鸡胚原始生殖细胞的建系方法及其影响因素

学术背景：胚胎原始生殖细胞经体外抑制分化培养可得到胚胎生殖细胞，是胚胎干细胞的又一来源。以其作为外源基因的载体用于制作嵌合体、基因敲除等具有很高的实用价值。 目的：概括性论述鸡胚胎原始生殖细胞建系方法、影响因素及应用前景等问题。检索策略：由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1990—01／2006—04的相关文献，检索词“embryos，primordial germ cells，embryonic stem cells，embryonic germ cells，genital ridge，In vitro culture”，并限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库2000—04／2007—04的相关文献，检索词“胚胎，原始生殖细胞，胚胎干细胞，胚胎生殖细胞，生殖嵴，体外培养”，并限定文章语言种类为中文。共检索到60篇文献，对资料进行初审，纳入标准：①与鸡胚胎原始生殖细胞的建系、影响因素及应用密切相关。②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章。排除标准：重复性研究。 文献评价：文献的来源主要是通过对鸡胚胎原始生殖细胞建系方法、影响因素及应用前景方面内容进行汇总分析。所选用的30篇文献中，7篇为综述，其余均为临床或基础研究。 资料综合：①原始生殖细胞离体培养的关键是保证细胞具备无限增殖能力的同时维持其未分化状态。目前主要通过选择鸡胚原始生殖细胞的适宜分离时期和方法、合理设计培养基、采用饲养层细胞培养以及添加抑制分化的细胞因子等方法来解决。②鸡胚原始生殖细胞的生物学检测主要包括形态学鉴定、碱性磷酸酶活性检测、PAS染色检测、阶段特异性胚胎表面抗原1检测、核型分析、分化试验以及嵌合体试验等方法。③鸡胚原始生殖细胞的应用研究广泛，相比较桑椹胚和囊胚体外培养获取干细胞优势明显；为基础研究提供了最原始的发育生物学模型；生产克隆动物，降低禽类的保种成本；生产药物蛋白，是生产治疗用重组蛋白极为理想的来源。 结论：尽管目前有关鸡原始生殖细胞的培养与应用已取得一定进展，但在生产实践上如何设计出更适合于鸡原始生殖细胞生长的离体培养体系、如何更高效方便地获得鸡原始生殖细胞、如何提高利用原始生殖细胞制作嵌合体的成功率等问题还有待进一步深入研究。     

胚龄及分离方法对小鼠胚胎生殖细胞扩增效率的影响

目的:应用原始生殖细胞进行全能干细胞的研究具有与胚胎干细胞同样广阔的前景,尤其适合于难以从囊胚内细胞团中分离培养胚胎干细胞的动物.但胚胎生殖细胞体外培养条件一直是制约这方面发展的瓶颈.实验设计了体外有效扩增小鼠原始生殖细胞的方法,拟搭建稳定高效的原始生殖细胞培养平台.方法:实验于2006-10/2007-08在重庆医科大学组织胚胎学教研室重庆市生物化学分子药理学重点实验室完成.①实验材料:清洁级昆明孕鼠由重庆医科大学动物实验中心提供,见阴栓计为0.5 d胚龄,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:取胚龄8.5 d胎鼠尾端尿囊及周围组织, 取胚龄9.5～10.5 d胎鼠后肠及周围组织,取胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠生殖嵴及周围组织,分别经0.25%胰酶-0.02?TA消化并接种于0.1%明胶包被的培养皿中.比较不同妊娠时间点取材对原代、F1代胚胎生殖细胞克隆形成的影响.采用SSEA-1免疫组织化学法计数细胞阳性率,计数胚胎生殖细胞克隆联合MTT法比较胚龄11.5 d,12.5 d两个时间点原始生殖细胞的增殖能力.比较上述两种取材培养方法对胚龄11.5 d,12.5 d原始生殖细胞扩增的影响.采用碱性磷酸酶染色、免疫组化检测SSEA-1、免疫荧光检测Nanog,体外分化实验鉴定分化能力.结果:①胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠原代和F1代集落形成率较胚龄8.5～10.5 d高,扩增效率显著提高(P < 0.01).②免疫组织化学法检测分离的胚龄11.5 d,12.5 d原始生殖细胞 SSEA-1阳性率差异不显著 (P > 0.05).原代第3天克隆计数显示,胚龄11.5 d胎鼠高于12.5胚龄胎鼠 (P < 0.01),MTT数据显示11.5胚龄组稍高于12.5胚龄组.③两种方法对胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠胚胎生殖细胞集落形成无显著性差异(P > 0.05),但生长方式有所不同.④克隆胚胎生殖细胞呈典型的胚胎干细胞样集落生长,能稳定传代;碱性磷酸酶、SSEA-1、Nanog表达强阳性;体外能分化为囊状类胚体.结论:胚龄11.5 d和12.5 d胎鼠,尤其是胚龄11.5 d胎鼠扩增原始生殖细胞效率较高,在这两个时间点运用与周围组织共培养法和生殖嵴分离培养法均适宜.     

构建人热休克蛋白70基因重组腺病毒载体及鉴定

背景:腺病毒载体作为低毒高效的基因载体己被广泛应用,但是人热休克蛋白70基因腺病毒载体较为少见.目的:构建重组人热休克蛋白70基因的腺病毒载体,鉴定外源基因在真核细胞中的良好表达.方法:采用AdMax腺病毒系统将外源基因人热休克蛋白70基因重组入腺病毒载体中,转染人胚肾293细胞并重组包装出毒,检测外源基因的表达和病毒滴度.结果与结论:观察转染后的人胚肾293细胞出现明显细胞病变效应后,收获并纯化重组病毒;荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况良好,Western blot检测人热休克蛋白70蛋白表达良好,收获病毒的滴度为1×1011 efu/mL,证明实验己成功构建携带人热休克蛋白70基因的重组腺病毒载体.     

小鼠白细胞介素10重组腺病毒载体构建及对树突状细胞的基因修饰

背景:对于抗原递呈细胞树突状细胞及其分泌的细胞因子白细胞介素10在气道高反应性和炎症中的作用国内外文献报道较少.目的:构建小鼠白细胞介素10腺病毒重组体Ad-mIL-10,获得小鼠白细胞介素10基因修饰的树突状细胞,以期为下一步基因治疗的动物实验打下基础.方法:通过人工合成获得小鼠白细胞介素10基因,根据白细胞介素10基因序列及腺病毒载体的多克隆位点,合成包括酶切位点的基因序列,连接到pMD18-T载体并测序鉴定.用基因工程的方法将小鼠白细胞介素10基因克隆到BDAdeno-X~(TM)腺病毒载体,于人胚肾293细胞中包装、扩增病毒并测定白细胞介素10蛋白表达,转染到体外培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞.结果与结论:成功构建了小鼠Ad-mIL-10重组腺病毒载体并高包装、扩增成功,测定高表达白细胞介素10蛋白,体外成功培养小鼠骨髓来源的小鼠树突状细胞并顺利转染Ad-mIL-10.提示用基因工程方法构建小鼠Ad-mIL-10重组腺病毒载体并转染小鼠骨髓来源的树突状细胞是可行的,可为进行相关基因治疗的可能性提供更充足的理论依据.     

人胚胎原始生殖细胞移植治疗大鼠急性肝损伤

目的:胚胎原始生殖细胞能以原始胚胎状态无限增殖,并可通过异体移植或适宜的体外环境自然分化为胚胎生殖层.实验拟进一步观察体外培养的胚胎原始生殖细胞对急性肝损伤大鼠的治疗效果,及其能否在大鼠体内分化为肝细胞.方法:实验于2003-09/2005-05在中南大学肝病研究所完成.①细胞及动物:经中南大学湘雅二医院医学伦理委员会批准,取孕4～12周流产人胚胎,其双亲3代内无遗传性疾病,孕妇对流产胚胎用于实验均签署知情同意书.清洁级健康成年SD大鼠50只,随机数字表法分为5组:培养基对照组、单纯人胚原始生殖细胞组,人胚原始生殖细胞 环磷酰胺组、单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞 环磷酰胺组,10只/组.另选取健康成年SD孕鼠4只用于分离鼠胚原始生殖细胞.动物均由中南大学湘雅二医院动物实验中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:从人胚胎中分离出原始生殖嵴组织,悬浮培养获取人胚原始生殖细胞,用含15%胎牛血清的高糖DMEM基础培养基调节细胞浓度至1×108L-1.取SD孕鼠胚胎分离牛殖嵴,消化离心培养鼠胚原始生殖细胞,浓度1×108L-1.各组大鼠均于腹腔内注射D-氨基半乳糖建立急件肝损伤模型,造模后48 h,培养基对照组自尾静脉输注基础培养基,其余4组给予对应细胞悬液及免疫抑制荆环磷酰胺.③实验评估:从细胞形态、表面标记及体外分化等方面检测人胚原始生殖细胞的生物学特性;比较各组大鼠肝功能、增殖细胞核抗原阳性率、糖原染色阳性率、肝脏病理改变;检测各组大鼠肝脏病理切片中人白蛋白、甲胎蛋白的表达.结果:①人胚原始生殖细胞的生物学特性:培养1d后单个原始生殖细胞形成细胞集落,以后集落逐渐增大并隆起,形成鸟巢状,周边界限清晰,内部细胞排列紧密.传代后原始生殖细胞集落呈自发分化趋势,周边出现成纤维样细胞,最后分化为梭形细胞、多边形细胞等.原代全第3代未分化的人胚原始牛殖细胞集落碱性磷酸酶染色均呈阳性,分化的细胞及成纤维细胞呈阴性.②肝功能榆测:细胞输注前各组内氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素水平均基本相似(t=0.361～1.183,P均＞0.05).输注后7 d与培养基对照组比较,单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞 环磷酰胺组上述3项指标水平均明显降低(t=2.532～8.361,P均＜0.05):后两组间比较差异无显著性意义(t=0.340～1.712,P均＞0.05).③增殖细胞核抗原阳性率:细胞输注后7d与培养基对照组比较,单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞 环磷酰胺组的增殖细胞核抗原阳性率均明显升高(t=9.020～10.747,JP均＜0.001):后两组间比较差异无显著性意义(t=0.752,P=0.462).④糖原染色:细胞输注后7 d,培养基对照组着色相对浅淡,呈细颗粒状,;单纯鼠胚原始牛殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞 环磷酰胺组着色相对深粗,呈斑块状聚集.⑤病理检测:细胞输注后7 d,培养基对照组肝索、肝窦结构排列欠规则,坏死区可见少量肝细胞再生,汇管区有大量炎症细胞浸润;单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞 环磷酰胺组各项病理情况均显著改善.⑥大鼠肝组织人白蛋白、甲胎蛋白的表达:细胞输注后14,21 d,单纯人胚原始生殖细胞组、人胚原始生殖细胞 环磷酰胺组表达人白蛋白及甲胎蛋白阳性细胞,培养基对照组未见表达.结论:①胚胎原始生殖细胞移植有利于激发急性肝损伤大鼠肝细胞的增殖,改善肝功能,加速受损肝细胞的病理修复.②胚胎原始生殖细胞可在受体肝脏组织中生存,并分化为具有合成白蛋白及甲胎蛋白功能的肝细胞样细胞.     

通过Fas-FasL途径体外清除小鼠同种异体反应性T细胞

目的　通过Fas Fas配体 (FasL)途径清除小鼠同种异体反应性T细胞 (ARTC) ,为减轻异基因骨髓移植 (allo BMT)后的移植物抗宿主病探索新的手段。方法　用磁性细胞分离系统分离BALB c小鼠 (H 2 d)Sca 1+早期造血细胞 (HC) ,然后借助逆转录病毒基因转移技术对其转染外源小鼠FasL(mFasL)cDNA基因 ;扩增 1周后与异基因BAC小鼠 (H 2 d ×b)脾细胞进行单向混合淋巴细胞培养(OWMLC) 6d ,观察处理后的BAC小鼠脾细胞对Na251 CrO4标记的BALB c小鼠脾细胞的杀伤作用。结果　成功分离出BALB c小鼠Sca 1+HC ,纯度为 (89.0± 6 .1) %。BAC小鼠脾细胞与转染外源mFasL的BALB cHC以 1∶5比例共培养 6d后 ,对BALB c源脾细胞杀伤率在不同效、靶比例时均呈显著降低 (P<0 .0 1)。结论　体外反应中 ,转染外源mFasLcDNA并高表达的早期HC可清除针对自身MHC抗原的ARTC。     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

背景:骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增,还易于外源基因的转入及表达,在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞.目的:探讨脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其基因的表达.设计:单一样本观察.单位:大连市干细胞与组织工程研发中心,大连医科大学基础医学院生化室.材料:实验于2006-03/2007-06在大连市干细胞与组织工程研发中心及大连医科大学基础医学院生化室完成.新西兰大白耳兔,5月龄,雌雄不拘,体质量2.0～2.5 kg.方法:以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板,用PCR方法获得目的基因片段,定向克隆至载体pMD19-T,限制性内切酶消化鉴定、基因测序后,构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒.同时对兔骨髓间充质干细胞取材、培养、鉴定.真核表达质粒经酶切鉴定后,采用Lipofectamine 2000介导法转染经过鉴定的兔骨髓间充质干细胞.并于转染后24 h 在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.主要观察指标:表达载体的构建及基因转染骨髓间充质干细胞鉴定.结果:实验克隆出胞嘧啶脱氨酶基因,并将其与带荧光的真核表达载体pIRES2-AcGFP1连接.经转染兔骨髓间充质干细胞24 h 后,在倒置荧光显微镜488 nm 蓝光激发下观察,pIRES2-AcGFP1-CD组和pIRES2-AcGFP1空载体组均可见细胞发出绿色荧光,未经转染的细胞未见发出绿色荧光,说明胞嘧啶脱氨酶基因成功转染了骨髓间充质干细胞.结论:骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体.     

重组外源性人热休克蛋白70基因真核表达载体的构建及鉴定

背景:热休克蛋白70的肿瘤免疫作用近年来受到国内外学者的广泛关注,然而目前常用的诱导内源性热休克蛋白70表达的方法,如热应激、缺血预处理等均存在一些弊端.目的:拟构建携带并正确表达外源性人热休克蛋白70基因的重组真核表达载体.方法:外源性热休克蛋白70基因连接入真核表达载体pDC315-EGFP中,转化大肠杆菌感受态细胞,重组真核表达载体外源基因测序及PCR检测鉴定阳性克隆后转染人胚肾293细胞,荧光显微镜及western blot鉴定外源基因在细胞中的表达.结果与结论;经PCR和测序证实外源性人热休克蛋白70基因正确重组入真核表达载体pDC315-EGFP,转染293细胞后荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白GFP的表达,Western blot检测到热休克蛋白70在293细胞中有效表达.     

壳聚糖季铵盐作为基因递送载体的初步研究

背景:非病毒载体因其安全性好而在基因治疗领域赢得了广泛的关注,各种各样的非病毒载体处在不断的研究中,壳聚糖季铵盐作为一种新的生物材料,同样也具有作为基因递送载体的潜质.目的:考察壳聚糖季铵盐体外基因转染活性,寻求一种新的非病毒基因载体递送系统.设计、时间及单位:对比观察实验,于2008-04/12在浙江省医学科学院生物工程所完成.材料:质粒pcDNA3.1-EGFP为浙江省医学科学院生物工程实验室保存.以3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵作为改性剂制备壳聚糖季铵盐,用复凝聚法制备载基因纳米粒.方法:凝胶阻滞实验分析壳聚糖季铵盐包裹质粒的能力,DNase Ⅰ的保护实验分析载基因纳米粒的抵抗核酸酶降解的能力,体外基因转染实验评价纳米粒的体外转染活性,用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪测定转染结果.通过考察转染液中有无牛血清和递送不同剂量的基因对转染效率的影响,寻求本递送系统较好的转染条件.另外,用MTT法测定壳聚糖季铵盐的细胞毒性.主要观察指标:壳聚糖季铵盐和pcDNA 3.1-EGFP以何种比例结合形成的纳米粒、转染液中有无牛血清,质粒的量为多少时对人胚肾T细胞的转染效率足最高的;不同浓度的壳聚糖季铵盐对细胞生长的影响.结果:壳聚糖季钱盐纳米粒能转入人胚肾T细胞,虽然转染效率略逊丁聚乙烯亚胺,但是细胞毒性明显小于聚乙烯亚胺.壳聚糖季铵盐纳米粒转染细胞72 h后效率较高,经综合分析,当pcDNA质量为2 μg,壳聚糖季铵盐和pcDNA以质量比为5结合形成的纳米粒,在无血清条件下对人胚肾T细胞进行转染,转染效率足最高的.结论:壳聚糖季铵盐纳米粒能将基因递送到细胞内,并且报告基因能在细胞内表达.因此,壳聚糖季铵盐用做基因递送的载体系统值得进一步的研究.     

小鼠Wnt-3a基因真核表达载体的构建及其在cos-7细胞中的表达

目的:克隆小鼠胚脑中Wnt-3a基因片段,构建pSecTag2／Hygro B-Wnt3a 真核表达载体,观察其在cos-7细胞中的表达,为基因治疗脊髓损伤提供实验依据。方法:实验于2004-09／2005-03在安徽医科大学分子生物学实验室完成。选取清洁级孕13．5 d的KM小鼠1只,脱颈处死,冰冷条件下迅速取出胚鼠,解剖显微镜下剥离胚脑,在无RNA酶污染的条件下迅速提取胚脑总RNA。利用反转录聚合酶链方法扩增小鼠胚脑Wnt-3a基因片段,将该基因片段克隆入T载体,聚合酶链反应法筛选并测序,双酶切后构建重组真核表达载体pSecTag2／Hygro B-Wnt3a。转染并筛选稳定表达的cos-7细胞,Western blot鉴定重组Wnt-3a蛋白的表达。结果:①反转录聚合酶链反应获得目的基因小鼠Wnt-3a cDNA:自胚鼠脑组织总RNA经反转录聚合酶链反应扩增后,凝胶电泳可见约1．1kb的特异性扩增片段,与预期获得产物大小相符。②pMD18-T/Wnt3a克隆质粒聚合酶链反应初步筛选与测序:测序报告所克隆的Wnt-3a为1 058 bp,通过Blast同源性分析,与GeneBank收录的序列一致,克隆小鼠Wnt-3a 基因获得成功。③真核表达载体pSecTag2／Hygro B-Wnt3a的双酶切及测序:随机挑选10个克隆,聚合酶链反应扩增筛选出阳性克隆5个,经 XhoⅠ和HindⅢ双酶切鉴定、测序及。Blast分析鉴定重组质粒构建成功。④Western Blot鉴定重组小鼠Wnt-3a蛋白在cos-7细胞中的表达:脂质体转染cos-7后48 h,Western Blot鉴定出在细胞内存在Wnt-3a蛋白的表达,转染pSecTag2／Hygro B-Wnt3a的cos-7细胞裂解液在45KD处出现阳性条带,而培养上清中未能检测到蛋白的表达。结论:小鼠胚脑Wnt-3a基因的真核表达载体pSecTag2／Hygro B-Wnt3a 构建成功,转染cos-7细胞后能够表达重组Wnt-3a蛋白。