NK/NKT细胞在乙型肝炎发病机制中的研究进展

自然杀伤细胞(NK/NKT细胞)参与机体的固有免疫应答.NK细胞在HBV感染的早期免疫应答中起到重要作用,而慢性乙型肝炎(CHB)患者NK细胞功能降低.另外,实验显示NKT细胞能抑制HBV复制并可致肝组织损伤.因此,通过调节NK/NKT细胞的功能治疗HBV感染将有可能成为一种新的策略.     

肿瘤患者外周血中NKT和NK细胞检测的临床应用

目的 分析肿瘤患者外周血中自然杀伤T(NKT)细胞数量变化,并与自然杀伤(NK)细胞比较,探讨血中这两种细胞水平的临床应用价值.方法 采用流式细胞术分析111例肿瘤患者血中这两种细胞含量,分为肠癌、膀胱癌和肝癌等9组,并与27例正常对照组比较,用SPSS 13.0软件统计分析.结果 化疗后肿瘤患者的血中NKT细胞含量较对照组高;NK细胞含量化疗后较化疗前低,接近正常对照组水平.不同类型肿瘤患者这两种细胞存在差异.乳腺癌患者的NKT水平和肠癌患者NK细胞水平较高.结论 肿瘤患者外周血中的NKT与NK细胞水平,在疗效监测上有重要临床价值.     

实验性矽肺大鼠外周血NK及NKT细胞动态变化及意义

[目的]研究实验性矽肺模型大鼠在染尘后的不同时间点外周血中自然杀伤细胞（NK）及自然杀伤T细胞（NKT）数量的变化,并探讨NK及NKT细胞与矽肺的相关性及临床意义。[方法]将48只健康雄性SD大鼠随机分成模型组和对照组,每组24只。模型组采用非暴露方式气管内一次性染尘（注入40mg／mL二氧化硅悬液1mL）建立大鼠矽肺模型,对照组采用相同方式气管内注入等量灭菌生理盐水。分别于染尘后第1、8、15、23、30、37天时处死模型组和对照组大鼠各4只,采集外周血,用流式细胞术检测大鼠外周血中NK（CD3-／CD161＋）及NKT（CD3＋／CD161＋）细胞的百分率。[结果]模型组外周血NK细胞的水平在试验早期（第1天）开始上升,高于对照组（P〈0．05）,第23天达到高峰（P〈0．01）;之后有所下降,但依然高于对照组（P〈0．05）。NKT细胞百分率在早期明显下降,后期慢慢回升,但仍低干对照组（P〈0．05）。[结论]石英诱发了机体的固有性免疫应答．NK及NKT细胞参与了矽肺变化发展过程。     

晚期血吸虫病患者外周血中Vα24自然杀伤T细胞水平观察

目的探讨晚期血吸虫病患者外周血中Vα24自然杀伤T细胞(NKT)水平及其与肝纤维化的关系。方法采用流式细胞术,检测41例晚期血吸虫病患者和48例健康体检者(对照组)外周血中的Vα24 NKT细胞占T淋巴细胞的比例;同时对晚期血吸虫病患者进行腹部超声检查,根据超声检查结果进行肝纤维化分级,比较各级间NKT细胞水平。结果 41例晚期血吸虫病患者的NKT细胞平均水平为(0.25±0.10)%,较健康对照组[(1.32±0.56)%]明显下降,差异有统计学意义(P0.01)。晚期血吸虫病患者肝纤维化越严重,NKT细胞减少越明显,1级、2级、3级患者NKT细胞水平分别为(0.38±0.03)%、(0.29±0.04)%、(0.16±0.03)%,各级患者比较差异均有统计学意义(P0.01)。结论晚期血吸虫病患者外周血中Vα24 NKT细胞水平明显下降,并随肝纤维化程度加重而减少,晚期血吸虫病患者发生及肝纤维化进展可能与Vα24 NKT细胞水平低下和/或功能缺陷有关。     

聚乙二醇干扰素治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者外周血NKT细胞的变化及疗效预测

目的研究聚乙二醇干扰素α 2a（Peg INFα 2a）治疗乙型肝炎e抗原（HBeAg）阳性慢性乙型肝炎（CHB）患者,其外周血NKT细胞表达率和疗效预测相关性。方法 选取 2010年1-12月在中南大学湘雅三医院住院和门诊接受治疗的HBeAg阳性CHB患者63例,予Peg INFα 2a 18 MIU肌内注射,1次/周,共48周。检测各时段外周血NKT数量占外周血T淋巴细胞的百分比、血清乙型肝炎5项定量及乙型肝炎病毒（HBV） DNA载量。结果Peg INFα 2a治疗HBeAg阳性CHB患者48周后,显效（完全病毒学应答）26例,有效（部分病毒学应答）21例,无效（无病毒学应答）16例。外周血NKT 细胞占T淋巴细胞百分比：显效组治疗前及治疗后4、8、12、16、24周,较有效组和无效组均明显升高（均P＜0.01）;在治疗48周和停药24周,显效组较有效组NKT表达水平明显升高（分别t=32.0,P＜0.01;t=27.6,P＜0.01）。显效组治疗后前4周,NKT表达水平上升速度最快,12周时达最高峰,其后逐渐下降,到24周比治疗前水平稍高,一直维持到48周;有效组12周时NKT表达水平达最高峰,较治疗前显著增高（t=12.83,P＜0.05）。显效组患者肝功能基本在12周左右完全恢复正常,且持续维持在正常水平,其HBV DNA载量亦逐步下降;而有效组和无效组患者的肝功能波动在（1～2）×ULN。监测至停药24周后,共有27例患者出现HBeAg血清学转换。结论Peg INFα 2a治疗HBeAg阳性CHB患者,其外周血中NKT的表达对疗效有一定预测作用。     

慢性乙型肝炎患者外周血e抗原滴度及病毒载量与T细胞亚群分布的关系

目的 分析慢性乙型肝炎患者HBeAg滴度及HBV DNA载量与T细胞亚群分布的关系.方法 选取苏州市第五人民医院2013年1-8月住院乙型肝炎患者87例为研究对象,50例健康体检者为正常对照,采用化学发光微粒子酶免疫法测定患者外周血血清中HBeAg滴度;采用实时荧光定量PCR法检测外周血HBV DNA;采用流式细胞术测定患者和对照外周血T细胞亚群数量.87例乙型肝炎患者,HBeAg阳性54例,阴性33例;HBV DNA阳性60例,阴性27例.54例HBeAg阳性患者根据HBeAg含量分成3组:HBeAg低滴度组、中滴度组和高滴度组.60例HBV DNA阳性患者根据病毒载量分成3组:HBV DNA低载量组、中载量组和高载量组.结果 HBeAg阳性组的CD3+和CD4+T细胞所占百分比分别为(60.36±6.62)％和(29.26±7.62)％,均低于对照组(t=8.95、7.19,P均＜0.05);CD8+T细胞所占百分比为(26.17±6.34)％,高于对照组的(23.70±4.53)％(t=-2.27,P＜0.05).不同HBV DNA载量组与正常对照组之间CD3+、CD4+和CD8+T细胞百分比的差异均有统计学意义(F=2.93、3.97和7.67,P均＜0.05).HBeAg阴性、HBeAg阳性与正常对照组之间CD3+、CD4+、CD8+T细胞所占百分比的差异均有统计学意义(F=30.68、22.86和3.31,P均＜0.05).结论 乙型肝炎患者的外周血HBeAg滴度及HBV DNA载量不同,其T细胞亚群分布也不同.测定T细胞亚群或可了解患者的免疫状态,为及时调节患者的免疫功能和抗病毒治疗的临床应用提供依据.     

乙型肝炎患者外周血单个核细胞中HBV DNA和HBVcccDNA定量检测

目的通过对外周血单个核细胞(PBMCs)中乙型肝炎病毒(HBV)DNA和HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的检测,证实不同临床类型乙型肝炎患者PBMCs被HBV感染的事实。方法提取PGM-HBV质粒,用双蒸水连续10倍梯度稀释,建立浓度为3×102~3×105拷贝/mL PGM-HBV标准系列;常规分离全血中的PB-MCs,提取DNA,应用实时荧光定量聚合酶链反应法检测PBMCs中HBV DNA和HBVcccDNA。结果78例慢性乙型肝炎患者,PBMCs中HBVcccDNA阳性31例(39.74%)。HBVcccDNA与血清和PBMCs中HBV DNA阳性率和滴度有良好的一致性。但在不同临床类型的乙型肝炎患者之间,PBMCs中HBVcccDNA的检出率无差别(P>0.05)。结论根据HBVcccDNA检测结果阳性,进一步证实HBV能感染PBMCs,并在其中复制;PBMCs中HBVcccDNA阳性与疾病的炎症活动和疾病的严重性无关。     

血清HBsAg和HBeAg定量检测对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者病毒学应答的预测价值

目的：探讨血清HBsAg和HBeAg定量检测对恩替卡韦治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者48周病毒学应答的预测价值。方法选取64例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者应用恩替卡韦0.5 mg/d抗病毒治疗48周,采用电化学发光微粒法检测基线及治疗后12周、24周血清HBsAg和HBeAg变化情况,分析其动态变化与治疗应答的相关性,应用ROC曲线比较预测疗效的价值,确定最佳临界值。结果64例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者随访48周有8例患者发生完全病毒学应答。24周HBeAg<9.25COI（OR=45.000,P<0.01,阳性预测值为71.43%,阴性预测值为94.74%）,24周HBeAg较基线下降大于97.1%（OR=71.400,P<0.01,阳性预测值为58.33%,阴性预测值为98.08%）是48周完全应答的预测因素。结论采用恩替卡韦治疗的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者,早期血清HBsAg、HBeAg变化对48周完全应答有预测价值,其中血清HBeAg的下降更有益于疗效的预测。     

HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞Toll样受体3的表达

目的观察HBeAg＋慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血树突状细胞内ToH样受体3（TLR3）mRNA的表达水平及意义。方法30例HBeAg＋慢性乙肝患者为研究组,30例HBeAg-慢性乙肝患者和30例健康体检者为对照组。用人重组粒细胞-巨噬细胞刺激集落因子（rhGM—CSF）、人重组白细胞介素4（rhIL4）、干扰素α（IFN-α）诱导慢性乙型肝炎患者和健康体检者外周血树突状细胞（DC）。ELISA法检测DCs培养上清液中IL-12、INF-1的分泌水平,实时荧光定量（RT—PCR）法检测TLR3mRNA表达水平。结果HBeAg＋和HBeAg-慢性乙肝患者外周血DCs分泌IL-12、INF-1的水平,TLR3mRNA表达均显著低于健康对照组（P〈0．01）。HBeAg＋慢乙肝患者TLR3mRNA表达低于HBeAg-慢乙肝患者,但二者差异无统计学意义（P〉0．05）。结论慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞Toll样受体3的表达和分泌细胞因子的功能下降。     

慢性苯中毒患者外周血T细胞TCR Vγ基因多样性分析

目的 了解慢性苯中毒患者外周血T细胞的TCR Vγ基因谱系多样性和克隆性增殖特点.方法 利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增10例慢性苯中毒患者外周血单个核细胞中3个TCR Vγ基因,PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析T细胞克隆性,并与8例健康人进行比较.结果 8例健康人外周血T细胞检测到所有Vγ亚家族,10例慢性苯中毒患者平均表达(1.30±0.48)个Vγ亚家族,较健康人明显减少,差异有统计学意义(P＜0.01).慢性苯中毒患者出现克隆性增殖改变比较集中在VγⅡ亚家族.结论 慢性苯中毒患者外周血出现TCR Vγ亚家族倾斜性分布和克隆性增殖T细胞,这可能是苯中毒后所引起的机体特异性免疫反应.     

慢性乙型肝炎患者树突状细胞分离培养及其功能测定

目的探讨树突状细胞（DCs）在慢性乙型肝炎发病过程中的功能特点，为进一步研究慢性乙型肝炎的发病机制提供科学依据。方法对10例慢性乙型肝炎患者、10例乙型肝炎病毒（HBV）携带者及10例正常对照者的外周血DCs进行体外培养，应用流式细胞技术检测DCs表面分子HLA-DR、CD80、CD86的表达，并采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测DCs上清液白细胞介素（IL）-12的水平，比较DCs在慢性乙型肝炎不同感染阶段的功能特点。结果培养7天的DCs在透射电镜下观察，DCs充满每个视野，细胞体积较大，细胞表面突起较丰富，胞浆内粗面内质网及溶酶体丰富，线粒体结构较清楚，核大而圆，核膜清晰，染色质分布较均匀。正常对照组的HLA-DR、CD80和CD86的表达率均〉54％，而慢性乙型肝炎及HBV携带者组上述DCs表面分子的表达率普遍降低，与正常对照组比较，差异有显著性（P〈0．01），慢性乙型肝炎与HBV携带者组之间的差异无统计学意义（P〉0．05）。培养第7天DCs上清IL-12的表达水平在慢性乙型肝炎、HBV携带者组明显低于正常对照组（P〈0．05），而慢性乙型肝炎与HBV携带者组之间无明显差异（P〉0．05）。结论慢性乙型肝炎患者及HBV携带者均存在DCs表型和功能的缺失。     

HBsAg脉冲的树突状细胞对CIK细胞功能的影响

目的探讨HBsAg脉冲的树突状细胞(DC)对细胞因子诱导的杀伤细胞(C IK)增殖和杀伤作用的影响。方法选择慢性乙肝患者27例,分离外周血单个核细胞(PBMC),经HBsAg脉冲后,用3H-TdR掺入法检测该细胞对C IK细胞增殖的刺激作用,用乳酸脱氢酶释放法检测特异性C IK细胞对HepG2.2.15细胞的特异性杀伤作用。结果HBsAg脉冲的DC对C IK细胞的增殖具有刺激作用。由HBsAg脉冲的DC所诱导的特异性C IK细胞对HepG2.2.15细胞的特异性杀伤作用增强。结论HBsAg脉冲的DC可增强C IK细胞的杀伤活性。     

Caspase-9活性检测在慢性乙型肝炎患者PBMC凋亡中的意义

目的探讨慢性乙型肝炎(乙肝)患者外周血单个核细胞(PBMC)凋亡率在乙肝病毒(HBV)感染慢性化机制中的意义及凋亡PBMC的半胱氨酸基-天冬氨酸特异性蛋白酶9(Caspase-9)活性在PBMC凋亡过程中的意义。方法采用流式细胞仪检测25例慢性乙肝患者及15例健康对照者PBMC的凋亡率,并用比色法检测凋亡PBMC内Caspase-9的活性。结果慢性乙肝患者HBV DNA阳性组PBMC凋亡率及PBMC内Caspase-9活性均高于HBV DNA阴性组(均P<0.01)及健康对照组(均P<0.01),HBV DNA阴性组上述两指标均高于健康对照组(分别P<0.05;P<0.01)。慢性乙肝患者PBMC中Caspase-9活性与其凋亡率呈正相关(P<0.01)。结论慢性乙肝患者PBMC存在凋亡现象,可能为乙肝慢性化机制之一;其中的Caspase-9活性增高,提示Caspase-9可能参与了慢性乙肝患者PBMC的凋亡过程。     

慢性乙型肝炎患者肝脏组织TOLL样受体4的变化和意义

目的 通过检测慢性乙型肝炎(CHB)患者肝组织Toll样受体4(TLR4)的表达变化及其与肝脏病理、临床分度、血清HBV DNA对数值等的关系,探讨TLR4在CHB的意义.方法 采用Elivision二步免疫组织化学方法 检测75例CHB及10例健康对照组肝组织TLR4的表达并予以评分,然后与肝脏病理炎症分级及纤维化分期、临床分度和血清HBV DNA对数值[Lg(血清HBVDNA)]等进行相关性分析.结果健康对照组肝组织无或仅有少量TLR4的表达,CHB组肝组织TLR4的表达明显增强并显著高于健康对照组;在轻、中和重度慢性乙型肝炎患者肝组织TLR4表达强度记分分别为(1.0±0.5),(2.3±0.5)和(2.9±0.4)分,随着临床分度的增加,CHB肝组织上的TLR4表达逐步显著升高(F=104.8,P<0.01,两两间比较均P<0.05),肝组织免疫组化染色强度与临床分度间呈正相关(r=0.838,P<0.01);TLR4的表达强度与肝组织炎症活动度分级(G)呈正相关(r=0.579,P<0.05);但与Lg(血清HBV DNA)以及肝组织纤维化分期(S)均无相关.结论 CHB患者肝细胞TLR4表达上调,TLR4可能与CHB的发病有关.     

树突状细胞治疗慢性乙型肝炎研究进展

乙型肝炎（乙肝）是严重危害人类健康的传染病，尽管乙肝疫苗的应用大大降低了乙肝的发病率，但全世界仍有20亿人被乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染，其中3．5亿人成为慢性携带者。目前，用于治疗慢性乙肝的药物主要有α干扰素和拉米夫定，但其疗效尚难令人满意。     

乙型肝炎病毒感染者体内树突细胞及树突细胞疫苗研究现状

树突细胞(DC)是目前已知功能最强的专职抗原提呈细胞(APC),为当前抗肿瘤、抗病毒等疾病免疫治疗研究的热点.近年来,对DC疫苗的探索和研究为多种疾病的免疫治疗提供了新的治疗前景.此文就DC在慢性乙型肝炎中的研究现状进行综述.     

慢性乙型肝炎患者血清TNF-α及白细胞介素水平的变化研究

目的 研究慢性乙型肝炎患者血清TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-18的变化.方法 选择60例慢性乙型肝炎患者,其中慢性重型肝炎30例(SH组),慢性肝炎30例(CH组),并设健康对照组20例(NC组),采用双抗体夹心ELISA法测定各组患者血清TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-18.结果 CH组患者血清TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8、IL-18水平均较NC组明显上升,SH组患者血清TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8、IL-18水平亦较CH组明显上升,血清IL-10水平在SH组较CH组明显下降,CH组较NC组亦明显下降.结论 TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-18均参与了慢性乙型肝炎的免疫病理反应并且在其中起着重要的作用.     

酶联免疫斑点法检测乙型肝炎病毒感染者抗原表位特异性细胞毒性T淋巴细胞

目的 通过观察乙型肝炎病毒(HBV)特异性细胞毒性T细胞(CTL)抗原表位肽刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生γ干扰素(IFN-γ)的能力,分析不同类型HBV感染人群特异性CTL免疫应答差异.方法 合成4条人类白细胞抗原(HLA)-A2限制性HBV特异性CTL抗原表位肽[分别为多聚酶P的575-583序列FLLSLGIHL(Tp),HBsAg28-39序列IPQSLDSWVCTSL(Tel),HBsAg183-191序列FLLTRILTI(Te2)和HBcAg18-27序列FLPSDFFPSV(Tc)].流式细胞术鉴定HLA基因表型.用合成的CTL表位肽分别刺激慢性乙型肝炎组(CHB)、慢性乙型重型肝炎组(CSH),既往HBV感染者(N1)组和健康献血员(N2)的PBMC,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测分泌IFN-γ的CTL细胞的频率.结果 (1)HLA-A2基因分布频率:44例CHB组为45.5%(20/44),18例CSH组为55.6%(10/18),10例N1组为60%(6/10),10例N2组全部选择以往研究已确定的HLA-A2阳性者.(2)ELISPOT检测结果:①4条HBV特异性抗原多肽反应阳性率在CHB组、CSH组、N1组和N2组分别为50%(10/20)、10%(1/10)、83.3%(5/6)和10%(1/10).N1组反应阳性率高于CSH组(X2=9.000,P=0.008)和N2组(X2=9.000,P=0.008).②各组对Tp、Te1、Te2和Tc四条肽的平均反应强度用斑点形成细胞(SFC)/106PBMC表示,采用非参数秩和检验,N1组对Tp、Te1、Te2和Tc肽的平均反应强度大于CSH组和N2组(分别为77 SFC/106PBMC vs 10 SFC/106PBMC vs 15 SFC/106PBMC,59 SFC/106PBMC vs 0 SFC/106PBMC vs 0 SFC/106PBMC,100 SFC/106PBMC vs 0 SFC/106PBMC vs 22 SFC/106 PBMC和57 SFC/106 PBMC vs 20 SFC/106 PBMC vs 30 SFC/106 PBMC,均P<0.01).结论 各种类型HBV感染者不论病毒清除与否,都可对HBV特异性多肽产生T细胞免疫反应,这种免疫反应以既往感染者最强,慢性乙型肝炎组较弱,慢性乙型重型肝炎组缺乏,提示HBV特异性CTL应答可能是自身免疫机制清除病毒的重要因素.     

乳腺癌患者外周血T细胞亚群与NK、NKT细胞检测的临床意义

目的:检测乳腺癌患者外周血T淋巴细胞亚群及NK、NKT细胞表达率的变化,探讨乳腺癌患者免疫状况与肿瘤分期的关系以及免疫指标变化在治疗前后的临床价值。方法 :采用荧光标记法与多参数流式细胞仪检测40例正常女性和120例乳腺癌患者的总T淋巴细胞(CD3+)、T辅助/T诱导细胞(CD3+CD4+)、T抑制/细胞毒细胞(CD3+CD8+)、自然杀伤细胞(NK)、NK样T细胞(NKT)的表达率,并进行统计学分析。结果:无淋巴结转移组乳腺癌患者治疗前CD3+、CD3+CD4、CD3+CD8+、CD4+/CD8+与对照组比较无统计学意义,NK、NKT显著低于对照组(P<0.05)。淋巴结转移组乳腺癌患者CD3+、CD3+CD4、CD3+CD8+、NK、NKT表达率均明显低于对照组(P<0.05)。经过综合治疗后乳腺癌组各项免疫指标均恢复到正常值。结论:外周血T细胞亚群的检测对判断乳腺癌患者的病情、临床分期有一定意义;经过治疗后能够有效地改善乳腺癌患者的免疫状态。     

联合免疫对乙型肝炎表面抗原阳性的慢性乙型肝炎病毒感染孕妇子女的免疫效果

目的 评价乙型肝炎疫苗（HepB）联合乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG）对乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性的慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染孕妇子女的免疫效果.方法 326例乙型肝炎e抗原（HBeAg）阴性HBV感染孕妇及其分娩的375例子女纳入本研究,记录母亲孕期HBIG使用情况、分娩方式、子女出生后免疫预防措施和喂养方式,并进行HBV标志物比较.结果 375例子女均在出生12h内使用了HBIG,352例（93.9％）出生24 h内接种了第1针HepB,23例（6.1％）均因存在各种新生儿疾病而延迟,但分别在出生后7 ～42 d进行补接种.236例行脐带血检测HBV标志物,39例（16.5％）HBsAg阳性,197例（83.5％）HBsAg阴性,脐带血HBsAg阳性与阴性子女抗-HBs阳性率及抗-HBs中位浓度比较差异无统计学意义（P＞0.05）.孕期使用HBIG与未使用HBIG母亲的子女抗-HBs阳性率分别为63.5％（47/74）,59.8％（180/301）;剖宫产与自然分娩的子女抗-HBs阳性率分别为65.2％（103/158）,57.1％（124/217）,母乳喂养、混合喂养、人工喂养的子女抗-HBs阳性率分别为62.0％（119/192）,58.9％（63/107）,59.2％（45/76）,差异均无统计学意义（P＞0.05）.结论 HBeAg阴性HBV感染孕妇的子女经正规的HBIG联合HepB免疫预防后,不同的分娩方式、喂养方式、孕晚期是否使用HBIG对子女HepB的免疫应答与HBV的母婴传播无影响.