rhIL-2/GM-CSF融合蛋白抗体制备、鉴定及其生物学活性研究

目的：制备rhIL-2/GM-CSF融合蛋白的抗体,并观察该抗体的特异性及对融合蛋白生物学活性的影响。方法：用纯化的融合蛋白（rhIL-2/GM-CSF）作为抗原,免疫新西兰兔后制备抗血清,用ELISA和Dot-ELISA检测抗体滴度和特异性。用依赖株细胞增殖实验检测抗体对rhIL-2/GM-CSF生物学活性的影响。结果：此抗体效价高,特异性好,不仅与融合蛋白（rhIL-2/GM-CSF）、IL-2以及GM-CSF发生反应,而且能够竞争抑制rhIL-2/GM-CSF的生物学活性。结论：此抗体可用于融合蛋白（rhIL-2/GM-CSF）的结构和功能研究。     

白细胞介素2增强HBV基因疫苗的免疫效应

目的：构建乙型肝炎病毒基因疫苗ｐＣＲ３．１－Ｓ,观察重组人白细胞介素２（ｒｈＩＬ－２）作为佐剂对其诱导ＮＡＬＢ／ｃ小鼠产生免疫应答的影响．方法：以ＥＬＩＳＡ法检测免疫小鼠血清抗ＨＢｓ,另用＾３Ｈ－ＴｄＲ参入法测定淋巴细胞增殖活性,初步研究不同免疫组的体液和细胞免疫应答．结果：ｒｈＩＬ－２组免疫小鼠抗ＨＢｓ抗体和淋巴细胞增殖活性与对照组相比有显著差异（Ｐ〈０．０５）．结论：ＨＢＶ基因疫苗可诱发ＢＡＬ     

Preparation of anti-HER2 monoclonal antibody-paclitaxel immunoconjugate and its biological evaluation

Anti-HER2 monoclonal antibody (Sc7301)-paclitaxel (TAX) immunoconjugate was prepared and its specific binding to tumor cells was investigated in this study.Sc7301 was conjugated to　TAX by the active es...     

重组人白细胞介素6对人肺癌细胞系生长的调控及机制研究

探讨重组人白细胞介素６（ＩＬ－６）对人肺癌生长调控作用及机制。方法以人肺巨细胞癌系ＰＧ和人肺腺癌细胞系ＰＡａ为研究对象，研究ｒｈＩＬ－６对ＰＧ、ＰＡａ细胞体外生长的作用；并应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测ｒｈＩＬ－６对ＩＬ－６、ＩＬ－６受体（ＩＬ－６Ｒ）、ｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ等基因表达的影响。结果发现ｒｈＩＬ－６促进ＰＧ、ＰＡａ细胞生长，呈浓度依赖性和时间依赖性。逆转录聚合酶链反应检测证实，ＰＧ、ＰＡａ细胞均表达ＩＬ－６及ＩＬ－６ＲｍＲＮＡ。ｒｈＩＬ－６上调ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ及ｃ－ｍｙｃ等基因表达，而对ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ基因表达无明显影响。结论ｒｈＩＬ－６促进ＰＧ、ＰＡａ细胞生长；ｒｈＩＬ－６上调ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ及ｃ－ｍｙｃ等基因表达作用可能与其促进ＰＧ、ＰＡａ细胞生长有关     

白细胞介素-6与肾癌细胞生长关系的实验研究

目的　研究白细胞介素 6 (IL 6 )在肾癌细胞系GRC 1中的表达及其意义。方法　运用ELISA方法检测GRC 1培养上清中IL 6的浓度 ,运用免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应 (RT PCR)在翻译和转录水平上检测IL 6及其受体系统的表达 ;观察重组人IL 6和IL 6中和抗体对GRC 1生长的影响 ;用表达IL 6反义RNA的质粒转染GRC 1,观察其增殖的改变。结果　GRC 1培养上清IL 6浓度为 46 5pg/ml,RT PCR显示IL 6mRNA及IL 6受体mRNA有表达 ;在重组人IL 6和IL 6中和抗体作用下生长无明显改变 ;转染表达IL 6反义RNA的质粒以后 ,GRC 1细胞IL 6分泌下降到 2 5 0pg/ml,但生长未受抑制。结论　尽管肾癌细胞系GRC 1可以表达IL 6 ,但重组人IL 6不能促进GRC 1的增殖 ,中和抗体和反义基因不能抑制细胞增殖 ,提示IL 6可能不是GRC 1的生长因子 ;GRC 1可以表达IL 6受体系统 (IL 6R和gp130 ) ,提示IL 6的信号传导中断可能发生在受体下游。     

抗小鼠激活T淋巴母细胞抗体的诱导及鉴定

用伴刀豆蛋白A(Con A)体外诱导的T淋巴母细胞免疫同系小鼠获得的抗体,能与不同品系小鼠的T淋巴母细胞和杀伤性T淋巴细胞株(CTLL2)起结合反应,并能抑制CTLL2细胞的增殖,阻断Con A诱导小鼠脾细胞转化及混合淋巴细胞反应等生物学特性,结果提示:该抗体具有抗小鼠白细胞介素2受体的特征。     

重组人白细胞介素18对小鼠骨髓细胞移植后急性移植物抗宿主病的影响

目的：探讨重组人白细胞介素18（rhIL-18）对小鼠异基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病（aGVHD）的影响,为rhIL-18用于临床移植免疫提供理论基础。方法：受体鼠（BALB／c）接受9．0Gy剂量的X-射线照射之后,通过其尾静脉注射供体鼠（C57BL／6）的骨髓细胞和脾细胞,并于移植的-2～＋2d腹腔注射rhIL-18。移植后观察受体鼠的临床症状和存活状况,同时检测其肝脏、结肠和耳朵的病理变化。结果：移植后aGVHD期内,用rhIL-18治疗的受体鼠GVHD症状积分较未接受rhIL-18治疗的受体鼠低（P ＜ 0．05）,肝脏和结肠的病理变化轻（P ＜ 0．05）,短期存活时间延长（P ＜ 0．05）,但对长期生存率无明显影响。结论：受体鼠早期接受rhIL-18治疗,可在移植后aGVHD期内降低aGVHD的病变程度,为rhIL-18在临床上预防和治疗aGVHD提供了实验依据。     

人IL-2重组腺病毒转染人肺腺癌细胞的体外生物学特性的研究

目的 在利用COS／TPC同源重组法高效制备hIL-2重组腺病毒基础上，对感染人IL－2重组腺病毒的人肺腺癌细胞（Anip973）的体外生物学特性进行研究。方法 将携带有人IL－2基因的重组腺病毒（rAd-hIL-2）感染人肺腺癌细胞系，通过细胞生长实验、克隆形成实验、流式细胞分析、形态学检查等观察其对Anip973肿瘤细胞的作用；利用PCR和琼脂糖电泳对肺癌中人IL－2基因进行了检测。结果 rAd-hIL-2经扩增、纯化后，滴度可达10^10PFU/ml，当病毒为30MOI时，对Anip973细胞的转染率达90％以上。转染的Anip973肿瘤细胞除表面结构和超微结构有轻微变化外，其生长能力、克隆形成率及细胞周期等无明显变化。结论 腺病毒介导的细胞因子基因hIL-2转染的Anip973肿瘤细胞未见明显变化。     

激活骨髓和淋巴因子激活的杀伤细胞生物活性的实验研究

目的 :证实激活骨髓 (Activated bone marrow,ABM)具有与淋巴因子激活的杀伤 (LAK)细胞不同的生物学效应。方法 :应用重组白细胞介素 - 2 (r IL - 2 )、抗 CD3 单抗体外激活骨髓和外周血单个核细胞 ,以 MTT比色分析法测定 ABM、L AK细胞的杀伤活性 ,采用甲基纤维素半固体培养法进行粒 -巨噬细胞系祖细胞 (CFU- GM)、红系祖细胞 (BFU- E)培养。结果 :r IL- 2 +抗 CD3 单抗激活的 ABM组杀伤活性最强 (6 5 .8± 9.2 ) % ,r IL - 2激活的 ABM组次之为 (5 6 .3± 7.9) % ,活性强于相同条件下的 L AK组 ,两组差异具有显著性 (P<0 .0 1)。增殖倍数与相同条件下的 LAK细胞相比差异亦具有显著性。体外激活 3～ 5 d的 ABM与同期培养的未激活的骨髓细胞相比 BFU- E、CFU- GM形成率差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ,LAK细胞则不具有造血祖细胞活性。结论 :ABM的杀伤活性和增殖效应明显强于 L AK细胞 ,且能保持造血祖细胞活性 ,抗 CD3 单抗能够促进 r IL - 2诱导的 ABM抗肿瘤活性和增殖效应 ,不损伤造血祖细胞活性 ,是优于 LAK细胞的过继免疫疗法。     

重组抗死亡受体5人-鼠嵌合抗体的表达和活性研究

目的 获得重组抗死亡受体5(DR5)全长人-鼠嵌合抗体表达并研究其生物学活性.方法 利用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶(Furin)/口蹄疫病毒2A多肽(F/2A)连接人-鼠嵌合抗体的重链和轻链,形成一个开放阅读框(ORF),插入慢病毒表达载体pWPXL,构建重组抗DR5全长人-鼠嵌合抗体表达载体pWPXL-HF2AL;采用Western印迹测定该嵌合抗体的表达和采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其与抗原的结合特异性;使用四唑氮盐(MTS)比色法分析其对肿瘤细胞的杀伤活性.结果 利用F/2A多肽技术表达的人-鼠嵌合抗体可在F/2A处自我剪切,人-鼠嵌合抗体的轻、重链表达对称并具有与其母本鼠源抗体相似的亲和力和杀伤多种肿瘤细胞的活性.如含3μg/ml嵌合抗体的培养基使结肠癌细胞HCT116、肝癌细胞SMMC7721、肺癌细胞A549和神经胶质瘤细胞U251的细胞存活率分别降低至20.6%±2.6%,35.1%±2.7%,76.1%±6.2%和15.6%±2.0%.结论 成功实现F/2A多肽介导的全长人-鼠嵌合抗体的表达,为肿瘤的生物治疗提供了新的策略.

Abstract：

Objective To express a full-length human-mouse chimeric anti-DR5 antibody from a single open reading frame with tumoricidal activity to various cancer cells.Methods The heavy and light chains of chimeric antibody were joined by the Furin and 2A (F/2A) self-cleavage peptide and cloned into a lentiviral vector of pWPXL.Then the HEK293 cells were infected with the constructed expression vector pWPXL-HF2AL.Western blot,enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and MTS assay were used to detect the chimeric antibody expression,cleavage,binding affinity to the antigen and tumoricidal activity to various tumor cells.Results The recombinant chimeric antibody was successfully expressed from a single open reading frame in pWPXL-HF2AL construct.And it possessed a similar binding affinity to the parental murine counterpoint and strong tumoricidal activity to various cancer cells.For example,on the concentration of 3 μg/ml,it made the relative cells viability of HCT116,SMMC7721,A549 and U251 down to 20.6% ±2.6% ,35.1% ± 2.7% ,76.1% ±6.1% and 15.6% ±2.0% respectively.Conclusions The human-mouse chimeric anti-DR5 antibody of F/2A peptide is successfully expressed.Possessing a strong tumoricidal activity in various cancer cells,it may provide a novel strategy for cancer biotherapy.     

IFN-γ对体外培养系统中IL-18诱导的肿瘤快速杀伤效应的影响

目的 :建立体外培养系统 ( CCs) ,应用 rh IL- 1 8在 CCs中诱导肿瘤快速杀伤效应 ,探讨IFN- γ在快速杀伤效应中的作用。方法 :采用 Stem Sep TM免疫磁性细胞分离法分离人外周血 NK细胞、T细胞及树突状细胞 ( DCs) ;流式细胞仪分析细胞表型 ;细胞毒实验检测杀伤活性 ;ELISA方法检测 IFN-γ的产生量。结果 :在 CCs中 ,rh IL- 1 8能单独诱导一种快速肿瘤杀伤作用 ,其杀伤作用随rh IL- 1 8浓度的增加而增高 ;rh IL- 1 8能够诱导 CCs产生 IFN-γ,并促进 m RNA的表达 ,但其作用不如 rh IL- 1 2 + rh IL- 1 8明显 ;抗 IFN- γ单抗对 rh IL- 1 8诱导的快速肿瘤杀伤效应无明显影响。结论 :IL- 1 8能够在 CCs中有效地诱导快速肿瘤杀伤效应 ,且这种杀伤效应不依赖 IFN- γ无关途径     

创伤小鼠核转录因子AP-1活性及IL-2表达变化

目的 探讨创伤后脾细胞核转录因子激活蛋白－１（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ－１，ＡＰ－１）的ＤＮＡ结合活性和ＩＬ－２表达的动态变化及它们间的关系。方法 采用小鼠双后肢闭合性砸伤＋骨折模型，于创伤后６、１２ｈ，１、４、７、１０、１４ｄ处死动物，分离脾细胞，经ＣｏｎＡ刺激细胞后收集培养上清以测定ＩＬ－２活性；提取脾细胞ＲＮＡ以测定ＩＬ－２ ｍＲＮＡ；提取脾细胞核蛋白，用电泳迁移率改变试验（Ｅｌｅ     

人的可溶性L-selectin(sL-selectin)在杆状病毒载体系统中的表达与纯化

目的利用昆虫细胞杆状病毒系统表达人的重组可溶性L-型选择蛋白配体凝集素（human recombinant soluble L-selectin：sL-selectin），探索在真核细胞中高效表达人的重组可溶性L-型选择蛋白配体凝集素的新途径。方法将已经重组好的杆状病毒感染昆虫细胞，表达sL-选凝素于细胞培养上清，利用末端连接的ZZ-结构域（蛋白A来源的首尾相连的二聚化Z结构域）与IgG-琼脂糖-6的结合而分离纯化，通过SDS-PAGE鉴定分子量的大小，并用特异性抗体验证，另外通过重组的sL-选凝素与SMMC7721的黏附观察其活性。结果sL-选凝素可在昆虫细胞中表达，产物的分子量约为46000，与人肝癌细胞SMMC7721的结合率可达70％。结论sL-选凝素可通过杆状病毒载体在昆虫细胞中有效表达，分离纯化后依然保持生理活性。     

Purification and renaturation of recombinant human interleukin-2-pseudomonas exotoxin (IL2-PE66(4GLU)) fusion protein.]

OBJECTIVE: To evaluate the effect of a novel approach for purification and renaturation of recombinant human interleukin-2-pseudomonas exotoxin (IL2-PE66(4Glu)) fusion protein. METHODS: A novel purification method established in our laboratory was adopted for the purification of the inclusion body, and after renaturation, recombinant human IL2-PE66(4Glu) fusion protein was purified by DEAE-Sepharose FF ion-exchange chromatography. RESULTS: The purity of the fusion protein that retain its biological activity was as high as 95%, and a recovery rate over 80% of the refolded IL2-PE66(4Glu) fusion protein was achieved. CONCLUSION: The purification and refolding method for inclusion body adopted in this study is simple and practical, which lays the foundation for a large-scale production of the fusion protein.     

重组鼠I型可溶性白细胞介素-1受体的生物活性测定

目的建立测定可溶性白细胞介素－１受体生物活性的方法并鉴定鼠重组的Ｉ型可溶性白细胞介素－１受体是否具有生物活性。方法 以生物素标记人ＩＬ－１β为配基，建立了蛋白印变转移受体配基结合反应和酶联免疫受体配基结合反应分析方法，测定了在昆虫细胞中表达的小鼠ｓＩＬ－１ＲＩ；同时进行了ＩＬ－１β生物活性阻断作用实验。     

小鼠B7-1和B7-2基因转染EL4细胞瘤苗抗肿瘤免疫作用的比较研究

目的：研究冠状动脉分流（CABG）术后冠状动脉竞争血流对左乳房内动脉（LIMA）桥血流中内皮素（ET）、一氧化氮（NO）含量的影响，探讨动脉桥血管早期衰坏的分子机制。方法：建立猪CABG术后桥血管竞争血流动物模型，利用血流闭塞器造成冠状动脉不同程度狭窄，测量桥血管血流量及方向变化，并采用放射免疫分析法及硝酸还原酶法分别检测LIMA桥血流中ET、NO含量并进行对比分析。结果：冠状动脉左前降支（LAD）近端狭窄程度越轻，LIMA桥血流量越少；LAD近端未完全闭塞时，LIMA桥均出现双向血流。CABG术后LIMA桥血流ET含量明显高于移植前(P＜0.05)，NO含量明显低于移植前(P＜0.05)。LAD近端冠脉竞争血流越大，LIMA桥血流NO含量越低。LIMA桥血流NO含量与LIMA桥血流量呈正相关（r=0.957,P＜0.05）。LAD近端30％狭窄时，NO含量明显低于LAD近端90％狭窄及全部闭塞时(P＜0.05)，LAD近端50％狭窄时，NO含量明显低于LAD近端全部闭塞时(P＜0.05)。LIMA桥血流ET含量有随LAD近端冠脉竞争血流增加而升高的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：来自未完全闭塞冠状动脉的竞争血流可引起LIMA桥血流量下降，产生双向血流，并导致桥血流中NO含量显著下降。     

重组人Versican G1蛋白在昆虫细胞中的表达

目的：利用杆状病毒．昆虫细胞表达系统制备人蛋白聚糖Versican G1区(VG1)的重组蛋白。方法：将编码人VG1蛋白343个氨基酸的基因插入pFastBacl载体，转化大肠杆菌DH10Bac，提取重组Bacmids转染Sf9昆虫细胞，获取含重组人VG1蛋白的杆状病毒进一步感染昆虫细胞进行蛋白表达。通过Ni—NTA层析柱对重组蛋白进行纯化。免疫印迹方法对昆虫细胞培养上清中的蛋白成分进行鉴定，采用透明质酸结合实验确定重组人VG1蛋白的生物活性。结果：人VG1基因在昆虫细胞中获得高水平表达，重组人VG1蛋白具免疫原性和与透明质酸结合的生物活性。结论：昆虫细胞表达的重组人VG1蛋白具有良好的免疫原性和生物活性。     

Bax对人卵巢癌细胞的凋亡诱导作用及其机制研究

目的 观察Bax对人卵巢癌A2780细胞的凋亡诱导作用,并探讨其作用机制。方法 构建重组质粒pcDNA-Bax,将重组质粒pcDNA-Bax转染A2780细胞,采用Hoechst 33258染色观察细胞凋亡、MTT法检测细胞活力,采用Western blot法检测Bax基因的过表达、线粒体细胞色素C的释放及Caspase-9和Caspase-3的激活。 结果 经酶切和测序鉴定,重组质粒pcDNA-Bax构建成功。转染质粒pcDNA-Bax能明显诱导A2780细胞凋亡,Hoechst染色显示凋亡的细胞出现细胞核形态学改变;MTT结果显示转染质粒pcDNA3.1-Bax后,细胞活力明显下降;Western blot结果表明转染质粒pcDNA-Bax后的A2780细胞线粒体释放细胞色素C,激活了Caspase-9和Caspase-3。 结论 Bax能促进卵巢癌细胞线粒体细胞色素C释放,从而诱导细胞凋亡。     

人白细胞介素-6基因的克隆表达和纯化的研究

目的：研究人ＩＬ ６基因在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的纯化。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了人ＩＬ ６ｃＤＮＡ,用ｐＢＶ２２０载体对ＩＬ ６基因进行了表达调控研究,用阴离子交换柱和凝胶柱对表达产物进行纯化,用ＭＴＴ法测定ｒｈＩＬ ６的活性。结果：表达调控研究发现,当ＳＤ序列到ＡＴＧ之间的距离为６ｂｐ和１０ｂｐ时在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶上未见明显表达,而当距离为５ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ时均可获高效表达,最高表达量占菌体总蛋白的２６％。表达产物经变性复性及纯化后产品纯度达９８％,比活性为１１×１０８Ｕ／ｍｇ。结论：本研究为ｒｈＩＬ ６的中试生产奠定了坚实的基础     

过表达ODC抑制氧化应激诱导大鼠心肌细胞凋亡的研究

目的构建过表达鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因慢病毒载体,并研究其对氧化应激诱导大鼠H9C2心肌细胞凋亡的影响。方法构建大鼠ODC基因pHIV-ODC过表达质粒,与包装质粒psPAX2、pMD2G共转染293FT细胞,检测其侵染效率;包装慢病毒并侵染H9C2心肌细胞;72 h后观察其侵染效率,RT-PCR法检测细胞ODC mRNA的表达,利用CCK-8、Hochest33258染色检测ODC对H2O2诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响。结果酶切及测序鉴定ODC序列正确插入慢病毒过表达载体。侵染H9C2细胞72 h后ODC mRNA水平较阴性慢病毒感染组显著升高。过表达ODC能抑制H2O2诱导的细胞活力下降,减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡,与H2O2组比较差异均有统计学意义(P<0.001)。结论成功构建的过表达ODC慢病毒,上调H9C2细胞中ODC的表达,过表达ODC能显著抑制氧化应激诱导的H9C2心肌细胞凋亡。