miR-375对人结肠癌细胞株HCT116活性、细胞周期及凋亡的影响

目的:探讨微小RNA-375(microRNA-375,miR-375)对人结肠癌细胞HCT116活性、细胞周期及凋亡的影响。方法:Real-time PCR检测不同结直肠癌细胞中miR-375的表达情况。脂质体转染法将miR-375模拟物(mimics)转入HCT116细胞,用real-time PCR法检测miR-375及AEG-1 mRNA的表达情况;MTT法检测细胞活性的改变情况;流式细胞技术检测miR-375对细胞凋亡及细胞周期的影响。结果:Real-time PCR结果显示HCT116在4个结直肠癌细胞株中miR-375的表达量最低;miR-375 mimics组中miR-375表达量较对照组明显上调;miR-375高表达可以显著抑制AEG-1 mRNA的表达水平。miR-375 mimics组细胞活性明显受到抑制,同时细胞凋亡率明显增加,G1期所占细胞数增加,而S期所占细胞数减少。结论:miR-375可以抑制结肠癌HCT116细胞的活性,介导细胞周期阻滞并促进其凋亡。miR-375作为一种抑癌因子,在结肠癌中可能通过抑制AEG-1发挥抑癌作用。     

AEG1蛋白在结肠癌细胞中表达异常及其调控IL-6/STAT3通路影响结肠癌增殖和凋亡的机制研究

目的探讨星形细胞上调基因1(AEG1)在结肠癌细胞中的表达及其调控IL-6/STAT3通路影响结肠癌增殖和凋亡的潜在机制。方法 RT-qPCR检测人正常结肠黏膜上皮细胞株NCM460和结肠癌细胞株SW480、HCT116中AEG1 m RNA表达,Western blot实验检测AEG1蛋白表达。将结肠癌SW480细胞随机分为5组:对照组、SH5-07处理组、si-NC组(siRNA干扰对照组)、si-AEG1组(siRNA干扰AEG1组)和si-AEG1+IL-6组,MTT法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,Western blot检测各组细胞中IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表达。结果与NCM460细胞相比,结肠癌SW480、HCT116细胞中AEG1 mRNA和蛋白表达均升高(P0.05);与si-NC组比较,si-AEG1组结肠癌SW480细胞增殖活性降低(P0.05),细胞凋亡率升高(P0.05),细胞中IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表达水平降低(P0.05);与对照组比较,SH5-07组结肠癌SW480细胞增殖活性降低(P0.05),细胞凋亡率升高(P0.05);与si-AEG1组比较,si-AEG1+IL-6组结肠癌SW480细胞增殖活性增强(P0.05),细胞凋亡率降低(P0.05)。结论在结肠癌细胞中干扰AEG1的表达,能通过抑制IL-6/STAT3信号通路进而抑制结肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。     

角蛋白18磷酸化增加结肠癌HCT116细胞自噬并提高其对奥沙利铂的敏感性

目的研究奥沙利铂(OXA)作用下角蛋白18(K18)磷酸化与结肠癌HCT116细胞自噬和凋亡的关系并分析其可能机制。方法 HCT116细胞分别转染空载质粒、野生型K18和33、52磷酸化位点突变的K18质粒(Ser33/52A),用60μmol/L的OXA处理细胞,加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)或细胞自噬诱导剂雷帕霉素处理细胞。异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术以及钙黄绿素乙酰甲酯/碘化丙啶(calcein-AM/PI)染色法分析K18及其突变体对细胞凋亡的影响;Western blot法检测K18的磷酸化水平、自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、beclin-1的表达。结果 Ser33/52A质粒的转染可以明显降低K18的磷酸化水平,经过OXA处理后,转染K18质粒组的HCT116细胞的凋亡率显著高于空载质粒转染对照组,而Ser33/52A质粒转染的HCT116细胞的凋亡率明显低于空载体和K18质粒转染的细胞凋亡率,K18质粒转染组细胞自噬明显高于空载转染对照组,而Ser33/52A质粒转染组自噬水平明显降低。结论 K18过表达促进HCT116细胞自噬及其对OXA的敏感性,而K18 Ser33和Ser52磷酸化水平的降低则抑制自噬并降低HCT116细胞的凋亡率。     

橙皮素对结肠癌HCT116细胞凋亡、迁移与侵袭的影响及机制研究

目的观察橙皮素对结肠癌HCT116细胞凋亡、迁移与侵袭的影响,并探讨其可能的作用机制。方法采用不同浓度的橙皮素(100、200、400、600、800μM)处理结肠癌HCT116细胞和正常结肠上皮NCM460细胞,作用24、48h后,CCK-8检测细胞增殖。选取200μM和400μM橙皮素处理HCT116细胞24h后,采用Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和细胞迁移与侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9以及AKT和p-AKT的表达水平。结果橙皮素对结肠癌HCT116细胞增殖有显著抑制作用,并呈剂量和时间依赖性;而对正常结肠上皮NCM460细胞增殖抑制作用影响不大。与对照组相比,橙皮素(200μM、400μM)能明显诱导HCT116细胞发生凋亡,能够有效抑制HCT116细胞的迁移和侵袭能力。橙皮素明显下调HCT116细胞中Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平,上调Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平,同时橙皮素可以下调p-AKT水平,但对总AKT水平无明显影响。结论橙皮素抑制结肠癌HCT116细胞增殖,诱导细胞凋亡,降低迁移和侵袭能力,与抑制AKT的活化相关。     

miR-320a靶向KLF5抑制结肠癌HCT116细胞增殖和侵袭的分子机制

目的 探讨过表达miR-320a对结肠癌HCT116细胞的生物学行为的影响,并初步分析miR-320a对KLF5的调控机制.方法 将miR-320a模拟物转染结肠癌HCT116细胞,建立过表达miR-320a结肠癌HCT116细胞系,采用CCK-8方法检测转染后HCT116细胞增殖能力,Transwell实验检测转染后...     

E盒锌指结合蛋白1基因沉默抑制结肠癌HCT116细胞增殖并促进其凋亡

目的使用针对E盒锌指结合蛋白1(ZEB1)的siRNA在结肠癌HCT116细胞中下调ZEB1的表达,研究其对HCT116细胞增殖和凋亡的影响。方法根据人ZEB1的mRNA序列设计并合成2对针对ZEB1的siRNA,瞬时转染HCT116细胞后,利用实时荧光定量PCR,Western blot法分别在mRNA和蛋白水平检测siRNA对ZEB1的抑制效果;利用MTT法检测细胞增殖;AnnexinⅤ-FITC/PI染色结合流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果与对照组相比,针对ZEB1的siRNA可在mRNA和蛋白水平有效抑制ZEB1的表达,ZEB1的表达下调可有效抑制HCT116细胞的增殖,并促进细胞凋亡。结论 ZEB1对结肠癌细胞的生存和增殖具有重要作用,可能参与结肠癌的发生发展过程。     

转化生长因子β受体Ⅱ对微卫星不稳定结肠癌细胞凋亡和迁移的影响

目的 研究转化生长因子β受体Ⅱ(TGFβ RⅡ)表达对微卫星不稳定(MSI)结肠癌细胞凋亡和迁移的影响.方法 选择野生型PIK3CA HCT116细胞(HCT116 wt)作为MSI结肠癌细胞模型.将TGFβRⅡ转染HCT116 wt细胞获得HCT116 wt-RⅡ细胞,并以HCT116 wt空质粒细胞作为对照.通过生长因子缺失应激(GFDS)诱导细胞凋亡.采用Western印迹检测磷酸化Smad2(TGFβ信号通路关键因子)、磷酸化AKT (PI3K/AKT信号通路关键因子)、Bim (TGFβ信号通路下游因子)和Ecadherin(诱导上皮向间质转化的标志物)表达.采用DNA碎片ELISA分析检测HCT116 wt-RⅡ细胞凋亡情况.通过Transwell实验检测HCT116 wt-RⅡ细胞迁移活力.结果 加入TGFβ后,HCT116 wt-RⅡ细胞的TGFβ信号通路得以启动,GFDS诱导的HCT116 wt-RⅡ细胞凋亡受到显著抑制(DNA碎片值:0.69±0.02比0.41±0.04,P＜0.01);细胞迁移活力明显增强(2.10±0.15比4.03±0.48,P＜0.01).PI3K抑制剂(LY294002)可以逆转TGFβ对HCT116 wt-RⅡ细胞的凋亡抑制和迁移活力增强作用.TGFβ作用于HCT116 wt-RⅡ细胞后,Bim和E-cadherin表达明显减少.结论 TGFβRⅡ在MSI结肠癌细胞中的再表达可以增加MSI结肠癌细胞的存活能力和迁移活力,该作用依赖PI3K/AKT途径,从而为MSI结肠癌患者的良好预后提供了一个分子水平的解释.     

错配修复基因hMLH1启动子萤光素酶报告基因载体的构建与鉴定

 目的：构建含hMLH1启动子片段的萤光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素诱导下的转录活性。方法：以正常人基因组DNA为模板,PCR扩增hMLH1启动子片段（-1953/+53）,插入萤光素酶报告基因载体pGL3-Basic,将重组质粒转入HEK293细胞,检测在有和无雌激素诱导下萤光素酶的活性变化。结果：酶切和测序结果证实重组萤光素酶报告基因载体pGL3-Promoter1-luc构建成功。转染pGL3-Promoter1-luc后,雌激素诱导的萤光素酶活性为7.45±0.81,显著高于无水乙醇组的3.28±0.19 (n=3,P<0.001)。结论：hMLH1启动子片段存在与雌激素相关的调控序列。     

6-姜酮酚对结直肠癌细胞增殖、凋亡和糖酵解的影响及机制研究

目的研究6-姜酮酚对人结肠癌HCT116细胞增殖、凋亡、糖酵解的影响及其可能的作用机制。方法采用CCK8法观察6-姜酮酚对人结肠癌细胞HCT116和人正常结肠上皮细胞NCM460细胞增殖的影响,采用平板克隆形成实验观察6-姜酮酚对HCT116细胞克隆形成的影响,流式细胞术检测HCT116凋亡细胞比率,试剂盒检测HCT116细胞葡萄糖消耗和乳酸分泌的含量,Western blot检测己糖激酶2以及STAT3和p-STAT3的表达水平。结果 6-姜酮酚可以显著抑制结肠癌HCT116细胞的增殖能力,呈现剂量和时间依赖性;然而6-姜酮酚并没有引起NCM460细胞增殖的显著改变。6-姜酮酚能显著降低HCT116细胞的克隆形成能力,且可明显诱导HCT116细胞的凋亡。同时6-姜酮酚可降低HCT116细胞的葡萄糖消耗能力,并显著减少HCT116细胞乳酸分泌量。此外6-姜酮酚显著下调HCT116细胞中己糖激酶2的表达,也能下调p-STAT3水平。结论 6-姜酮酚能够有效抑制结肠癌HCT116细胞的增殖,诱导细胞凋亡,抑制糖酵解水平,其机制可能与下调STAT3信号通路及其下游己糖激酶2的表达有关。     

雌激素对结肠癌细胞株COLO205错配修复基因表达的影响

目的:研究雌激素对结肠癌细胞株COLO205错配修复基因表达的影响。方法:使用半定量RT-PCR和Westernblot,比较在不同浓度雌二醇(estradiol,E2)水平和雌激素受体拮抗剂ICI182.780处理前后结肠癌细胞株COLO205错配修复基因hMLH1和hMSH2的表达差异。并用real time RT-PCR进行验证。结果:E2能上调COLO205细胞株hMLH1基因的表达,这种上调效应发生在转录水平,在E2浓度为10-12~10-8mol/L范围内呈剂量依赖关系,且可被雌激素受体拮抗剂ICI182.780抑制;但E2对COLO205细胞的hMSH2表达没有明显影响。结论:雌激素能够增强结肠癌细胞株COLO205错配修复基因hMLH1的表达,这可能是雌激素预防结肠癌作用的一种新机制。     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Slug基因对结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默Slug基因,观察对结肠癌HCT116细胞增殖和周期的影响。方法:构建Slug基因特异性siRNA慢病毒载体,感染结肠癌HCT116细胞,设立空白对照组、阴性对照组及SlugsiRNA三组,应用Real-time PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白质水平检测各组干扰质粒对Slug基因的干扰效果,MTT法检测Slug基因在siRNA作用下的细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡周期变化情况。结果:转染Slug siRNA后,结肠癌HCT116细胞中Slug基因mRNA和蛋白表达明显受到抑制(P<0.05);MTT检测,干扰组细胞增殖水平明显低于阴性对照组;流式细胞仪检测细胞G1期细胞百分比(52.3±0.6)高于阴性对照组(45.1±0.3,P<0.05)。结论:Slug siRNA能明显下调靶基因Slug的表达,在体外可抑制结肠癌HCT116细胞的生长并促进其凋亡。     

SphK1和FAK对人结肠癌HCT116细胞上皮间质转化的影响

 目的: 研究鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase l,SphK1)和黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)对人结肠癌HCT116细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。方法: 将人结肠癌HCT116细胞分成3组:采用SphK1抑制剂N,N-二甲基鞘胺醇(N,N-dimethylsphingosine,DMS)、FAK抑制剂PF573228和相同体积的培养基分别处理细胞。MTT法检测细胞活力,Western blot方法检测SphK1、FAK、E-cadherin、N-cadherin、vimentin和基质金属蛋白酶2(MMP2)蛋白的表达,real-time PCR检测SphK1、鞘氨醇1-磷酸(S1P)、FAK、E-cadherin和vimentin mRNA的表达,并应用细胞划痕实验检测肿瘤细胞的迁移能力。结果: PF573228和DMS均明显抑制人结肠癌HCT116细胞的活力,并呈时间剂量依赖性。DMS抑制SphK1的表达,同时下调FAK、N-cadherin、vimentin和MMP2蛋白的表达,而上调E-cadherin蛋白表达上调。PF573228明显抑制FAK的表达,同时抑制SphK1、N-cadherin、vimentin和MMP2的表达,上调E-cadherin蛋白的表达(P<0.01)。划痕实验显示PF573228和DMS显著抑制HCT116细胞的迁移能力(P<0.01)。与对照组比较,PF573228组和DMS组FAK、SphK1、S1P以及vimentin mRNA的表达明显下调,而E-cadherin mRNA的表达则明显上调(P<0.05)。结论: SphK1和FAK信号通路可能在结肠癌HTC116细胞上皮间质转化过程中发挥重要作用。     

CD40配体对结肠癌细胞株的体外抑制作用

研究免疫共刺激分子CD40在结肠癌细胞株的表达及重组可溶性人CD40配体(rshCD40L)对结肠癌细胞株的体外抑制作用。采用流式细胞仪分别检测4株结肠癌细胞(HCT116、Caco-2、SW48和COLO-320)CD40分子的表达,同时利用流式细胞仪检测γ干扰素(IFN-γ)对结肠癌细胞株CD40表达的影响。MTT法检测rshCD40L对结肠癌细胞的抑制作用,TUNEL法检测rshCD40L对结肠细胞的促凋亡作用,同时检测联合rshCD40L和IFN-γ抗结肠癌作用。结果流式细胞仪检测有3株结肠癌细胞(HCT116、Caco-2和SW48)表达CD40分子,IFN-γ能增强CD40+结肠癌细胞CD40分子的表达。rshCD40L能明显抑制CD40+结肠癌细胞的增殖作用(抑制率分别为HCT116:33.5%±5.5%;Caco-2:21.5%±3.6%;SW48:30.1%±4.2%),而对CD40-结肠癌细胞株(COLO-320)无明显抑制作用(P<0.05)。rshCD40L能诱导CD40+结肠癌细胞的凋亡作用(凋亡细胞百分比为HCT116:25.6%±4.52%;Caco-2:15.71%±2.27%;SW48:18.0%±3.7%),而对CD40-结肠癌细胞株(COLO-320)无诱导凋亡作用(P<0.05)。另外,IFN-γ能明显增强rshCD40L对结肠癌细胞的抑制增殖和促凋亡作用。重组人CD40配体与IFN-γ联合可显著诱导CD40阳性的结肠癌细胞凋亡,抑制其增殖,具有潜在的抗肿瘤作用。     

转化生长因子β受体Ⅱ对微立星不稳定结肠癌细胞凋亡和迁移的影响

目的 研究转化生长因子β受体Ⅱ（TGFBRⅡ）表达对微卫星不稳定（MSI）结肠癌细胞凋亡和迁移的影响。方法 选择野生型PIK3CAHCT116细胞（HCT116wt）作为MSI结肠癌细胞模型。将TGFDRⅡ转染HCTll6wt细胞获得HCTll6wt—RⅡ细胞,并以HCT116wt空质粒细胞作为对照。通过生长因子缺失应激（GFDS）诱导细胞凋亡。采用Western印迹检测磷酸化Smad2（TGFD信号通路关键因子）、磷酸化AKT（P13K／AKT信号通路关键因子）、Bim（TGFB信号通路下游因子）和E-cadherin（诱导上皮向间质转化的标志物）表达。采用DNA碎片ELISA分析检测HCTll6wt—RⅡ细胞凋亡情况。通过Transwell实验检测HCT116wt—RⅡ细胞迁移活力。结果加入TGFB后,HCTll6wt—RlI细胞的TGFB信号通路得以启动,GFDS诱导的HCT116wt-RⅡ细胞凋亡受到显著抑制（DNA碎片值：0．69＋0．02比0．41±0．04,P〈0．01）;细胞迁移活力明显增强（2．10±0．15比4．03±0．48,P〈0．01）。P13K抑制剂（LY294002）可以逆转TGF[3对HCTll6wt—RⅡ细胞的凋亡抑制和迁移活力增强作用。TGFβ作用于HCT116wt．RⅡ细胞后,Bim和E—cadherin表达明显减少。结论TGFβRⅡ在MSI结肠癌细胞中的再表达可以增加MSI结肠癌细胞的存活能力和迁移活力,该作用依赖P13K／AKT途径,从而为MSI结肠癌患者的良好预后提供了一个分子水平的解释。     

miR-496过表达抑制结肠癌细胞生长和转移

目的:研究miR-496过表达对结肠癌细胞生长和转移的影响及其分子机制。方法:运用生物信息学软件筛选miR-496靶向相互作用蛋白;real-time PCR和Western blot法测定结肠癌细胞系HT29、HCT116、SW480以及正常结肠上皮细胞NCM460中miR-496、CTNNB1 mRNA和β-catenin蛋白的表达;运用Lipofectamine 2000将miR-496 mimics转染HT29、HCT116和SW480细胞,分别命名为HT29-miR-496 mimics、HCT116-miR-496 mimics和SW480-miR-496 mimics细胞,转染scramble为阴性对照;运用MTT法、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒法、克隆形成实验和Transwell分别测定细胞活力、LDH漏出率、克隆形成能力和转移能力;萤光素酶报告基因实验测定miR-496启动子活性;Western blot法测定β-catenin、真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)、p-4E-BP1、低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)、p-LRP6、MMP-7、MMP-9、MMP-13以及TIMP-2的蛋白水平。结果:miR-496与β-catenin内源性相互作用;miR-496在HT29、HCT116和SW480细胞中低表达,而在NCM460高表达;β-catenin在HT29、HCT116和SW480细胞中高表达,而在NCM460低表达;培养24 h、48 h、72 h、96 h的HT29-miR-496 mimics、HCT116-miR-496 mimics和SW480-miR-496 mimics细胞活力、LDH漏出率、克隆形成率和转移的细胞数均显著低于对照组(P0.05);萤光素酶报告基因实验结果显示转染miR-496 mimics细胞中的miR-496启动子活性明显增加(P0.05),分别是对照组的1.75倍、2.04倍和1.61倍。Western blot实验结果显示miR-496过表达抑制β-catenin蛋白表达,p-4E-BP1和p-LRP6的蛋白水平降低;siRNA或miR-496过表达介导的β-catenin表达下调能显著抑制MMP-7和MMP-9的表达,促进TIMP-2的表达。结论:miR-496在结肠癌细胞中低表达,在正常结肠上皮细胞中高表达;miR-496过表达抑制结肠癌细胞的生长和转移,其机制是通过抑制Wnt/β-catenin通路进一步抑制MMP-7和MMP-9表达,促进TIMP-2表达,从而抑制结肠癌细胞的恶性表型。     

曲古抑菌素A对结肠癌细胞HCT116的作用及机制

目的通过组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDACs)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对人结肠癌细胞HCT116增殖与凋亡作用的研究,探讨TSA对结肠癌的作用机制。方法:应用四氮唑蓝(MTT)法、Hoechst染色法、Western blot法和光学显微镜观察经不同浓度TSA处理后的HCT116增殖、凋亡与相关蛋白的改变。结果:TSA可时间依赖性地抑制HCT116细胞生长,促进凋亡,但浓度依赖性不明显。与对照组相比,TSA作用时,脆性组氨酸三联体(FHIT)和Bax蛋白的表达均出现一定程度增加,而骨桥蛋白(OPN)的表达出现一定程度的降低,AKT蛋白表达变化不明显。结论:TSA可抑制结肠癌细胞HCT116增殖,促进其凋亡,其机制可能与上调FHIT和Bax的表达,下调OPN表达有关。     

Differences in the spectrum of spontaneous mutations in the hprt gene between tumor cells of the microsatellite mutator phenotype

We have determined the frequency and spectrum of spontaneous mutations at the hprt locus in LovO, HCT116, LS180 and DLD-1 colon carcinoma cell lines exhibiting microsatellite genetic instability. Each cell line has a different mutator gene. LoVo and HCT116 cells have mutated hMSH2 and hMLH1 genes, respectively, which account for the majority of hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC). LS180 cells are wild type for these genes and also for hPMS1 and hPMS2 mismatch repair genes. DLD-1 cells harbor a mutated GTBP mismatch binding factor and a mutated DNA Polymerase δ. The mutation rate at the hprt locus was several hundred fold higher in these cell lines relative to control cell lines without microsatellite instability. The mutations were frameshifts (deletions and insertions of a single nucleotide in short repeats) and single base substitutions (transversions and transitions). Some mutations were shared by these fouor cell lines. However, every cell line also exhibited a distinctive spectrum of mutations suggesting that each mutator gene induces a particular mutator phenotype. These results also suggest that the frequency and spectrum of somatic mutations in tumor cells of the microsatellite mutator phenotype may have diagnostic applications to discriminate among the diverse underlying mutator genes.