo细胞相比,BIU-87/bcl-2细胞具有较高的耐药性。结论:基因转染法是建立人膀胱癌多药耐药细胞模型的理想方法。     

人淋巴细胞趋化因子真核表达质粒的构建及体外转染的生物学活性测定

目的：构建人淋巴细胞趋化因子(HLptn)真核表达质粒，在膀胱肿瘤细胞株BIU-87中表达重组质粒，并检测趋化活性。方法：用RT-PCR法自活化的人外周血淋巴细胞扩增HLptn含编码区序列的cDNA，克隆至pGM-T Easy T载体，测序正确后，将目的片段插入pcDNA3．1( )载体，获得阳性克隆pcDNA3．1( )．HLptn；用脂质体介导其转染BIU-87细胞，用Western-blot检测转染后细胞中HLptn的表达；取转染后的上清液，采用Boyden小室法检测表达的HLptn趋化CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞的生物学活性。结果：克隆的cDNA序列与GenBank中U23772的序列编码区内第225位碱基不同，系同义突变，构建了真核重组表达载体pcDNA3．1( )-HLptn；转染的BIU-87细胞表达HLptn，其培养上清对CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞具有趋化活性。结论：成功构建的HLptn真核表达系统可在人膀胱肿瘤细胞株BIU-87中表达。     

RNA干扰沉默MTA1基因对膀胱癌细胞失巢凋亡的影响

目的： 观察RNA干扰沉默MTA1基因对膀胱癌细胞株BIU-87增殖和失巢凋亡的影响。方法： 构建针对MTA1基因的小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）,应用MTA1 siRNA转染处理人膀胱癌细胞株BIU-87后,分别采用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测MTA1基因mRNA和蛋白的表达,采用软琼脂集落培养试验检测锚着不依赖性增殖,琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测BIU-87细胞失巢凋亡。结果： 与对照组比较,MTA1 siRNA转染组MTA1 mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性（P<0.01）。MTA1 siRNA转染组软琼脂集落形成数明显减少,且与浓度相关（P<0.01）。琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术结果显示,MTA1 siRNA转染可诱导BIU-87细胞失巢凋亡,且与浓度相关（P<0.01）。结论： MTA1 siRNA可抑制膀胱癌细胞株BIU-87增殖,诱导失巢凋亡可能是其机制之一。     

Effects of Gene Tranfection with CH50 Polypeptide on the Invasion Ability of Bladder Cancer Cell Line BIU-87

Fibronectin(FN) ,a glycoprotein,possesses mul-tiple cell bioactivities such as influencing the cellularmorphology, controlling cellular migration,inducingcellular differentiation and affecting i mmune cell func-tions etc ,whichis closelyrelated withthe carcinogene-sis ,invasion and metastasis[1].CH50 polypeptide is composed of Cell I andHep II bifunctional-domain of human FN, main-tains the function of the original structure and doesnot formnovel function because of deletion of frag-ments a…     

沉默核糖核酸酶抑制因子促进膀胱癌BIU-87细胞生长和转移潜能

目的研究沉默核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因表达,对人膀胱癌BIU-87细胞增殖和侵袭能力及肿瘤生长的影响。方法通过用RI mRNA的特异性siRNA表达载体和无同源性的对照载体,在脂质体介导下稳定转染膀胱癌BIU-87细胞,通过筛选、鉴定后,用Am-blue法检测细胞增殖能力及用Western blot分析细胞中MMP-2和MMP-9的表达。将siRNA RI BIU-87(实验组)及对照组细胞皮下注射到BALB/c裸鼠中,观察肿瘤的生长和肿瘤微血管密度的变化,以及nm23-H1和E-cadherin在肿瘤中的表达。结果 RI基因表达下调显著增加了细胞的增殖,而且显著增强了MMP-2和MMP-9的表达。动物实验结果显示,实验组显著促进了肿瘤的生长(促瘤增长率31.85%),具有更大的瘤质量和更高的肿瘤微血管密度以及更低的nm23-H1和E-cadherin的表达。结论抑制RI基因的表达能显著提高膀胱癌细胞的生长和侵袭潜能,RI可能作为治疗膀胱癌的靶蛋白。     

人类乳头瘤病毒16 E7真核表达载体构建及对A431皮肤鳞癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 构建HPV16 E7(E7)真核表达载体,观察E7过表达对A431细胞增殖和侵袭的影响.方法 从Casld细胞中抽提总RNA,针对E7序列设计特异引物,进行逆转录和聚合酶链式反应扩增得到E7 cDNA.应用基因工程方法将得到的PCR片段克隆至真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点.重组质粒经双酶切鉴定和测序后,使用LipofectamaineTM2000转染A431细胞.Western blot检测E7在细胞中的表达.WST-1和Transwell系统分别检测细胞增殖和侵袭能力.流式细胞术检测转染前后细胞周期的变化.ELISA检测TGF-β分泌情况.结果 经酶切、测序鉴定,E7基因正确插入到pEGFP-N1多克隆位点,获得pEGFP-E7;Western blot检测结果显示:与未转染组相比,转染组E7蛋白高表达.过表达E7的A431细胞增殖和侵袭能力均显著增强,细胞周期中S期细胞数量增多,G1期细胞数量相对减少.TGF-β分泌增多.结论 E7过表达可改变细胞周期,提高皮肤鳞癌细胞的增殖和侵袭能力,而分泌增多的TGF-β并不能抑制肿瘤的增殖和侵袭.