小鼠microRNA-21慢病毒抑制载体的构建及鉴定

目的构建microRNA-21(miR-21)慢病毒抑制载体,为研究miR-21在小鼠体内的功能及作用机制打下基础。方法利用miR-21前体并将其克隆入LV3pGLV-H1-GFP质粒中,经酶切及测序鉴定,利用脂质体将鉴定的阳性重组LV3pGLV-H1-GFP-miR-21抑制载体、PG-P1-VSVG和pCMV-dR3个质粒转染到HEK-293T细胞,将所得病毒感染293T细胞,检测病毒滴度,并将制备的病毒颗粒感染乳鼠心肌细胞和尾静脉注射小鼠,检测miR-21在小鼠体内的表达。结果酶切及测序结果证明成功构建了LV3pGLV-H1-GFP-miR-21重组质粒,并成功包装成慢病毒,病毒滴度为2.4×109TU/ml,重组病毒成功感染心肌细胞,同时在Balb/c小鼠心脏有表达。结论成功构建miR-21慢病毒抑制载体,获得高效表达miR-21的慢病毒颗粒,为miR-21的进一步研究奠定了基础。     

人肝脏特异性miR-122重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建microRNA-122(miR-122)的重组过表达慢病毒,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究miR-122的功能和作用机制奠定基础。方法利用PCR法扩增人类基因组DNA中miR-122发夹前体结构RNA,并将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经酶切及基因测序鉴定,将阳性重组PCDH-CMV-miR-122-EF1a-GFP-puro表达载体、p CMV-VSV-G和p CMVdR8.91三质粒共转染到HEK-293T细胞,收获上清液,将所得病毒悬液浓缩后梯度稀释后感染HEK-293T细胞,并利用绿色荧光蛋白进行病毒滴度测定。将重组慢病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞,并利用实时定量PCR检测miR-122的表达。结果重组慢病毒表达载体PCDH-CMV-miR-122-EF1a-GFP-puro酶切及测序鉴定证明载体构建成功,并得到滴度为3×108TU/m L的病毒液。病毒感染人皮肤成纤维细胞后miR-122表达明显增强。结论通过优化miRNA载体构建方法成功构建人miR-122的重组慢病毒载体并可在人类成纤维细胞内显著过表达miR-122,为miR-122的研究提供更高效稳定的基因载体。     

微小RNA miR-26a的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的 克隆微小RNA hsa-miR-26a并构建其慢病毒表达载体.方法 将PCR扩增得到的miR-26a前体序列和pIVTHM载体经双酶切后连接产生pIVTHM-miR-26a慢病毒表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆.用pIVTHM-miR-26a、psPAχ2和pMD2.G 3质粒共转染包装细胞293FT,包装产生慢病毒.以293FT细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达水平测定病毒滴度.结果 经双酶切鉴定和测序证实,成功构建了miR-26a的慢病毒表达载体pIVTHM-miR-26a.倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293FT呈绿色荧光,并测得病毒滴度为5×105TU/ml.成功构建hsa-miR-26a的慢病毒表达载体.为深入研究miR-26a的生物学功能奠定了基础.     

VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建

目的：构建过表达VEGF和Smad7双基因的慢病毒载体,为勃起功能障碍基因治疗的研究提供有效工具。方法：根据GenBank中基因信息,设计合成VEGF和Smad7引物,采用overlap PCR方法扩增目的基因片段,运用基因重组技术将其克隆至慢病毒表达载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin,经酶切、测序对重组质粒进行验证。将重组质粒和Helper1.0、pHelper2.0辅助质粒共转染293T细胞,包装双基因过表达慢病毒并测试其滴度。结果：经酶切和测序鉴定表明VEGF和Smad7双基因重组慢病毒载体构建成功,荧光法测定重组慢病毒滴度高（2E+8TU/mL)。VEGF和Smad7重组慢病毒能高效转染293T细胞,Western blot检测显示VEGF和Smad7蛋白在靶细胞中过表达。结论：成功构建了携带VEGF和Smad7基因并能正确表达的高滴度的重组慢病毒载体。     

小鼠BMPRⅠb基因慢病毒载体构建及转染神经干细胞

目的:构建携带小鼠BMPRⅠb基因的慢病毒载体,并转染神经干细胞,为研究BM-PRⅠb在BMPs调控神经干细胞分化中作用奠定基础。方法:利用RT-PCR从小鼠脑组织中获得BMPRⅠb基因,然后定向插入慢病毒表达质粒,进行双酶切及测序鉴定。将鉴定成功的重组慢病毒质粒和另外两种辅助质粒共转染包装细胞,收集、浓缩慢病毒并检测其滴度。利用获得的慢病毒载体转染NSCs,并观察目的基因表达情况。结果:RT-PCR产物经电泳及测序证实克隆成功BM-PRⅠb基因,酶切及测序鉴定成功构建重组慢病毒质粒,共转染293T细胞72h后大部分细胞表达绿色荧光,病毒滴度为5×108 TU/ml。慢病毒感染后的NSCs表达绿色荧光且BMPRⅠb mRNA表达上升。结论:成功构建BMPRⅠb基因慢病毒载体,并成功转染NSCs。     

携带人尾型同源盒基因-2基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建尾型同源盒基因-2(CDX2)基因的慢病毒表达载体并进行鉴定。方法 PCR扩增CDX2基因片段后,将其克隆入慢病毒表达载体pWPI,通过PCR、酶切和测序鉴定重组质粒。重组质粒转染包装细胞293T后获得包装的病毒颗粒。病毒颗粒感染直肠癌细胞XB1847,经PCR和Western Blot证明重组慢病毒携带的CDX2在XB1847细胞内表达的情况。结果经PCR扩增、酶切及测序验证,重组质粒构建成功,命名为pWPI-CDX2。PCR和Western Blot证明重组慢病毒感染XB1847细胞后CDX2能稳定表达。结论成功构建了携带CDX2的慢病毒载体,为研究CDX2在直肠癌中的功能提供了实验基础。     

小鼠甲基转移酶EZH2基因慢病毒表达载体的构建及验证

目的 构建小鼠组蛋白H3 K27三甲基转移酶EZH2基因慢病毒载体及鉴定.方法 以携带EZH2 cDNA的PCMV-SPORT6载体为模板,自行设计携带有Kpnl和Xmal酶切位点的引物PCR扩增出目的基因编码序列,扩增产物用内切酶酶切后定向克隆到慢病毒载体PLenti-eGFP-NEO中,通过PCR、酶切及测序验证载体;将重组慢病毒载体和包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE及pMD2G组成的四质粒系统,共转染293T细胞包装成慢病毒,收集含病毒颗粒的细胞上清液,浓缩和纯化后得到高效价的病毒液,转染293T细胞进行效价测定.结果 PCR扩增出约2241 bp的序列,构建的慢病毒载体测序结果与Genebank报道的目的基因序列一致;四质粒系统成功共转染入293T细胞中,在细胞中能够稳定表达,包装出了2.1×108TU/ml的病毒液.结论 成功构建了小鼠EZH2基因慢病毒载体,并得到2.1×108TU/ml高效价的病毒液.     

靶向miR-126慢病毒表达载体的构建及意义

目的：检测微小RNA-126（microRNA-126,miR-126）在CD4＋CD25＋调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）中的表达水平,同时构建基于慢病毒的miR-126反义寡核苷酸序列（antisense oligonucleotides,ASOs）表达载体。方法：实时定量PCR特异性探针法检测miR-126在Tregs中的表达水平;针对miR-126序列,设计合成其ASOs序列,退火后连接至经AgeI酶和EcoRI酶双酶切的pGCsil—LV—GFP载体上,连接产物转化DH5α感受态细胞,对经PCR鉴定为阳性的载体（命名为pGCsil—miR-126-ASOs）进行测序分析;将构建成功的pGCsil—miR-126-ASOs表达质粒和pHelper1．0、pHelper2．0质粒共转染293T细胞,浓缩病毒颗粒并测定所获病毒滴度;将制备好的病毒颗粒感染经TGF—B体外诱导培养的小鼠CD4＋CD62L＋初始T细胞,72h后用流式细胞仪检测其Foxp3的表达变化。结果：实时定量PCR结果显示miR-126在CD4＋CD25＋Tregs中的表达明显高于CD4＋CD25-T细胞（P〈0．01）;测序结果证明成功构建pGCsil-miR-126-ASOs重组质粒载体,包装并获得高浓度的慢病毒颗粒,病毒滴度为9×10^8TU／mL;重组的病毒能明显抑制Tregs的外周诱导（P〈0．05）。结论：成功构建miR-126ASOs的慢病毒表达载体,并获得高浓度的病毒颗粒。     

NOC2L基因重组慢病毒表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建NOC2L基因重组慢病毒并使其在293T细胞中表达。方法通过设计引物及PCR扩增获得NOC2L全基因片段,将pCDH-GFP载体分别用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切制备线性化载体;NOC2L全基因片段和线性化载体经切胶回收后,通过同源重组反应将NOC2L全基因片段连接到线性化的pCDH-GFP载体上,构建pCDH-NOC2L-GFP慢病毒表达载体;通过菌落PCR、质粒双酶切、测序等方法对构建的NOC2L基因重组慢病毒表达载体进行鉴定,利用构建的pCDH-NOC2L-GFP包装NOC2L慢病毒并使用该慢病毒感染293T细胞。结果菌落PCR、质粒双酶切和测序结果显示成功将NOC2L基因连接到pCDH-GFP载体上,使用构建成功的pCDH-NOC2L-GFP转染293T细胞,能够成功转染及包装NOC2L基因重组慢病毒,同时包装好的NOC2L基因重组慢病毒能够成功感染293T细胞并过表达293T细胞中的NOC2L基因。结论采用本研究方法能成功构建NOC2L基因重组慢病毒表达载体。     

人miR-106b的克隆及其慢病毒表达载体构建

目的克隆微小RNAhsa—miR-106b并构建其慢病毒表达载体。方法将PCR扩增得到的miR-106b前体序列和pLVTHM载体经双酶切后连接,产生pLVTHM—miR-106b慢病毒表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆。用pLVTHM—miR-106b、psPAX2和pMD2．G质粒共转染包装细胞293FT,包装产生慢病毒。结果经双酶切鉴定和测序证实,成功构了miR-106b的慢病毒表达载体pLVTHM—miR-106b。倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293FT呈绿色荧光。结论成功构建了has—miR-106b的慢病毒表达载体,为深入研究miR-106b的生物学功能奠定基础。     

miR-137过表达慢病毒的包装和鉴定

目的：构建miR-137过表达慢病毒载体并进一步包装慢病毒,探讨miR-137在HEK293T细胞中的感染效率和表达水平。方法：化学合成miR-137序列并克隆到慢病毒载体GV209,得到并鉴定含有目的片段的重组质粒,采用Lipofectamine 2000共转miR-137重组质粒与慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞中生产慢病毒。以感染复数（MOI）值为40感染HEK293T细胞48h后,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达,采用荧光定量PCR法检测HEK293T细胞中miR-137的表达水平。结果：测序结果,目的基因序列与GenBank公布的miR-137基因序列完全一致。在感染的HEK293T细胞中观察到GFP的表达。过表达慢病毒感染细胞中miR-137表达水平是对照细胞的12.74倍。结论：成功包装miR-137过表达慢病毒,并可高效感染HEK293T细胞。     

基于双荧光素酶报告基因系统建立miR-140生物传感器

目的：利用双荧光素酶报告基因系统构建可检测miR-140活性的生物传感器。方法：首先,在psiCHECK-2双荧光报告基因质粒的多克隆位点插入miR-140成熟体的4个拷贝反义序列,构建miR-140 sensor。其次,将miR-140 sensor和miR-140 mimics共转染HEK-293 T细胞,利用双荧光素酶报告基因系统检验miR-140 sensor的功能。最后,转染miR-140 sensor至大鼠骨髓间充质干细胞（ rat MSCs ）,分析在成软骨诱导中miR-140的活性变化,并与miR-140的表达水平相比较。结果：在HEK-293T细胞中,相对于阴性对照组,miR-140 sensor与miR-140 mimics共转能明显降低49％（20 nmol· L-1）和65％（50 nmol· L-1）的荧光活性。将转染miR-140 sensor的rat MSCs成软骨诱导7 d后,荧光活性降低43％,提示miR-140活性升高,与RT-qPCR法检测的miR-140表达水平相一致。结论：构建的miR-140 sensor是一种简单方便有效的miRNA传感器,可用于检测miR-140活性。     

mTIGIT-mLumin跨膜融合蛋白慢病毒载体和真核表达载体的构建及体外的稳定表达

目的: 构建以mLumin荧光蛋白为指示系统的小鼠T细胞免疫球蛋白和结构域蛋白(mouse T cell Ig and ITIM domin,mTIGIT)胞外区真核表达载体,并表达mTIGIT-mLumin融合蛋白。方法: 分别设计mTIGIT和mLumin的特异性引物,通过PCR技术扩增两个目的基因序列,经酶切、连接,克隆至plenti-puro和pcDNA3.1载体。将构建的plenti-puro-mTIGIT-mLumin慢病毒载体进行病毒包装并感染HEK-293T细胞,而pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin真核表达质粒转染非洲绿猴肾成纤维Cos7细胞,利用两种表达载体的药物抗性进行筛选感染或转染的细胞,检测融合蛋白的表达情况。结果： 通过PCR顺利扩增获得mTIGIT和mLumin,经酶切、连接插入至载体,基因测序结果证实克隆的mTIGIT和mLumin片段序列正确,并成功正确插入到plenti-puro载体和pcDNA3.1载体中;荧光显微镜和共聚焦显微镜观察显示,转染的HEK-293T细胞和Cos7细胞经过筛选能够稳定表达mTIGIT-mLumin融合蛋白。 结论： 成功构建plenti-puro-mTIGIT-mLumin慢病毒载体和pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin真核表达载体,且能够在目的细胞中稳定表达mTIGIT-mLumin融合蛋白。     

含hITF启动子的荧光素酶报告质粒的构建及活性检测

目的构建含有人肠三叶因子(intestinal trefoil factor,hITF)启动子的荧光素酶表达载体,并检测启动子活性。方法采用PCR技术从LS-174T细胞基因组DNA中扩增出长约2.5kb的含hITF基因启动子片段(-2331/+53),而后在此基础上构建了10个不同长度的启动子序列至pGL-3basic荧光素酶表达载体,然后将这些重组质粒转染HEK-293细胞并在48h后检测其荧光素酶活性。结果插入的hITF启动子片段测序结果显示正确,-500/+53,-400/+53和-300/+53片段活性介于0.023～0.026之间,-200/+53,-100/+53和-50/+53活性介于0.0032～0.0042之间,明确了最小活性功能域位于-300/+53区域,-300/-200区域对hITF转录起始起关键性作用。结论成功构建了含hITF启动子的萤火虫荧光素酶报告基因质粒,鉴定出人肠三叶因子(hITF)启动子活性位于-300/-200区域。     

人microRNA149抑制表达慢病毒载体的构建及对黑色素瘤细胞增殖及迁移的影响

目的 构建人microRNA149(Hsa-miR-149)抑制表达慢病毒载体,并探讨抑制miR-149表达对黑色素瘤Mel-RM细胞增殖及迁移的影响.方法 由miRBase及NCBI数据库查找获得miR-149序列,设计合成其引物序列,通过退火反应获得双链DNA寡核苷酸片段,与载体pBS-hU6-1连接,将连接后的载体与FG12连接,经测序鉴定后获得重组慢病毒载体;将重组慢病毒质粒分别与包装辅助质粒共转染至293T细胞中,包装产生病毒,进行病毒滴度测定,再用包装后的病毒感染Mel-RM细胞,利用实时荧光定量PCR法检测miR-149表达水平.同时用MTT法及细胞迁移实验分别检测细胞增殖和迁移能力.结果 成功构建了抑制miR-149表达的慢病毒载体,测序证实了所插入的基因序列正确.在荧光显微镜下观察到转染后的297T细胞表达大量绿色荧光蛋白,收集病毒,用梯度滴定法测得的重组载体病毒滴度为3.2×1010 TU/L.将病毒感染Mel-RM细胞显示可有效降低miR-149的表达水平(P＜0.05).MTT法结果显示与感染空载FG12病毒的对照组相比,感染抑制miR-149表达重组质粒的实验组中活细胞数明显减少(P＜0.05).细胞迁移实验结果显示与对照组相比实验组明显抑制了Mel-RM细胞的迁移(P ＜0.001).结论 成功构建抑制miR-149表达的慢病毒载体,抑制miR-149的表达可以抑制Mel-RM细胞的增殖和迁移.并为后续进一步研究miR-149对黑色素瘤细胞发生发展的影响提供依据.     

shRNAmir慢病毒载体沉默鼻咽癌细胞中环氧合酶-2的表达

目的 构建基于miR-155结构的shRNAmir慢病毒表达载体,在鼻咽癌细胞中沉默COX-2基因的表达,探索全新的COX-2抑制方法.方法 转染小干扰RNA(siRNA),筛选出沉默COX-2表达的RNA干扰序列,以该序列替换miR-155前体序列中的双链部分作为anti-COX-2 shRNAmir转录模板,构建pLVTHM/shRNAmir慢病毒质粒表达载体,利用293FT细胞包装pLVTHM/anti-COX-2 shRNAmir慢病毒.感染鼻咽癌C666-1细胞后,通过流式分选,建立anti-COX-2 shRNAmir稳定表达,COX-2基因沉默的亚系.结果 设计合成的anti-COX-2a siRNA能够使COX-2 mRNA表达下降90%以上,根据其序列构建的plVTHM/sbRNLAmir质粒载体测序无误,pLVTHM/anti-COX-2 shRNAmir慢病毒感染C666-1细胞后,分选出亚系C666-1经反复传代仍可保持COX-2基因沉默的表型.结论 pLVTHM/shRNAmir慢病毒载体能够转录出基于miR-155结构的shRNAmir,沉默鼻咽癌细胞COX-2的表达,为探索更加高效安全的COX-2抑制剂奠定基础,也为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供了新手段.     

miR-TH克隆及慢病毒载体的构建

目的：克隆microRNA-酪氨酸羟化酶（TH）,构建慢病毒载体。方法：根据TH基因序列（NM_009377.1）,设计并合成4对微小RNA（miRNA）的Oligo DNA,退火形成双链后与pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miRNA载体相连,用Gateway技术将构建好的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-TH载体先后与中间载体pDONRTM221、慢病毒载体pLenti6/V5-DEST连接,构建慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-TH,用脂质体2000（lipofectamine 2000）将慢病毒载体以及包装质粒（pLP1,pLP2和pLP/VSVG）共转染HEK-293FT细胞,收集上清,感染293T细胞株进行滴度鉴定。结果：测序结果表明,4对pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miR-TH表达载体序列与参考序列一致,构建出来的慢病毒载体在293FT细胞中包装成功,并通过293T细胞测得慢病毒滴度为5×106 TU/ml。结论：成功构建了TH的慢病毒干扰载体pLenti6/V5-DEST-TH,为利用RNA干扰技术进一步研究TH基因的功能和作用奠定了基础。     

SOCS3基因3’端非翻译区荧光素酶报告载体的构建及活性鉴定

目的:研究细胞因子信号抑制蛋白-3(suppressors of cytokine signaling-3,SOCS3)基因3’端非翻译区(3’-un-translated region,3’-UTR)微小RNA(microRNA,miRNA)的调控作用,构建重组SOCS3基因3’-UTR荧光素酶报告载体,并通过荧光素酶活性测定,初步分析可能调控SOCS3基因表达的miRNAs。方法:采用PCR方法从原代培养的小鼠星形胶质细胞基因组DNA中扩增SOCS3基因3’-UTR序列,插入荧光素酶报告载体pGL3-Promoter,获得重组载体pGL3-Promoter/SOCS3;通过Target Scan5.2、RNAhybrid和FINDTAR3软件预测可能与SOCS3基因3’-UTR结合的miR-NAs;将pGL3-Promoter/SOCS3重组质粒和miRNAs共转染HEK 293T细胞,测定SOCS3 3’-UTR荧光素酶的活性。结果:酶切及核酸测序证实,成功构建了SOCS3基因3’-UTR序列的荧光素酶报告重组子;miRNA靶位点预测显示,SOCS3基因可能是miR-203、miR-291a-5p、miR-9、miR-140和miR-130b的作用靶标;与对照组相比,miR-203、miR-291a-5p、miR-140能使SOCS3 3’-UTR荧光素酶的活性显著降低。结论:成功构建了SOCS3基因3’-UTR荧光素酶报告载体,且miR-203、miR-291a-5p、miR-140可显著降低其荧光素酶的活性。     

miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞（HEK）293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法：以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体。利用Lipofectamine 2000将重组慢病毒质粒FV040 Vector和FV040 miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48 h后收集慢病毒,以FV040 Vector慢病毒作为对照组,FV040 miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞。感染48 h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平。结果：测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致。与对照组（0.8387±0.1456）比较,实验组HEK 293T细胞中miR-186表达水平（12.6400±0.7884）明显升高（t=14.72,P<0.01）,约为对照组的15.07倍。结论：成功构建miR-186过表达慢病毒载体并包装出慢病毒,miR-186慢病毒成功感染HEK293T细胞,miR-186表达水平在HEK293T细胞中明显升高。     

慢病毒介导的miR-27a下调对U87胶质瘤细胞的影响

目的:探讨下调miR-27a对U87胶质瘤细胞的影响?方法:分别用慢病毒干扰质粒miRZip-27a anti-miR-27a microRNA construct或慢病毒空质粒pGreenPuro Scramble Hairpin Control-Construct与慢病毒包装质粒混合物共转染293T细胞,获得慢病毒颗粒命名为Lt-I和Lt-NC?然后分别用慢病毒Lt-I和Lt-NC感染U87胶质瘤细胞,通过流式细胞仪筛选出稳定感染的U87胶质瘤细胞?通过定量PCR法分别检测稳定感染的U87细胞和未感染的空白U87细胞miR-27a,CCK-8法检测胶质瘤细胞增殖情况,Transwell侵袭试验检测胶质瘤细胞的侵袭能力?结果:相对于未感染慢病毒的空白U87胶质瘤细胞,稳定感染Lt-I的U87胶质瘤细胞miR-27a表达明显下调?细胞增殖减缓?侵袭能力降低,而感染Lt-NC组(阴性对照组)则未见此改变?结论:miR-27a的下调能有效抑制U87胶质瘤细胞的增殖,降低U87胶质瘤细胞的侵袭能力?