AIF靶向短发夹RNA干扰重组载体对神经母细胞瘤细胞SHSY5Y的沉默作用

目的探讨AIF基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对神经母细胞瘤细胞(SHSY5YAIF)基因的干扰作用。方法根据siRNA设计原则,构建靶向AIF基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/AIF),使用脂质体法转染人神经母细胞瘤细胞,通过RT-PCR和Wester blot印迹检测神经母细胞瘤细胞AIF基因mRNA和蛋白表达水平。结果 pGPU6/GFP/AIF重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确。质粒成功转染SHSY5Y细胞后,该细胞的AIFmRNA和蛋白表达明显下降(P0.05)。结论成功构建靶向AIF基因的shRNA表达载体转染神经母细胞瘤细胞,有效抑制AIFmRNA和蛋白表达,为AIF基因靶向治疗提供前期的实验依据。     

shRNA下调Paxillin表达对SMMC-7721肝癌细胞增殖、侵袭的影响

目的采用RNA干扰技术转染shRNA下调SMMC-7721肝癌细胞中Paxillin的表达,探讨Paxillin下调对SMMC-7721细胞迁移、侵袭力的影响。方法采用Paxillin shRNA转染肝癌细胞株SMMC-7721,分别设未处理SMMC-7721肝癌细胞组(未处理组)、shRNA Paxillin阴性组(对照组)和shRNA Paxillin组(实验组)。以GAPDH为内参,采用qRT-PCR、Western blot、ELISA法分别检测各组SMMC-7721细胞中Paxillin与FAK的表达;筛选出稳定转染Paxillin shRNA的肝癌细胞株,采用MTT、Transwell侵袭小室法分别检测各组细胞的增殖情况和侵袭力差异。结果 qRT-PCR和ELISA结果均显示Paxillin表达明显下调(P0.05),FAK表达各组间差异无显著性(P0.05);Western blot法检测结果显示实验组Paxillin的相对表达量明显低于未处理组和对照组;成功构建Paxillin稳定表达的SMMC-7721肝癌细胞株;MTT细胞增殖与Transwell细胞侵袭力检测显示Paxillin下调肝癌细胞的增殖、侵袭能力明显低于未处理组和对照组(P0.05)。结论 shRNA干扰技术可以下调Paxillin的表达;Paxillin表达下调抑制SMMC-7721肝癌细胞的增殖、侵袭能力;Paxillin有望成为肝癌复发、转移预测和基因治疗的新靶点。     

iASPP对表达野生型p53基因的乳腺癌细胞株MCF-7凋亡的影响

目的： P53凋亡刺激蛋白（ASPP）家族成员能够调节P53诱导的细胞凋亡。其中ASPP家族抑制成员(iASPP)主要通过特异性地和P53蛋白结合抑制肿瘤细胞的凋亡,本实验通过构建iASPP的RNAi质粒,研究在体内外抑制iASPP基因后对表达野生型p53基因的乳腺癌细胞MCF-7凋亡的影响。方法: 采用分子生物学方法构建iASPP的腺病毒RNAi质粒pAd-iASPP-RNAi;体外转染MCF-7细胞,同时建立MCF-7细胞的裸鼠移植瘤模型;分别采用RT-PCR和Western blotting检测转染后瘤细胞iASPP mRNA和蛋白质表达的变化;采用流式细胞术检测转染前后瘤细胞凋亡的变化。结果: 转染iASPP RNAi后,MCF-7细胞的iASPP mRNA及蛋白表达量降低（抑制率分别为95.4%和96.8%,P<0.01）;MCF-7细胞的凋亡百分率、坏死百分率与对照组相比具有显著差异（P<0.01）。裸鼠移植瘤模型经pAd-iASPP-RNAi处理后,iASPP mRNA及蛋白表达量也明显降低（抑制率分别为87.4%和89.2%,P<0.01）;移植瘤细胞的凋亡百分率和坏死百分率显著上升（P<0.01和P<0.05）。结论: 在体内外抑制iASPP基因的表达能够通过p53途径诱导表达野生型p53的乳腺癌细胞凋亡。     

RhoA基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的:构建针对RhoA基因的,hRNA表达载体并进行鉴定.方法:针对人RhoA的mRNA序列,设计并合成编码的shRNA的两条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至pGPU6/GFP/Neo质粒,构建重组体pGPU6/GFP/NeoRhoA,进行酶切及测序鉴定,然后脂质体转染LoVo细胞.荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体,酶切及测序证实质粒为所需的序列.结论:成功地构建了针对RhoA基因的shRNA表达载体,为下一步进行RNAi的相关研究奠定了基础.     

小干扰RNA靶向血管内皮生长因子基因抑制胆囊癌细胞的增殖体内外实验

背景:已有研究发现RNA干扰可通过抑制血管内皮生长因子基因表达抑制肿瘤细胞增殖,但目前关于应用RNA干扰胆囊癌血管内皮生长表达的研究国内外尚无相关报道。目的:构建并筛选靶向血管内皮生长因子的shRNA,观察RNA干扰血管内皮生长因子的效果及对胆囊癌细胞增殖的影响。方法:设计VEGF-shRNA片段,连接到pCYU6/GFP/Neo-shRNA质粒载体上。shRNA转染胆囊癌细胞。建立裸鼠胆囊癌模型,随机分成空白组、阴性对照组、实验组(干扰pShRNA-VEGF2),每组6只。瘤内注射shRNA。荧光显微镜观察细胞生长状态,半定量反转录-聚合酶链反应法与实时荧光定量聚合酶链反应检测RNA干扰效果,观察胆囊癌裸鼠模型肿瘤体积变化。结果与结论:RNA干扰血管内皮生长因子后,胆囊癌细胞细胞变圆,皱缩,部分细胞死亡脱落。shRNA片段血管内皮生长因子2、血管内皮生长因子1均可抑制VEGF mRNA表达,抑制率可达86%,82%。裸鼠肿瘤模型中实验组肿瘤与对照组、阴性组相比明显变小,且生长缓慢(P0.05),而对照组和阴性组在肿瘤大小及生长趋势上没有明显的差别。实验构建的hVEGF-shRNA质粒表达载体通过抑制血管内皮生长因子的表达,抑制胆囊癌细胞增殖,从而达到间接治疗肿瘤的目的。     

RNAi沉默Beclin 1基因对维生素K3损伤人肝癌细胞SMMC-7721的影响

目的： 探讨应用RNAi技术沉默Beclin 1基因对维生素 (vitamin K3,Vit K3)引起的人肝癌SMMC-7721细胞损伤的影响。方法: 应用真核细胞转染技术将Psilencer 3.1-siRNA-Beclin 1重组质粒转入人肝癌SMMC-7721细胞,同时分别设立转染空质粒阴性对照组和转染试剂阴性对照。于48 h后收集细胞,分别提取细胞总RNA及总蛋白,通过RT-PCR和Western blotting检测Beclin 1基因表达。应用40 μmol/L Vit K3作用Beclin 1-siRNA细胞株,Hoechst 33342染色检测细胞凋亡率。结果: 与对照组相比,siRNA重组质粒明显降低Beclin 1 mRNA水平,抑制其蛋白表达。40 μmol/L Vit K3作用人肝癌SMMC-7721细胞Beclin 1 mRNA表达明显高于对照组,细胞凋亡率增加(P<0.01）;而Beclin 1-siRNA细胞株,Beclin 1 mRNA表达显著低于对照组,与40 μmol/L Vit K3作用组相比细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。结论: Psilencer 3.1-siRNA-Beclin 1转染人肝癌SMMC-7721细胞后,可有效抑制Beclin-1 mRNA和蛋白的表达,抑制Vit K3引起的Beclin 1依赖性细胞自噬信号通路的激活,促进细胞凋亡。     

人UbcH10及其siRNA真核表达载体的构建与表达

目的：构建以人泛素结合酶UbcH10基因为基础的真核表达质粒pcDNA3.1（UbcH10）及其siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo（siRNA-UbcH10）,并在结肠癌细胞LOVO中表达与鉴定。方法：提取组织总RNA,通过RT-PCR扩增出UbcH10基因,克隆到真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点中,构建UbcH10的真核表达载体。通过siRNA设计软件选取UbcH10基因的siRNA片段合成构建表达载体pGPU6/GFP/Neo（siRNA-UbcH10）。然后采用脂质体转染法将其分别转染LOVO细胞,用RT-PCR在RNA水平和Western Blot在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。结果：测序结果显示克隆UbcH10基因片段序列完全正确;重组质粒转染LO-VO细胞后,检测到pcDNA3.1（UbcH10）转染组UbcH10表达增强,而pGPU6/GFP/Neo（siRNA-UbcH10）转染组UbcH10表达减弱。结论：成功构建真核表达质粒pcDNA3.1（UbcH10）及其siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo（siRNA-UbcH10）,并在真核细胞中能有效表达,为今后进一步研究UbcH10的功能和作用机制奠定了基础。     

RNAi沉默HIF-1α基因抑制滋养细胞TGF-3β表达的实验研究

目的构建缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α）基因的短发夹状干扰RNA（short hair-pin RNA,shRNA）表达质粒,探讨其在低氧条件下对BeWo细胞转化生长因子3β（transforming growth factor3β,TGF-3β）基因表达的抑制作用。方法根据小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）设计原则,针对HIF-1α基因设计并合成两条寡聚DNA片段,退火后克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒,应用脂质体将重组质粒转染BeWo细胞。缺氧培养后,应用Western blot法检测滋养细胞HIF-1α和TGF-3β蛋白表达水平,应用real time PCR法检测滋养细胞HIF-1α和TGF-3βmRNA表达水平。结果成功构建HIF-1α的shRNA真核表达载体,转染BeWo细胞。低氧条件下,细胞HIF-1α蛋白和mRNA表达下降;同时细胞TGF-3β蛋白和mRNA表达也降低。结论构建的HIF-1α基因shRNA表达质粒在低氧条件下明显抑制滋养细胞TGF-3β基因的表达。     

DNMT1 siRNA 稳定表达载体的构建及其沉默效率的评价

目的构建能在肝癌细胞系SMMC-7721中稳定表达的高效率DNMT1的RNA干扰载体。方法合成特异性干扰DNMT1的小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)分子，并与pSUPER—GFP载体连接。脂质体转染SMMC-7721细胞，并以G418筛选稳定表达细胞系。应用逆转录-聚合酶链反应和Western印迹方法对细胞系中DNMT1的RNA表达水平和蛋白表达水平进行了分析。应用甲基化聚合酶链反应方法分析该细胞系中甲基化的基因E-钙粘着蛋白的甲基化状态。结果转染DNMT1沉默载体的SMMC-7721细胞中DNMT1的mRNA表达量为对照载体pSUPER转染SMMC-7721细胞的43％，而前者中DNMT1蛋白表达水平小于后者的10％。DNMT1的siRNA沉默效率大于90％，所构建的DNMT1的siRNA有较高的沉默效率。DNMT1的表达抑制使E-钙粘着蛋白基因启动子区出现去甲基化。结论成功构建了能稳定表达的高效率DNMT1的RNA干扰载体，但目的基因沉默后其RNA表达水平与蛋白质表达水平表现不一致，评价siRNA干扰作用时应以目的基因相应蛋白质的表达水平为准。     

病毒介导的P53低表达HepG2细胞株的建立

目的构建干扰P53的逆转录病毒载体,建立稳定低表达P53的HepG2细胞株。方法合成干扰P53基因的寡核苷酸序列插入pMSCV-hyg-U6质粒,转化受体菌DH5α,经酶切测序鉴定后瞬时转染HepG2细胞,通过半定量RT-PCR方法检测P53 mRNA表达水平评估干扰效果;选择干扰效果最好的重组质粒转染PT67细胞进行病毒包装,获得逆转录病毒颗粒感染HepG2细胞,通过Hygromycin筛选获得多个细胞克隆,Western blot检测P53蛋白的表达情况;选择P53表达水平最低的细胞克隆。通过5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导凋亡实验,检测P53低表达的HepG2细胞p53通路介导的细胞凋亡情况。结果经酶切和测序验证成功构建重组病毒载体;瞬时转染HepG2细胞后P53 mRNA表达下调;病毒颗粒感染HepG2细胞后P53的mRNA、蛋白表达下调;用5-FU处理后P53低表达HepG2细胞凋亡水平明显低于对照。结论成功构建了干扰P53的逆转录病毒载体,建立了P53低表达HepG2细胞株,明显阻断了P53通路依赖的细胞凋亡。     

miR-15a-5p抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖与迁移

目的:观察高表达的miR-15a-5p对人肝细胞癌SMMC-7721细胞增殖和迁移能力的影响。方法:化学合成加入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的miR-15a-5p寡聚核苷酸,并进行测序确认;利用pcDNA6.2-GW/EmGFP质粒构建miR-15a-5p真核表达载体,瞬时转染SMMC-7721细胞,实时荧光定量PCR检测miR-15a-5p的表达;CCK-8法和台盼蓝染色活细胞计数检测SMMC-7721细胞的增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力的变化。结果:设计的miR-15a-5p序列与寡核苷酸测序结果匹配达100%;真核表达质粒瞬转后人肝癌SMMC-7721细胞miR-15a-5p的表达量与对照组相比显著增加(P0.05);miR-15a-5p高表达SMMC-7721细胞的增殖能力与对照组相比均显著下降(P0.05);miR-15a-5p高表达组细胞迁移速度低于对照组。结论:高表达的miR-15a-5p可抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖和迁移能力。     

脱落酸抑制人肝癌细胞增殖

目的探讨脱落酸抑制SMMC-7721人肝癌细胞增殖作用的机制。方法免疫细胞化学检测P53、Ki-67、Cyclin D1蛋白表达;RT-PCR检测P53和端粒酶mRNA表达。结果经脱落酸(ABA)、环六亚甲基二乙酰胺(HMBA)和ABA HMBA作用后细胞内mtP53、Cyclin D1、Ki-67及细胞内mt P53、hTERT mRNA表达水平均明显降低(P<0.05)。结论ABA抑制SMMC-7721人肝癌细胞增殖,其作用机制可能是调控细胞周期,降低mtP53、Ki-67、Cyclin D1蛋白及mtP53,hTERT mRNA表达。     

细脚拟青霉多糖体外抗肿瘤作用及其机制的实验研究

目的：通过观察细脚拟青霉多糖的体外抗肿瘤活性，初步探讨其作用机制。方法:采用水提，乙醇沉淀，DEAE-纤维素和Sephadex G-100柱层析分离纯化多糖PTPS-I；以PTPS-I 和经PTPS-I刺激培养的人外周血单个核细胞(MNC)的条件培养基(PTPS-I-MNC-CM)作用于体外培养的红白血病细胞K562、喉癌细胞Hep2和肝癌细胞SMMC-7721，观察PTPS-I 和PTPS-I-MNC-CM对其增殖活性的影响；用cell counting kit-8 (CCK-8)检测MNC 的增殖活性；以荧光定量PCR检测MNC 中TNF-α和IL-6 mRNA的表达。结果:PTPS-I-MNC-CM能抑制K562，Hep2和SMMC-7721细胞的增殖(均为P＜0.01)；PTPS-I不能抑制肿瘤细胞的增殖(P＞0.05)，没有显现直接的细胞毒作用。PTPS-I能促进MNC的增殖(P＜0.01)和增强TNF-α 和 IL-6 mRNA的表达(P＜0.05，P＜0.01)。结论:PTPS-I具有免疫调节活性，通过免疫调节发挥抗肿瘤作用。     

肝细胞癌新型靶向基因治疗体系的构建及应用研究

构建肝细胞癌(HCC)新型靶向基因治疗体系,并以存活素(survivin)基因为靶点,探讨该体系体外杀伤肝癌细胞的作用。构建由巨细胞病毒(CMV)增强子和甲胎蛋白(AFP)启动子构成的融合启动子(AV)驱动的pcD-NA3.1(-)AV质粒,及含绿色荧光蛋白(GFP)的pcDNA3.1(-)AVGFP和含siRNA-survivin的pcDNA3.1(-)AV-siRNA-survivin质粒,以磷酸钙纳米为载体,导入HepG2、SMMC-7721和Hela细胞中,观察转染效率及体外对肝癌细胞的杀伤效应,并采用流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡率。结果显示:AV启动子可特异性驱动下游基因在HepG2细胞表达。此外,pcDNA3.1(-)AVsiRNA-survivin在HepG2细胞中可有效沉默survivin的mRNA和蛋白表达,并诱导68.8%的细胞死亡,而在Hela和SMMC-7721细胞中无显著作用。生长曲线结果显示,转染了pcD-NA3.1(-)AVsiRNA-survivin的HepG2细胞的生长显著受抑(P<0.05)。结果表明,该新型靶向基因治疗体系可高选择性作用于肝癌细胞,可为临床肝癌的基因治疗提供新的研究思路。     

Notch3诱导人小细胞肺癌H446细胞G_0/G_1期阻滞及其机制

目的探究Notch3对人小细胞肺癌H446细胞增殖和细胞周期的影响及其分子机制。方法将人Notch3真核表达质粒、人HES1真核表达质粒、人鼠双微基因2(MDM2)基因沉默表达质粒及其空质粒分别转染H446细胞,采用流式细胞术检测细胞周期,采用RT-PCR法检测Notch3和MDM2的mRNA水平,采用Western blotting方法检测Notch3、HES1、MDM2、Rb和P21蛋白表达水平。结果 Notch3可抑制H446细胞增殖并导致G_0/G_1期阻滞(P0.05),上调HES1蛋白表达水平和下调MDM2蛋白表达水平(P0.05);HES1高表达也能使MDM2蛋白表达水平下降(P0.05),但对其mRNA水平无影响;沉默MDM2基因可抑制H446细胞增殖(P0.05),并使H446细胞中Rb和P21蛋白表达水平升高(P0.05)。结论 Notch3可通过HES1抑制MDM2蛋白表达,进而上调Rb和P21蛋白表达水平,抑制H446细胞增殖并阻滞H446细胞于G_0/G_1期。     

再生障碍性贫血患者骨髓单个核细胞端粒长度及P53、P21的表达

目的:研究再生障碍性贫血(AA)患者骨髓单个核细胞(BMMNC)的端粒长度以及P53和P21表达水平,探讨它们与AA发病的关系。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测60例AA患者[其中非重型再障(NSAA)38例,重型再障(SAA)22例]和25例对照者BMMNC中端粒长度以及P53和P21的mRNA表达情况;采用Western blot法检测P53和P21蛋白表达情况;并进行相关性比较。骨髓活检术检测骨髓造血细胞成分分布情况;流式细胞术检测CD34~+细胞占有核细胞百分比情况。结果:AA患者端粒长度较对照组明显缩短骨髓造血细胞成分及CD34~+细胞占有核细胞百分比较对照组明显减少(P0.05);NSAA、SAA患者与对照组相比端粒长度均明显缩短,骨髓造血细胞成分及CD34~+细胞占有核细胞百分比均明显减少(P0.05);SAA与NSAA比较,端粒长度明显缩短,骨髓造血细胞成分及CD34~+细胞占有核细胞百分比明显减少(P0.05)。AA患者P53和P21的mRNA及蛋白表达水平均较对照组明显升高(P0.05);NSAA和SAA患者P53和P21的mRNA及蛋白表达水平与对照组相比均明显升高(P0.05);SAA患者P53和P21的mRNA及蛋白表达水平较NSAA明显升高(P0.05)。端粒长度与P53表达水平或P21表达水平之间没有相关性(P0.05);P53表达水平与P21表达水平之间呈正相关(P0.05)。结论:端粒长度的改变以及P53和P21可能参与了再障的发病经过,推测可能是通过抑制造血干细胞的增殖和分化,从而引发造血细胞凋亡。     

蜂毒肽诱导人肝癌细胞系SMMC-7721程序性坏死

目的 探讨蜂毒肽(MLT)对人肝癌细胞系SMMC-7721的杀伤作用及可能机制.方法 采用MTT法检测不同浓度蜂毒肽对人肝癌细胞系SMMC-7721的杀伤及程序性坏死特异性抑制剂-1(Nec-1)对蜂毒肽杀伤SMMC-7721细胞的抑制作用.Hoechst 33342及PI双染色观察细胞程序性坏死的发生,流式细胞术检测...     

MAGE-1基因疫苗的构建及其免疫学活性的研究

目的：制备MAGE-1基因疫苗，观察该疫苗诱导小鼠脾脏的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞C几活性及产生特异性抗体的影响。方法：应用基因重组技术，构建基因疫苗pcMAGE-1；转染HEK293细胞；RT-PCR及Western blot检测MAGE-1 mRNA及蛋白的表达；pcMAGE-1免疫3次BALB／c小鼠，末次免疫后7日收集血清及脾细胞。流式细胞术检测血清中抗MAGE-1多抗的产生，MTT法检测小鼠CIL杀伤活性。结果：构建的pcMAGE-1转染瑚：K293细胞，RT-PCR表明在MRNA水平有MAGE-1的表达；western blot显示表达产物46kD，与预期一致。基因疫苗免疫组小鼠血清MAGE-1抗体的产生增加，与SMMG7721结合率显著高于对照组（P〈0．05）。杀伤实验结果显示，免疫组小鼠脾细胞对SMMC-7721的杀伤率明显高于两个对照组（P〈0．05）。结论：成功地构建了MAGE-1基因疫苗，该疫苗能够有效地诱导特异性免疫应答。     

miR-141表达异常对人肝癌细胞恶性生物学表型的影响

 目的: 研究微小RNA-141(miR-141)在人肝癌细胞和正常胎肝细胞中的表达,同时分析miR-141表达异常对人肝癌细胞恶性生物学表型的影响。方法: 分别提取人肝癌细胞SMMC-7721和正常肝细胞HL-7702的总RNA,采用实时荧光定量PCR法检测miR-141的表达。采用脂质体介导的转染方法分别将miR-141 mimic转染SMMC-7721细胞,将miR-141 inhibitor转染HL-7702细胞;MTS试剂盒和BrdU-ELISA检测细胞增殖能力,流式细胞术检测转染前后细胞周期和凋亡率的变化。Transwell实验检测miR-141表达变化对细胞体外迁移能力的影响。结果: miR-141在SMMC-7721细胞中的表达较HL-7702细胞明显下降。与空白组、脂质体组和阴性对照组相比,转染25 nmol/L miR-141 mimic的SMMC-7721细胞中,细胞增殖速度减慢,S期细胞比例降低,凋亡细胞比例上升,细胞体外迁移能力下降;转染50 nmol/L miR-141 inhibitor的HL-7702细胞中,细胞增殖速度加快,S期细胞比例上升,凋亡细胞比例下降,细胞体外迁移能力增强。结论: miR-141在人肝癌细胞中表达下降,上调miR-141表达可抑制肝癌细胞体外增殖活性和迁移能力,影响细胞周期和凋亡。在肝癌发病进程中,miR-141可能扮演抑癌基因的角色。