A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的高效表达

将含Ａ型产气荚膜梭菌α毒素基因的质粒ｐＫＭＡ１００用核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，经电泳分离、透析袋电洗脱法回收了０．９５ｋｂα毒素基因片段，再将载体ｐＥＴ－２８ｂ（＋）用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，然后将处理好的ｐＥＴ－２８ｂ（＋）与０．９５ｋｂ的α毒素基因片段进行连接、转化。经ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切分析和序列分析，证明重组质粒ｐＸＥＴＡ１含有α毒素基因，且具有正确的阅读框架。构建的重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）能表达α毒素，但已经完全丧失其毒性。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层凝胶扫描分析，ＩＰＴＧ诱导后的ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）所表达的目的蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和免疫试验结果表明，表达产物能被α毒素抗血清识别，且免疫小鼠后，用强毒株培养上清攻击，结果免疫小鼠能抵抗至少４ＬＤ１００的攻击，这说明表达产物具有良好的免疫原性。     

产气荚膜梭菌毒素研究进展

产气荚膜梭菌通过产生大量的毒素导致人类和动物患气性坏疽、肠炎和肠毒素血症。目前,已知产气荚膜梭菌可产生20多种毒素和水解酶。不同的毒素类型与特定的疾病类型相关。毒素分型已由毒素基因的分子检测替代了传统的血清分型方法。因此本文围绕产气荚膜梭菌毒素种类、基本特征、致病机制以及与疾病的关系进行系统回顾总结和展望,为后续的毒素分型等快速检测技术的建立、免疫抗原筛选、抗体制备以及相关致病机制研究提供基础。     

产气荚膜梭菌α毒素基因片段克隆的测序与应用

目的为了获得A型产气荚膜梭菌C57株α毒素基因片段克隆质粒,作为实时定量PCR检测标本产气荚膜梭菌标准,以备临床应用。方法采用两轮高保真PCR扩增A型产气荚膜梭菌C57株α毒素基因片段(Cpa900),经EcoRⅠ酶切后插入质粒pUC19并连接,构建重组质粒pUC19-Cpa900,转化大肠埃希菌Top10感受态菌株并予以增菌后测序,并提取质粒进行实时定量PCR测试。结果 pUC19下游引物匹配Cpa900上、下游引物双PCR筛选电泳结果表明,116-2株中含单拷贝、反向插入pUC19的Cpa900,并为测序结果所证实;测序结果表明,克隆片段与美国典型菌种保藏中心标准株ATCC 13124的全基因序列CP000246.1中的磷脂酶C(PLC)基因(CPF_0042)相应序列相比,符合率高达99.8%;变异位点不在两实时定量PCR引物和探针区,经实时定量PCR实测对扩增效率无影响,完全可用作实时定量PCR检测标准。结论 A型产气荚膜梭菌α毒素克隆片段序列高度保守,作为模板具有高扩增效率,可作为标准品用于实时定量PCR检测A型产气荚膜梭菌,质粒引物匹配插入片段双引物双PCR筛选转化菌株,不但可鉴定阳性克隆,还能确定重组质粒中插入基因拷贝数量和插入方向、有效避免假阳性,不失为很好的筛选方法。     

一起产气荚膜梭菌引起的食物中毒报告

目的分析一起食物中毒暴发病因。方法样品参照GB/T4789-2008《食品卫生微生物学检验》等标准检验。结果鸡腿及患者粪便样品中检出产气荚膜梭菌,并从患者粪便样品中检出产气荚膜梭菌肠毒素。结论鸡腿被产气荚膜梭菌污染,患者食后造成食物中毒。     

食品中产气荚膜梭菌α毒素基因快速检测方法的研究

目的建立分子信标荧光PCR体系检测产气荚膜梭菌的快速检测方法,应用于食物中毒快速诊断和食品微生物检验。方法根据GenBank公布的保守序列,针对α毒素基因设计一对引物和分子信标探针,用FAM荧光剂标记探针的5’端,并进行特异性和灵敏度分析,同时以10种细菌作对照。结果分子信标荧光PCR反应体系检测10种细菌,只有产气荚膜梭菌出现特异荧光信号,其他均无荧光信号,而且与其他细菌无交叉反应。对40份食品样品进行检测,3份产气荚膜梭菌PCR阳性,其余样品为阴性,检测仅需2 h。3份阳性样本经传统方法培养,2份有检出产气荚膜梭菌。结论分子信标荧光PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于产气荚膜梭菌食物中毒的快速诊断和食品污染物及感染性腹泻等监测工作中,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

型特异性多重PCR快速检测创伤组织中的产气荚膜梭菌

目的 为快速检测创伤组织中的产气英膜梭菌建立型特异性多重PCR方法.方法 建立菌落和含产气荚膜梭菌创伤标本中的染色体和质粒DNA简便、快速纯化[月桂基硫酸三乙胺醇(TLS)法]和型特异性多重PCR方法;对各型产气荚膜梭菌、部分近缘梭菌标准株和开放性创伤气性坏疽标本进行PCR检测,其结果与培养结果进行比较.结果 该方法可检测各型产气荚膜梭菌,并可排除近缘梭菌干扰;A型株检测灵敏度达到7.5×10~3/ml;可在5 h内获取结果;标本PCR检测与培养结果相符.结论 新建立的培养和创伤组织标本中产气荚膜梭菌染色体与质粒DNA纯化方法简便、快速;型特异性多重PCR具有良好的特异性、较高的灵敏度,短时间内获得结果,可用于临床实验室.     

产气荚膜梭菌β-毒素基因的克隆及CPB-ST融合基因的构建

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，从Ｂ型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了９３０ｂｐ的β－毒素基因。用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ对ＰＣＲ产物进行双酶切处理，然后，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶将其定向连接于事先经同样的双酶切处理的载体质粒ｐＥＴ－２８Ｃ（＋）的多克隆位点，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切分析和ＰＣＲ扩增检测。证明重组质粒ｐＥＣＢ２中含有产气荚膜梭菌的β－毒素基因。经核苷酸序列分析，明确了克隆的β－毒素基因在重组质粒中的连接向位和阅读框架是正确的。利用已构建的另一重组质粒ｐＸＳＴ１（带有肠毒素性大肠杆菌的耐热性肠毒素ＳＴ基因），通过ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ双酶切处理，将切下的ＳＴ基因片段定向连接到ｐＥＣＢ２重组质粒中ＣＰＢ基因的下游。经特定酶切分析鉴定，得到了理想重组子质粒ｐＥＣＢＳＴ１，ＣＰＢ－ＳＴ融合基因在重组质粒ｐＥＣＴ－ＳＴ１中的连接向位是正确的     

应用多重PCR鉴定对人致病的产气荚膜梭菌毒素

目的研究用多重PCR的方法鉴定产气荚膜梭菌及分型毒素,为开展基因诊断做好准备。方法根据GenBank已经发表的产气荚膜梭菌毒素基因序列,设计出针对CPα、CPβ、CPE毒素基因的3对特异引物,运用多重PCR的方法鉴定出产气荚膜梭菌并对其毒素基因进行分型。结果经电泳鉴定,多重PCR成功的扩增出预先设计的3条特异的目的条带。结论所设计的多重PCR反应体系能够得到产气荚膜梭菌的特异序列,同时能够鉴定分型3种对人致病的毒素序列,为进一步开展基因诊断打下基础。     

产气荚膜梭菌选择性显色培养基的研制

目的通过筛选各种选择性成分添加至培养基中以快速筛选产气荚膜梭菌,研制产气荚膜梭菌选择性显色培养基。方法通过单因素试验评价促生长因子甘露醇、丙酮酸钠、硫酸镁对目标菌生长的促进作用,比较抗生素环丝氨酸、新霉素、多粘菌素和磺胺嘧啶对目标菌和非目标菌的抑制作用,比较显色剂5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸二钠盐(BCIP)、对硝基苯磷酸二钠(PNPP)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-Gal)、4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃糖苷(Mu-Gal)、邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)对目标菌的显色效果,将酶促因子硫酸镁、硫酸钙、硫酸锰、硫酸锌与目标菌反应筛选最佳成分并确定其用量,制成产气荚膜梭菌选择性显色培养基。结果筛选出的培养基最佳成分促生长因子为丙酮酸钠,用量200mg,抗生素环丝氨酸0.5mg,显色剂为BCIP和Mu-Gal,用量均为6mg,酶促因子硫酸镁72mg,以上成分加入到100ml营养肉汤基础培养基中,制备的选择性培养基培养效果与TSC培养基、SPS培养基无差异。结论本实验所研制的选择性培养基可以用于产气荚膜梭菌的检测。     

运用压电石英晶体生物传感器检测产气荚膜梭菌α毒素的实验研究

目的研究运用压电石英晶体生物传感器对产气荚膜梭菌α毒素（CPα）进行检测的方法和反应条件。方法按照碱基配对的原则,设计特异的产气荚膜梭菌α毒素基因寡核苷酸探针并利用巯基自组装技术固定在石英晶体上,运用压电石英晶体生物传感器的“质量效应”对聚合酶链反应（PCR）扩增得到的产气荚膜梭菌α毒素靶基因进行杂交检测,并探讨不同pH值和不同离子强度的缓冲液对检测的影响。结果压电石英晶体生物传感器成功检测出产气荚膜梭菌α毒素;pH7.6的缓冲液和0.64mol/L的NaCl溶液最适合于检测。结论压电石英晶体生物传感器能够有效地检测产气荚膜梭菌α毒素,有望对临床上开展毒素诊断提供一种新的手段。     

从鸭羽为原料的水洗羽毛制品中分离到产气荚膜梭菌

目的:对水洗羽毛制品进行微生物污染调查,提示在我国加入世贸组织后,应高度重视水洗羽毛羽绒制品的卫生状况。方法:按照GB/T10288-2003《羽毛羽绒检验方法》附录A中A.6.4亚硫酸还原梭状芽胞杆菌的计数进行操作。结果:从一件以鸭羽为原料的水洗羽毛样品中分离到产气荚膜梭菌。结论:中国是全球最大的羽毛羽绒及其制品生产国和出口国,随着我国加入世贸组织,加强羽毛羽绒及其制品的监测,有利于避免遭受贸易壁垒,更有利于保障人民健康。     

产气荚膜梭菌实时荧光定量PCR方法的应用

目的利用荧光定量PCR技术,建立快速敏感特异的产气荚膜梭菌检测方法。方法以产气荚膜梭菌基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以产气荚膜梭菌菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比,同时验证方法的灵敏度、特异性、重复性。结果反应体系在上、下游引物浓度均为1μmol/L,探针浓度为0.1μmol/L时,具有良好的特异性和灵敏度,与创伤弧菌等24种相关细菌均无交叉反应,对纯菌检测的灵敏度为9×102CFU/ml,重复性试验证实该体系重复性好,稳定性高;3例临床样本检测结果与细菌培养结果相符。结论建立的实时荧光PCR方法特异、灵敏、快速,能对临床气性坏疽做出快速准确的报告,实现对气性坏疽战时高发性疾病安全、快速和定量检测。     

B型肉毒毒素单克隆抗体杂交瘤株的建立

[目的]制备、筛选稳定分泌B型肉毒毒素单抗的杂交瘤克隆,为相关研究提供工具。[方法]采用纯化的B型肉毒毒素免疫BALB/c小鼠,用免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,筛选阳性克隆。[结果]得到10株稳定分泌B型肉毒毒素单抗的杂交瘤克隆,1株为IgM,其余9株分泌IgG,亚类为IgG2a。10株单克隆抗体均与B型肉毒毒素呈特异性反应,而与标准A型肉毒毒素无交叉反应,腹水单抗的效价均在105以上。[结论]10株杂交瘤细胞株均能分泌抗B型肉毒毒素单克隆抗体,为B型肉毒毒素的检测和研究提供了工具。     

不同来源产气荚膜梭菌β2毒素编码基因的PCR检测方法建立及遗传多态性分析

目的建立并优化产气荚膜梭菌β2毒素编码基因(cpb2)和非典型cpb2(aty-cpb2)的PCR检测方法, 分析2016-2021年中国9个地区cpb2流行特征和遗传多态性。方法使用PCR方法对188株产气荚膜梭菌菌株的cpb2进行检测, 通过全基因组测序获取cpb2序列以分析其遗传多态性, 使用Mega 11、Makeblastdb软件对110株产气荚膜梭菌所携带的cpb2构建系统发育树并建库, 通过Blastn算法比对后得出cpb2两种不同基因型, 即共有cpb2(con-cpb2)和aty-cpb2之间的序列相似性。结果针对产气荚膜梭菌cpb2和aty-cpb2建立及改进的PCR检测方法的特异性好。cpb2的PCR检测结果与全基因组测序结果高度一致(Kappa=0.946, P<0.001)。来自中国9个地区的菌株中共有107株菌携带cpb2, 94株A型菌株携带aty-cpb2, 6株A型菌株携带con-cpb2, 7株F型菌株携带aty-cpb2。两种不同基因型的cpb2核苷酸序列相似性为68.97%～70.97%, 相同基因型的cpb2核苷酸序列相似性为98.00%...     

一起产气荚膜梭菌引发校园食物中毒的流行病学调查

目的 调查某中学发生的一起食物中毒事件的病因,为校园公共卫生事件防控提供依据。方法 采用描述性流行病学和分析性流行病学方法对该事件的流行病学特征和危险因素进行分析,收集病例、食堂加工和配餐人员肛拭子标本以及可疑剩余食品、各类环境样本进行相关病原学检测。 搜索到病例20名(罹患率2.03%),临床症状以腹泻(100.00%)、腹痛(85.00%)为主,少数伴有恶心、乏力等症状,无发热;流行曲线为点源暴露模式,可疑餐次为2020年4月29日晚餐;单因素分析结果显示发病与酸菜鱼(RR=5.34,95%CI:1.30～105.03)有关;在4份肛拭子样本中检出产气荚膜梭菌,该菌株为α毒素基因阳性,判为A型产气荚膜梭菌。 本次事件是由学校食堂配餐引起的一起A型产气荚膜梭菌食物中毒暴发。对学校食堂可能引起产气荚膜梭菌污染和大量繁殖的环节应采取有效的预防措施。     

福建省生肉及含肉馅速冻米面制品中产气荚膜梭菌的污染状况调查

目的了解福建省生肉及含肉馅速冻米面制品中产气荚膜梭菌的污染状况。方法参照GB 4789.13-2012产气荚膜梭菌检验方法进行检测,并进行确证试验。结果样品中产气荚膜梭菌检出率8.7%(32/366);生肉中产气荚膜梭菌检出率(14.8%,31/210)高于含肉馅速冻米面制品(0.6%,1/156);生肉中产气荚膜梭菌各季度均有检出且呈上升趋势,含肉馅速冻米面制品中的产气荚膜梭菌仅在第3季度有少量检出;农村中的生肉产气荚膜梭菌检出率26.3%(10/38)高于城市12.2%(21/172)。结论福建省生肉中存在产气荚膜梭菌污染,农村生肉检出率更高,易引起食物中毒。     

Cα型肉毒梭菌毒素杀鼠剂保存期试验研究

目的:探讨Cα型肉毒梭菌毒素杀鼠剂保存期及其检测技术。方法:采用Cα型肉毒梭菌毒素作为活性成分,与非毒性成分保护剂所组成的复合型杀鼠剂,于避光密封条件下,在不同温度与时间中检测鼠单位值的变化。按其值未发生或无明显变化最长期限,作为毒剂的有效保存期。结果:水剂于35℃、20℃与5℃中保存期分别为二个月、四个月与九个月。干冻剂于5℃中保存期达二年。这种复合型毒剂克服了以往单纯型毒剂需冻结保存的缺陷。     

抗腐败西瓦菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定

目的 制备和鉴定抗腐败西瓦菌单克隆抗体(mAbs),为建立重要海洋细菌快速ELISA检测试剂盒奠定基础.方法 用灭活腐败西瓦菌免疫小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术,制备出抗腐败西瓦菌杂交瘤细胞株,用Giemsa染色对其进行染色体鉴定,并用间接ELISA方法筛选、鉴定其与腐败西瓦菌及其他重要海洋细菌的交叉反应性和效价.结果 共获得4株抗腐败西瓦菌的杂交瘤细胞株(02D6、02H12、03G4、03A7),均符合杂交瘤细胞染色体特点,其培养上清效价为10-1～10-2,具有良好的特异性和免疫反应性.结论 研究制备、筛选出抗腐败西瓦菌的特异性抗体,有助于进一步建立重要海洋细菌快速检测试剂盒.     

四种重要生物恐怖毒素液相芯片多重检测方法的建立

目的建立包括蓖麻毒素B(Ricin toxion B,RTB)、肉毒梭菌毒素A(Clostri botulinum toxin A,CBTA)、金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)及产气荚膜毒素ε(Clostridium perfringens toxinε,CPTε)在内的4种重要生物恐怖因子的多重液相芯片检测方法。方法采用双抗夹心法原理和液相芯片技术平台,通过优化偶联抗体浓度和检测抗体浓度以及抗原抗体最佳孵育时间,建立4种生物恐怖因子液相芯片多重检测方法。结果反应条件优化实验结果表明,RTB、CBTA、SEA和CPTε偶联抗体的最佳用量分别为20μg、40μg、80μg、80μg;RTB、CBTA、SEA和CPTε检测抗体的最佳稀释比分别为1∶5000、1∶1000、1∶2000、1∶4000;4种毒素抗原抗体最佳孵育时间为60min。多重检测结果表明,本研究建立的毒素液相芯片多重检测方法可有效检测上述任意1种毒素、任意2种毒素组合、任意3种毒素组合并能同时检测4种毒素。灵敏度检测结果表明,RTB、CBTA、SEA、CPTε检测灵敏度分别为1 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml。结论本研究建立的4种常见生物恐怖毒素液相芯片多重检测方法通过1次检测能同时检测RTB、CBTA、SEA、CPTε,是一种准确、灵敏、快速和高通量的检测方法。     

C型肉毒梭菌毒素应用于旅游点现场的灭鼠试验

笔者于１９９２年６月，在高气温（室外２３～３３．５℃、室内２０～２９℃）条件下，用Ｃ型肉毒梭菌毒素在北方某市两个旅游点进行灭鼠试验，灭效分别为９３．３５％和１００％。基饵为大米，毒素含量为３０００ＭＬＤ／ｇ。国内尚未见同类报道。