典型遗传性非息肉病性结直肠癌家系临床病理及分子遗传学分析

目的 了解国人遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）的临床病理及分子遗传学特征。方法 用微解剖、微卫星不稳定性分析、免疫组织化学及直接DNA测序方法,检测4例HNPCC患者的肿瘤组织微卫星不稳定性状态、错配修复基因hMSH2及hMLH1蛋白水平的表达变化以及生殖细胞突变。结果 4例先证者5个肿瘤组织均表现为高度微卫星不稳定性,3例表现为hMSH2蛋白表达异常,1例表现为hMLH1蛋白表达异常。检测出3个生殖细胞病理性突变。结论 中国人典型HNPCC病例中错配修复基因突变率较高。高度微卫星不稳定性、错配修复基因hMSH2及hMLH1蛋白表达异常与错配修复基因生殖细胞突变密切相关。微卫星不稳定性和错配修复基因蛋白分析可作为DNA测序前的筛选手段。     

雄激素受体基因慢病毒干扰载体的构建及在肝癌细胞中的表达

目的：构建敲减人雄激素受体（AR）基因的慢病毒质粒,转染Hep3B细胞使其表达目的蛋白并探索其对PTEN、p-AKT蛋白表达的影响。方法：设计合成3对针对AR基因特异性敲减的寡核苷酸片段,分别连接于重组慢病毒载体pLKO.1,构建3条AR干扰载体。利用验证正确的3个慢病毒载体转染293T细胞得到慢病毒上清液。采用RT-PCR和Western blot在5株肝癌细胞中挑选AR高表达的细胞系进行AR慢病毒上清液感染。RT-PCR和Western blot检测3条AR干扰质粒在Hep3B细胞内的表达及其对PTEN、p-AKT蛋白表达的作用。结果：测序鉴定证实3条AR慢病毒干扰载体构建成功,干扰Hep3B细胞后,RT-PCR和Western blot结果显示其中1条AR干扰后的mRNA和蛋白表达明显降低,细胞内PTEN蛋白表达升高,p-AKT表达降低。结论：成功构建3条AR干扰载体,其中1条干扰效率较高,能在Hep3B细胞中干扰AR的表达,感染细胞后上调抑癌基因PTEN的蛋白表达对p-AKT有抑制作用,提示AR和PTEN/AKT信号通路可能具有相关性。     

沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖及凋亡的影响

背景：研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长,但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究。由于siRNA介导的基因沉默是瞬时表达,持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应,利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉默MKRN1基因的细胞系有着可逆的优势,且可规避上述缺点,对于深入研究MKRN1的生物学功能有重要的意义。目的：构建Tet-on慢病毒系统介导的MKRN1基因沉默载体,研究沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖、凋亡的影响。方法：采用RNAi技术,针对MKRN1基因设计3条shRNA(命名为sh1,sh2,sh3),将3条shRNA序列连入四环素诱导表达载体pTripz中验证连入序列;通过三质粒系统转染HEK-293T细胞,并用含有1 mg/L强力霉素的完全培养基培养,进行慢病毒包装,收取48 h及72 h病毒液,将其浓缩后感染HEK-293T细胞,感染48 h后用荧光显微镜观察病毒感染效率。通过实时荧光定量PCR、Western blot检测MKRN1的敲减效率;Western blot检测四环素诱导表达系统是否构建成功;通过...     

RNA靶向的CRISPR/CasRx系统在小鼠精原细胞系GC1-spg中的应用

目的探究CRISPR/CasRx介导的RNA水平的基因敲降在小鼠精原细胞系GC1-spg的应用。方法利用同源重组的方法构建EF1a core promoter.CasRx.SV40.U6.DRs表达质粒(CasRx-gRNA)和EF1a.EGFP、EF1a.mCherry、EF1a.tdToamto 3种荧光蛋白表达质粒。在人胚肾细胞系HEK-293T内瞬时转染3种荧光蛋白表达质粒和CasRx-gRNA表达质粒,通过荧光强度、Western blot检测外源基因(荧光蛋白、EGFP和mCherry)的敲降情况。在HEK-293T细胞内转染CasRx-gRNA,通过q-PCR检测内源基因mRNA和lncRNA干扰后的表达水平。在小鼠精原细胞系GC1内瞬时转染外源基因egfp、mCherry和CasRx-gRNA表达质粒并通过以上方法检测外源基因(荧光蛋白)沉默效率。结果成功构建了CasRx-gRNA和3种荧光蛋白表达质粒。在HEK-293T细胞内CRISPR/CasRx介导的RNA干扰外源基因(egfp、mCherry)和内源基因(mRNA、lncRNA)后,表达水平均显著下调(P0.01)。在小鼠精原细胞系GC1内验证CRISPR/CasRx系统,可有效和特异敲降外源基因egfp、mCherry。结论 CRISPR/CasRx系统能够在GC1-spg细胞中发挥有效和特异的敲降作用,为雄性生殖发育的研究提供新的基因沉默工具。     

Polo样激酶1(PLK1)的敲低及其对宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用

目的研究敲低Polo样激酶1(PLK1)后对宫颈癌HeLa细胞生长的作用。方法流式细胞术评测LAH4-L1载体对小干扰绿色荧光蛋白基因(siGFP)的递送效率;反转录PCR检测PLK1 mRNA水平,Western blot法检测PLK1蛋白水平;敲低PLK1水平后,采用CCK-8法检测HeLa细胞活性和生长抑制情况。结果 LAH4-L1-siPLK1纳米复合物可下调HeLa细胞PLK1约70%,并降低PLK1蛋白的表达,敲低PLK1后,可明显抑制HeLa细胞增殖。另外,LAH4-L1载体的基因递送效率能够稳定维持在较高水平。结论敲低HeLa细胞PLK1抑制癌细胞生长,LAH4-L1是一个较好的基因递送载体。     

微卫星不稳定结直肠癌中COX-2、hMLH1、hMSH2的表达

目的观察微卫星不稳定(MSI)结直肠癌中的环氧化酶-2(COX-2)、hMLH1和hMSH2的表达。方法采用PCR法检测42例手术切除结直肠癌和癌旁组织中MSI存在情况,并采用Western blot法分别检测癌旁正常组织、MSI及微卫星稳定(MSS)结直肠癌标本COX-2、hMLH1、hMSH2的表达。结果42例结直肠癌组织中MSI18例,MSS24例。在18例MSI阳性的结直肠癌组织中COX-2和hMLH1低表达率分别为61·11%(11/18)、77·78%(14/18),明显高于MSS组(P<0·05)。结论hM-LH1表达降低可能与MSI发生有关。COX-2、hMLH1在MSI和MSS结直肠癌发生途径中起不同的作用。MSI可以作为结直肠癌分类的参考指标。     

转录因子PAX5对多发性骨髓瘤细胞IM9的抗凋亡及促增生作用

目的：应用DNA介导的RNA干扰技术使核转录因子PAX5基因沉默,观察PAX5对下游基因调节以及细胞增殖和抗凋亡的影响。方法：筛选高表达PAX5的肿瘤细胞株。构建针对PAX5的siRNA表达载体并转染入多发性骨髓瘤细胞IM9,筛选稳转细胞系。RT-PCR分析PAX5敲低细胞中p53、XBP-1和c-Myc等重要基因表达水平的影响,同时用MTT和流式分析分别检测细胞增殖和细胞凋亡率。结果：PAX5在多发性骨髓瘤细胞株IM9中特异性表达,而KAS6和前列腺癌细胞DU145和PC3中没有表达。利用RNA干扰技术敲低IM9细胞中PAX5,不仅可使p53、XBP-1的表达增加,同时观察到c-Myc的表达下降。MTT实验证实PAX5基因沉默的IM9细胞增殖速率明显低于对照组细胞,同时对5-FU的药物敏感性增加。结论：PAX5在多发性骨髓瘤细胞株IM9中特异性的表达,并可促进肿瘤的生长和抗药性。本研究中进一步发现,PAX5除可调节p53和XBP-1基因的表达,c-Myc的表达也随PAX5敲低而下降,提示PAX5有可能直接参与c-Myc的转录调节并在肿瘤发生中起到作用。     

结直肠癌细胞中脾酪氨酸激酶基因甲基化状态和表达的关系

目的：探讨结直肠癌细胞中脾酪氨酸激酶基因甲基化和表达的关系。方法：应用亚硫酸盐修饰测序、甲基化特异性聚合酶链反应和蛋白印迹技术检测结直肠癌细胞脾酪氨酸激酶的甲基化状态以及表达情况；荧光素酶报告分析法研究启动子区域CpG岛的甲基化与启动子活性的关系；甲基化转移酶抑制剂处理脾酪氨酸激酶甲基化失表达的结直肠癌细胞株，观察处理前后细胞内脾酪氨酸激酶基因甲基化状态和表达情况。结果：（1）23个结直肠癌细胞中，9个细胞启动子发生甲基化而失去蛋白质表达；其余则正常表达，甲基化发生率为39.2％；（2）9个甲基化的细胞中，7个存在微卫星不稳定；而14个未发生甲基化的细胞中，仅有4个存在微卫星不稳定。二者之间的差异显著（P<0.05）；（3）脾酪氨酸激酶启动子全长和未甲基化启动子荧光素酶的活性分别是甲基化组的4.5和4.7倍；5-Aza-CdR可恢复甲基化启动子的活性；（4）5-Aza-CdR可去甲基化而使脾酪氨酸激酶基因重新表达，而且具有时间依从性。结论：结直肠癌细胞中，启动子区域的甲基化导致Syk基因丧失表达，5-Aza-CdR可以去甲基化而恢复脾酪氨酸激酶基因的表达。     

126例子宫内膜癌中Lynch综合征的初步筛查

目的探讨hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2蛋白缺失情况和hMLH1基因启动子甲基化状态及Lynch综合征患者的家系分析,初步进行Lynch综合征相关子宫内膜癌筛查。方法采用免疫组化SP法检测126例子宫内膜癌中hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2蛋白表达,并用甲基化特异性PCR检测hMLH1蛋白表达缺失病例的hMLH1基因启动子甲基化状态。结果免疫组化结果显示22%(28/126)的病例出现MMR蛋白缺失表达,其中12例hMLH1~-/hPMS2~-、6例hPMS2~-、4例hMSH2~-/hMSH6~-,hMSH6~-和hMLH1~-各3例,以hMLH1和hPMS2蛋白缺失表达为主。甲基化特异性PCR检测有hMLH1蛋白表达缺失的15例子宫内膜癌中hMLH1基因启动子甲基化状态,证实9例存在hMLH1基因启动子甲基化,提示其为子宫内膜癌的散发性病例。结论对子宫内膜癌患者行MMR蛋白免疫组化SP法染色,结合甲基化特异性PCR检测hMLH1基因启动子甲基化状态,是初步筛查Lynch综合征的有效策略。     

293-siDrosha稳定细胞系模型的建立及检测microRNA相关功能

 摘要：目的 利用RNAi实验方法构建293-siDrosha稳定细胞系，并探讨该稳定细胞系在microRNAs功能研究中的应用。方法 将质粒pSicoR－human Drosha1转入人胚肾293细胞，用G418筛选2-3周后，获得293-siDrosha#3稳定细胞系，并用RT-PCR、Western blotting、real-time PCR等方法检测293-siDrosha#3稳定细胞系中Drosha基因mRNA和蛋白质表达情况。并用poly(A) 实时定量 RT-PCR法检测野生293细胞，Mix细胞(未克隆的293-siDrosha细胞)，293-siDrosha#3细胞（克隆的293-siDrosha细胞）中内源hsa-miR-491-5p的表达情况。结果 构建了293-siDrosha#3稳定细胞系，与对照组相比，293-siDrosha#3细胞中Drosha基因的mRNA和蛋白质表达水平均显著下降。检测内源性hsa-miR-491-5p在对照组和293-siDrosha#3细胞中表达情况，表明对照组细胞中表达的hsa-miR-491-5p是293-siDrosha#3细胞的近120倍。结论 成功构建了293-siDrosha稳定细胞系，并且证明此稳定细胞系可以作为研究一些microRNAs相关功能的模式细胞系。     

利用RNA干涉技术研究雄激素受体在人前列腺癌细胞增殖中的作用

目的: 利用RNA干涉技术抑制雄激素受体(AR)的表达,研究AR在激素依赖性和激素非依赖性前列腺癌细胞增殖中的作用。方法: 设计、合成针对AR的4种不同的小干涉RNA(siRNA),连接到带有人H1启动子的腺病毒载体质粒pShuttle-H1-Ri中,构建成能产生AR-siRNA的质粒pShuttle-H1-Ri-AR,与能表达AR的质粒pcDNA-AR共转染HEK293细胞,Western blot 检测不同的siRNA对AR表达的抑制效率,选取抑制效率高的siRNA制备重组腺病毒,感染LNCap、C4-2B和CWR22Rv1 3种对雄激素有不同反应性的人前列腺癌细胞,采用Western blot 检测感染后细胞中AR的表达程度,并用MTT比色法测定细胞的增殖活性。结果: 4种siRNA都能抑制共转染AR的表达,用抑制效率高的siRNA制备重组腺病毒感染3种靶细胞后,均能特异性地抑制3种细胞中AR的表达,细胞的增殖活性也随之明显下降。结论: AR-siRNA通过抑制激素依赖性和激素非依赖性前列腺癌细胞中AR的表达,有效地抑制细胞的增殖,AR对维持激素依赖性和激素非依赖性前列腺癌细胞的增殖活性具有十分重要的作用,是治疗前列腺癌的重要靶分子。     

维甲酸和茶多酚对结肠癌细胞微卫星序列不稳定的抑制作用

目的 以复制错误（replication error,RER^ )表型的人结肠癌细胞株RKO作为靶细胞，研究全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid,ATRA)和茶多酚（polyphenon,PP)对肿瘤细胞微卫星序列（microsatellite sequence,MS)突变的影响，并观察肿瘤细胞内碱基错误误配对修复（mismatch repair,MMR)基因hMLH1和hMSH2的表达情况。方法 将含有外源性MS（CA）14的穿梭质粒pCMV-CAR转染RER^ 人结肠癌细胞株RKO。外源性的（CA）14的突变可使质粒标记基因Lac Z恢复正常读码，表达产生β－半乳糖苷酶，后者使X－gal变蓝。全反式维甲酸和茶多酚对MS的影响可直接通过X－gal染色结果判断。利用逆转录－聚合酶链反应方法，检测经全反式维甲酸和茶多酚处理的RKO细胞中碱基错误配对修复基因hMLH1和hMSH2的表达情况。结果 全反式维甲酸1μmol/L、0．1μmol/L，茶多酚3μg/ml，对RKO细胞的增殖无明显的影响。作用1周后，均显示对外源性（CA）14的突变有明显的抑制效应。但不能诱导hMLH1和hMSH2表达。结论 全反式维甲酸和茶多酚能抑制RER^ 细胞中外源性（CA）14重复序列突变，提示两者对人癌细胞MS遗传不稳定有保护作用。其作用机理可能不是通过影响hMLH1和hMSH2的表达而起作用。     

PIAS3敲低对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究PIAS3敲低对人前列腺癌细胞系DU145细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法构建PIAS3shRNA表达质粒pSilencer4.1/PIAS3,转染DU145细胞。MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期和凋亡。结果测序证实PIAS3shRNA表达质粒构建成功。转染后DU145细胞PIAS3蛋白表达明显下调。MTT分析显示PIAS3敲低促进细胞增殖,并存在剂量-效应关系。流式细胞术分析显示:PIAS3敲低后S期细胞比例增加,G0/G1期细胞比例减少,凋亡细胞比例减少。结论PIAS3敲低促进体外前列腺癌细胞增殖,抑制其凋亡。     

Microsatellite instability in esophageal squamous cell carcinoma is not associated with hMLH1 promoter hypermethylation

To test whether a subset of esophageal squamous cell carcinomas (SCC) develop through a deficiency in DNA mismatch repair, we examined microsatellite instability (MSI) using 11 microsatellite markers including BAT-26, hMLH1 protein expression by immunohistochemistry, and methylation status of the hMLH1 promoter by methylation-specific polymerase chain reaction (MSP). p53 mutations were also investigated. Microsatellite instability at one or more loci was observed in 40% (12/30) of esophageal SCC tumor samples, although only one of these tumors was categorized as high-frequency MSI (MSI-H) and none showed BAT-26 instability. While immunohistochemistry revealed decreased hMLH1 protein expression in 27% (8/30) of the tumors, hMLH1 promoter hypermethylation was not observed. Absence of hMLH1 protein expression was relatively common in well-differentiated (keratinizing-type) esophageal SCC, but was not associated with hMLH1 promoter hypermethylation. p53 mutation was detected in 37% (11/30) and loss of heterozygosity (LOH) in 90% (27/30) of esophageal SCC samples. Our results suggested that most esophageal SCC develop through defects in tumor suppressor genes (i.e. the suppressor pathway), and that MSI in esophageal SCC probably represent random replication errors rather than being associated with DNA mismatch repair deficiency.     

HMGB1促进外源DNA诱导细胞产生Ⅰ型干扰素

目的探讨HMGB1在外源DNA-poly(dA-dT)刺激细胞Ⅰ型干扰素IFN-β中的作用。方法荧光素酶分析方法检测经poly(dA-dT)刺激后细胞IFN-β的表达差异,同时PCR法检测了胞内重要DNA结合蛋白—高迁移率族蛋白-1(HMGB1)的表达改变;构建携带HMGB1特异性shRNA的慢病毒载体,获得HMGB1稳定下调(HMGB1KD)细胞,经poly(dA-dT)刺激后检测IFN-β表达,分析HMGB1在外源DNA刺激IFN-β产生中的作用。结果 poly(dA-dT)刺激293T细胞后,IFN-β表达显著上调,同时,HMGB1的表达在不同细胞中也明显上升,当下调HMGB1后,poly(dA-dT)刺激IFN-β产生的能力大幅削弱,表达水平降至对照组的1/8(P<0.05)。结论 HMGB1在促进外源DNA诱导Ⅰ型干扰素产生中发挥了关键作用。     

利用CRISPR/Cas9系统构建4T1细胞CXCR4基因敲除稳定细胞株

目的 利用CRISPR/Cas9系统敲除4T1细胞中的CXCR4基因,构建稳定敲除CXCR4基因的4T1细胞株。 方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,在美国国立生物技术信息中心（NCBI）上找到CXCR4基因序列的外显子区域,设计两条sgRNA,用LentiCRISPRv2作为载体构建LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒并转化至感受态的Stbl3菌体中,挑取单克隆测序验证并扩大培养提质粒后转染至293T细胞中包装成慢病毒。 收集病毒并感染4T1细胞,通过嘌呤霉素筛选并用有限稀释法分离培养出单克隆细胞。 提取筛选出的单克隆细胞基因组DNA并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增并测序;用Real-time PCR检测细胞株CXCR4基因mRNA表达情况;用免疫印迹法检测CXCR4蛋白质的表达情况。 结果 LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒构建成功;经过基因组DNA片段PCR扩增测序得1株缺失27 bp的稳定敲除CXCR4基因的细胞株;细胞株CXCR4mRNA的表达量低且几乎无CXCR4蛋白质的表达。 结论 通过CRISPR/Cas9系统获得靶向敲除CXCR4基因的重组质粒,并筛选出稳定敲除CXCR4基因的细胞株。     

Mismatch repair protein expression and microsatellite instability: a comparison of clear cell sarcoma of soft parts and metastatic melanoma.

Clear cell sarcoma of soft parts is a rare soft tissue malignancy that shows phenotypic overlap with cutaneous melanoma but can be distinguished by the presence of a t(12;22) translocation. Microsatellite instability (MSI), a variation in the lengths of short repeat DNA segments in the genome, has been implicated in melanoma tumorigenesis, but is rare or absent in clear cell sarcoma. Defects in the mismatch repair (MMR) enzyme complex correlate with MSI in some tumor types, allowing the use of immunohistochemistry for the MMR proteins hMLH1 and hMSH2 to predict the presence of MSI. To determine if the association between MMR defects and MSI extends to clear cell sarcoma, we compared a group of nine clear cell sarcomas to 11 metastatic melanomas on the basis of MSI and the expression of MMR proteins. MSI was studied using fluorescence-based multiplexed PCR of five loci. Immunohistochemistry was evaluated on formalin-fixed paraffin-embedded tissue for hMLH1, hMHS2 and hMSH6. MSI was present in only 1/9 (11%) clear cell sarcoma case and in 8/11 (73%) melanoma cases. Immunostaining for hMLH1 and hMSH2 was preserved in all the clear cell sarcomas but loss of immunostaining for one or both proteins was seen in 6/11 melanomas (55%). hMSH6 was detected in 7/9 (78%) clear cell sarcomas and 10/11 (91%) of melanomas. Clear cell sarcoma and metastatic melanoma differed significantly with respect to the presence of MSI (P=0.010) and staining for hMLH1 and/or hMSH2 (P=0.014) but not hMSH6 (P=0.57). Mismatch repair, and consequently genomic instability may contribute to tumorigenesis in melanoma but not clear cell sarcoma. Immunostaining for hMLH1 and hMSH2 and MSI analysis may be helpful in the differential diagnosis of large soft tissue or visceral malignancies with melanocytic differentiation.     

Promoter hypermethylation and inactivation of hMLH1, a DNA mismatch repair gene, in head and neck squamous cell carcinoma.

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a multistage process during which adverse genetic alterations accumulate resulting in loss of cell cycle control, selective cell overgrowth, and ultimately formation of malignancy. Among various genetic alterations in HNSCC is increased microsatellite instability (MSI). hMLH1 is one of the major mismatch DNA repair genes, the inactivation of which caused increased MSI in a variety of human cancers including HNSCC. While somatic mutation is a major mechanism of the hMLH1 gene inactivation in hereditary form of human cancer, promoter hypermethylation appears to be primarily involved in the inactivation of the hMLH1 gene in sporadic form of human cancers. In the current study, we analyzed 78 cases of HNSCC for hMLH1 protein expression and promoter hypermethylation by IHC and methylation-specific PCR (MSP). Twenty-four of 78 cases (31%) of HNSCC contained markedly reduced levels of the hMLH1 protein. Based on the IHC results, 8 cases without and 8 with hMLH1 protein expression (total of 16) were further analyzed by MSP. Seven of 8 cases (88%) that were negative for the hMLH1 protein displayed promoter hypermethylation, whereas 7 of 7 cases (100%) strongly positive for the protein were free of promoter methylation. This study confirms our previous conclusion that promoter hypermethylation represents a major mechanism of the hMLH1 gene inactivation in HNSCC.     

Wnt2在肝细胞肝癌中的表达及对HepG2细胞增殖的影响

 目的 探讨Wnt2在原发性肝细胞肝癌(HCC)中的表达及转染靶向Wnt2的siRNA对人肝癌HepG2细胞的抑制效果。方法 实时荧光定量PCR法和免疫组化法检测Wnt2在肝癌组织,癌旁组织及正常肝组织的表达差异;使用siRNA沉默人肝癌HepG2细胞Wnt2的表达后,检测Wnt2基因和蛋白的表达变化,并检测细胞的增殖和周期变化。结果 1）在上述组织中,Wnt2在癌内表达最高,癌旁次之,正常肝最低。2）使用siRNA沉默人肝癌HePG2细胞Wnt2后,Wnt2基因和蛋白表达下调,细胞增殖受抑制,其生长主要停滞在G0/G1期,而S期细胞所占比例下降。结论 肝细胞肝癌中存在Wnt2的高表达;siRNA可抑制HepG2细胞Wnt2的表达,并抑制HepG2生长,Wnt2基因可能是调控肝癌基因表达的新的靶基因。