巢式PCR在鉴别多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫基因亚型中的应用

目的 探索巢式PCR在鉴别多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫基因亚型中的应用价值.方法 将水泡带绦虫、犬弓首蛔虫、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫羊株和骆驼株等样本的DNA用巢式PCR扩增.结果 巢式PCR可以扩增出多房棘球绦虫和水泡带绦虫,而对细粒棘球绦虫羊株和骆驼株及其他寄生虫均不能扩增出.结论 在鉴别细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫方面,巢式PCR有一定的诊断意义,但不能用于鉴别细粒棘球绦虫基因亚型.     

基于重组酶介导等温扩增技术的3种棘球绦虫核酸检测方法的建立及初步应用

目的　基于重组酶介导的等温扩增技术（recombinase⁃aided isothermal amplification assay, RAA）建立一种快速检测多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫的多重核酸检测方法,并对其检测效果进行初步评价。方法　分别以多房棘球绦虫（GenBank登录号：NC_000928）、细粒棘球绦虫（GenBank登录号：NC_044548）和石渠棘球绦虫（GenBank登录号：NC_009460）线粒体基因组序列为靶序列,依据RAA引物设计基本原则设计、合成3对引物,并进行多重RAA扩增。分别扩增不同浓度3种棘球绦虫基因组DNA和不同浓度含3种靶基因的重组质粒,以评价多重RAA检测方法的敏感性;同时采用该方法检测3种棘球绦虫及多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫基因组DNA,以评价该方法的特异性。优化建立的多重RAA法的条件,再检测棘球蚴病病变组织样本、模拟犬粪便样本和现场狐狸粪便样本,以评价该方法的应用价值。结果　所建立的多重RAA检测方法可在39 ℃时40 min内特异性扩增多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫线粒体基因片段,长度分别约为540、430 bp和200 bp。该多重RAA法对多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DNA的最低检测限为2.0、2.5 pg/μL和3.1 pg/μL,对含多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫靶基因的重组质粒的最低检测限均可达到200拷贝/μL;该多重RAA法可以同时检测出多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫单一感染和多重感染,对多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫无扩增。优化后的多重RAA法能够检测出全部棘球蚴病病变组织样本及模拟犬粪样本和现场狐狸粪便样本中的阳性样品,且与单一PCR法检测结果完全一致。结论　成功建立了一种可用于多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DNA快速检测的多重RAA法,特异性和敏感性均较高。     

粪抗原检测法诊断犬细粒棘球绦虫感染的研究Ⅲ.双抗体夹心ELISA法检测粪抗原诊断家犬细粒棘球绦虫感染的现场评价

本文报道用槟榔碱驱虫法对检测粪抗原诊断家犬细粒棘球绦虫感染的应用价值进行现场比较评价的结果.73只受试犬中有16只对槟榔碱无反应.在导泻成功的57只犬中粪抗原阳性者11只阳性率19.2%.其中驱虫阴性的38只犬中粪抗原阳性者仅2只(5.3%).在10只驱出细粒棘球绦虫的家犬中8只粪抗原阳性.5只驱出泡状带绦虫的犬中粪抗原阳性者1只,但反应强度低.粪抗原的反应强度与细粒棘球绦虫的感染强度呈正相关(r=0.94).证明本法可用于家犬细粒棘球绦虫感染的调查.     

基于重组酶介导等温扩增技术的细粒棘球绦虫核酸检测方法的建立

目的　建立一种基于重组酶介导等温扩增技术（RAA）的细粒棘球绦虫核酸检测方法。方法　针对细粒棘球绦虫12S rRNA基因序列片段,设计、筛选并合成RAA特异性扩增引物和荧光检测探针,构建细粒棘球绦虫荧光RAA检测方法。分别以含靶序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度细粒棘球绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测灵敏度;分别以细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性。结果　成功建立了细粒棘球绦虫荧光RAA检测法,在39 ℃条件下20 min内可以实现对细粒棘球绦虫基因组DNA特异性扩增,最低可以检测出10拷贝/μL含靶序列的重组质粒DNA和0.1 ng/μL细粒棘球绦虫基因组DNA样本,具备较高敏感性;对多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA均无阳性扩增,具备较高特异性;且该荧光RAA法可成功检出细粒球绦虫包囊中DNA。结论　成功建立了一种快速、灵敏、特异的可用于细粒棘球绦虫核酸检测的荧光RAA法。     

粪抗原检测法诊断犬细粒棘球绦虫感染的研究Ⅲ.双抗体夹心ELISA法检测粪抗原诊断家犬细粒棘球绦虫感染的现场评价

本文报道用槟榔碱驱虫法对检测粪抗原诊断家犬细粒棘球绦虫感染的应用价值进行现场比较评价的结果。７３只受试犬中有１６只对槟榔碱无反应。在导泻成功的５７ 只犬中粪抗原阳性者１１只阳性率１９．２％ 。其中驱虫阴性的３８只犬中粪抗原阳性者仅２只（５．３％ ）。在１０只驱出细粒棘球绦虫的家犬中８只粪抗原阳性。５ 只驱出泡状带绦虫的犬中粪抗原阳性者１ 只,但反应强度低。粪抗原的反应强度与细粒棘球绦虫的感染强度呈正相关（ｒ＝ ０．９４）。证明本法可用于家犬细粒棘球绦虫感染的调查。     

新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段95抗原基因克隆及序列分析

目的研究细粒棘球绦虫95抗原(Eg95)基因在新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达及其基因序列差异。方法根据Eg95基因序列设计引物,用PCR方法分别从新疆株细粒棘球绦虫3个不同发育阶段(原头蚴、六钩蚴和成虫)所构建的cDNA文库中克隆获得Eg95目的基因,将其克隆至pUCm-T载体、测序并进行序列分析。结果从3个不同发育阶段的新疆株细粒棘球绦虫cDNA文库中均克隆出Eg95基因,其基因片段长度为402bp,同源性比对分析(BLAST)结果表明,所克隆的新疆株Eg95基因与GenBank中的Eg95基因序列一致。结论Eg95基因在新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段均有表达,其基因序列无差异。     

粪抗原检测法诊断犬细粒棘球绦虫感染的研究Ⅱ.粪抗原检测的敏感性、特异性及实验感染犬排出粪抗原的动态观察

用细粒棘球绦虫成虫虫体抗原及其抗体建立的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ滴定成虫抗原的结果Ａ４５０值与抗原含量呈指数曲线关系,高度相关（ｒ＝０．９８）。实验感染家犬粪抗原含量在２．５－８．０μｇ／ｍｌ之间,因此本法在检测粪抗原中具有足够的敏感性。家犬泡状带绦虫的感染引起的交叉反应是影响本法特异性的主要问题。选择最适的抗体包被浓度可消除交叉反应。用细粒棘球蚴原头节感染家犬后,粪抗原呈低滴度阳性,至２１天后迅速升高。实验感染泡状带绦虫的家犬观察５０天粪抗原均在临界水平之下。作者推荐本法可用于家犬细粒棘球绦虫成虫感染的诊断。     

细粒棘球绦虫基因型的微卫星分析

目的利用细粒棘球绦虫微卫星序列为分型标记,建立高效、快速、简便的鉴定细粒棘球绦虫基因型技术。方法采用FAM和HEX两种不同荧光染料分别标记细粒棘球绦虫的Sca、Emsk、C106微卫星序列引物,利用荧光PCR-基因扫描技术鉴定新疆不同地区CE病人细粒棘球绦虫分离株的基因型。结果44例CE病人的66个分离株标本经PCR及微卫星标记鉴定均为细粒棘球绦虫,其中43例病人的65个细粒棘球绦虫分离株标本为G1基因型;1例病人的1个细粒棘球绦虫分离株标本为G6基因型。结论微卫星标记能够从基因水平快速、精确地鉴定新疆细粒棘球绦虫分离株的基因型,对细粒棘球绦虫的流行病学和致病性研究有重要价值。     

现场应用粪抗原检测法诊断犬细粒棘球绦虫感染的效果评价

目的 评价粪抗原检测法在包虫病流行病学监测中的实际应用价值。方法 家犬在采集粪便后，进行槟榔碱导泻，应用粪抗原检测法检测粪样中的细粒棘球绦虫抗原，并与槟榔碱导泻法的驱虫结果比较，同时分析犬肠道中寄生的其它蠕虫对粪抗原检测结果的影响。结果 在294只槟榔碱导泻成功的家犬中，45只检出细粒棘球绦虫，粪抗原阳性犬共46只。二者的符合率为97．8％。在249只未检出细粒棘球绦虫的家犬中，粪抗原阳性者1只。结论 粪抗原检测法诊断犬细粒棘球绦虫感染具有较高的敏感性和特异性。可作为包虫病常规监测方法推广应用。     

环介导等温扩增技术(LAMP)检测棘球绦虫感染犬粪DNA的研究

目的 建立快速检测棘球绦虫感染犬粪便的DNA检测方法一环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification.LAMP).方法 针对细粒棘球绦虫线粒体DNA Cox1基因6个位点特异性的设计4条LAMP引物,利用LAMP法和普通PCR方法同时检测棘球绦虫、肥胖带绦虫以及犬肠道内...