维甲酸对胎鼠Vangl1及Vangl2基因表达的影响

神经管畸形的发生是由遗传因素与环境因素共同作用产生的。平面细胞极性途径（planar cell polarity，PCP）对脊椎动物神经胚形成非常重要。该途径基因的任何突变都可能导致神经管不能闭合，与人类的颅脊柱裂相似。但是，环境因素是否影响、如何影响PCP途径基因的表达到目前仍不清楚。目的研究维甲酸对胎鼠Vangl1及Vangl2基因表达的时空特征的影响。方法全反式维甲酸橄榄油混悬液按120mg／kg在BALB／C小鼠怀孕第9．5天（E9．5）（B组）或E10．5（C组）灌胃，A组仅用橄榄油灌胃。取E9．5、E10．5、E11．5、E13．5、E15．5、E17．5、E19．5胎鼠，Vangl1及Vangl2基因表达量采用逆转录酶PCR（RT—PCR）检测，其时空表达采用全胚胎原位杂交（WISH）检测。结果结果显示，正常情况下Vangl1及Vangl2基因在整个神经胚形成过程中都有强表达。而B组胎鼠从脑到后神经孔Vangl1及Vangl2基因表达显著下调。C组较复杂，二基因表达在全胚胎（从E11．5到E13．5）及神经管脊柱区（从E15．5到E19．5）显著下调并维持低表达，但在神经管的颅区（E15．5到E19．5）仅中度下调。结论：结果提示，维甲酸诱导的神经管畸形的发生与Vangl1及Vangl2基因转录子下调有关。     

灵芝孢子降低维甲酸诱导的孕鼠胚胎神经管畸形的发生

目的 探讨灵芝孢子能否促进受维甲酸诱导,而停滞在G0/G1期的胚胎神经管神经上皮细胞重新进入细胞周期循环,继续增殖和分化,减少神经管畸形的发生.方法 于实验对照组和灵芝孢子组小鼠孕期胚胎E17.75d时一次性胃饲全反式维甲酸,造成这两组孕鼠的胚胎出现神经管畸形.然后,给予灵芝孢子组孕鼠胃饲灵芝孢子溶液.在孕期E10.5d时取出两组孕鼠的胚胎,分别计数胚胎的神经管畸形发生率.应用免疫荧光组织化学染色和流式细胞仪检测胚胎神经管神经上皮的巢蛋白(nestin)表达情况.应用DNA定量荧光染色和RT-PCR技术检测胚胎神经管依赖细胞周期蛋白激酶2(Cdk2) mRNA和Cdk4 mRNA的转录.结果 灵芝孢子组孕鼠胚胎的神经管畸形发生率显著低于实验对照组.神经管神经上皮细胞表达nestin的百分率也明显大于实验对照组.实验对照组孕鼠胚胎的神经管细胞在G0/G1期的比例则显著高于灵芝孢子组,但是实验对照组神经管细胞S期的比例低,低于灵芝孢子组形态正常的胚胎神经管细胞.RT-PCR检测发现,灵芝孢子组孕鼠胚胎神经管细胞能够正常转录Cdk4 mRNA,而实验对照组则低转录Cdk4 mRNA.结论 灵芝孢子能够减少维甲酸诱导的妊娠小鼠孕期E10.5d胚胎神经管畸形的发生.     

灵芝孢子在降低维甲酸诱导胚胎小鼠发生神经管畸形过程中对Cdk4表达的影响

目的 探讨灵芝孢子在降低维甲酸诱导胚胎小鼠发生神经管畸形过程中对依赖细胞周期蛋白激酶4(CDk4)表达的影响.方法 给予实验对照组和灵芝孢子组妊娠E7.75d的小鼠一次性胃饲维甲酸,造成这2组孕鼠的胚胎出现神经管畸形.然后,给予灵芝孢子组孕鼠胃饲灵芝孢子溶液.在孕期E10.5d时取出2组孕鼠的胚胎,应用免疫荧光组织化学染色和Western blotting检测胚胎神经管神经上皮依赖细胞周期蛋白激酶4(Cdk4)的表达情况.结果 在灵芝孢子组可以观察到形态正常的胚胎中,神经管的神经上皮细胞有Cdk4的表达,其表达水平与空白对照组及正常对照组相比较没有明显差异.在灵芝孢子组形态异常的胚胎中,其神经管的神经上皮细胞也有cdk4的表达,但其表达水平与空白对照组及正常对照组相比较是低的.结论 灵芝孢子可能是通过促进神经管神经上皮细胞上调Cdk4的表达来减轻维甲酸诱导的胚胎小鼠神经管畸形.     

灵芝孢子在预防维甲酸诱导胚胎小鼠发生神经管畸形过程中对Cdk4表达的影响

目的探讨预先服用灵芝孢子在降低维甲酸诱导胚胎小鼠发生神经管畸形过程中对依赖细胞周期蛋白激酶4(cyclindependentproteinkinase4,Cdk4)表达的影响。方法于孕期小鼠E0d时给予灵芝孢子组的孕鼠胃饲灵芝孢子溶液,8g·kg-1·d-1。实验对照组的孕鼠胃饲等量溶剂。于E7.75d时,两组孕鼠一次性胃饲维甲酸,剂量为50mg/kg体重。正常对照组孕鼠胃饲等量灵芝孢子溶剂,但是在E7.75d时,仅给予维甲酸溶剂。空白对照组孕鼠常规饲养不作任何处理。在孕期E10.5d时取出4组孕鼠的胚胎,应用免疫荧光组织化学染色和Westernblot检测胚胎神经管神经上皮Cdk4表达情况。结果实验对照组孕鼠胚胎神经管神经上皮细胞Cdk4的表达明显降低,而灵芝孢子组胚胎表达Cdk4的强度明显高于实验对照组。正常对照组与空白对照组相比Cdk4的表达无统计学意义(P>0.05)。结论灵芝孢子可能是通过增强神经管神经上皮细胞表达Cdk4降低维甲酸诱导胚胎小鼠神经管畸形的发生。     

全反式维甲酸诱导小鼠碱性磷酸酶基因启动子区染色体重构

背景：碱性磷酸酶基因是成骨细胞分化和骨形成的重要标志。在C3H10T1/2细胞中,全反式维甲酸可通过核受体上调小鼠碱性磷酸酶的表达,与MAPK通路无关。 目的：从染色体结构调控方面揭示全反式维甲酸上调碱性磷酸酶表达的分子机制。 方法：10^-6 mol/L全反式维甲酸处理C3H10T1/2细胞0,1,6,12 h,DNA酶Ⅰ超敏感实验确定全反式维甲酸调控区域的位置,染色质免疫共沉淀实验检验全反式维甲酸处理细胞后一系列转录相关因子与全反式维甲酸调控区域结合的量效关系以及时相分布。 结果与结论：DNA聚合酶Ⅰ超敏感实验表明,小鼠碱性磷酸酶启动子转录起始位点上游约520 bp附近为潜在的全反式维甲酸调控区域;染色质免疫共沉淀实验表明,全反式维甲酸对小鼠碱性磷酸酶的上调作用是通过一系列转录相关因子的时序性共同作用来实现。表明全反式维甲酸诱导小鼠碱性磷酸酶基因转录的过程中伴随着染色质重构和组蛋白的修饰作用。     

高温致金黄地鼠神经管畸形的上调表达基因筛选及其鉴定

目的:筛选高温致金黄地鼠神经管畸形的上调表达基因,探讨其分子生物学机制。方法:通过抑制性消减杂交技术获得消减产物,转化大肠杆菌DH5α,构建高温致金黄地鼠胚胎神经管畸形的消减cDNA文库;联合蓝白斑和菌落PCR方法筛选含插入片段的阳性克隆,进行测序和同源性分析,并经Northern杂交技术检测基因的表达。结果:成功构建高温致金黄地鼠胚胎神经管畸形的消减cDNA文库,其中2个克隆插入片段的基因序列与小鼠磷酸甘油酸酯激酶(Pgk-1)同源。Northern杂交证实该基因在高温致畸胚胎神经管的表达较其在同龄正常胚胎神经管明显升高。结论:Pgk-1的上调表达可能与高温致神经管畸形密切相关。     

Dishevelled2 和Vangl2表达与过量维甲酸致昆明小鼠神经管畸形的相关性

目的 探讨Dishevelled2和Vangl 2蛋白与过量维甲酸致昆明小鼠神经管畸形发生的关系。 方法 50只昆明孕小鼠随机分为对照组和实验组。孕775d时,实验组一次性胃饲30mg/kg致畸量维甲酸（RA）,对照组胃饲等量溶剂,服药后4h、18h、42h、66h及90h分别取胚胎,常规石蜡切片,采用原位杂交和免疫组织化学技术,分别检测胚胎神经管组织中Dishevelled2蛋白和Vangl2 mRNA及蛋白的表达水平变化。 结果 两种蛋白均存在于对照组及实验组不同发育阶段的小鼠神经管上皮,且两者的表达变化趋势有所不同。与对照组相比,实验组Dishevelled2蛋白在RA处理18h、42h时表达水平明显降低(P≤0.05),66h时表达升高(P≤0.05),90h时两组表达水平无明显差异;Vangl2 mRNA在灌服RA 4h、18h时表达水平明显低于对照组(P≤0.05),42h时两组表达水平无明显差异,66h时表达显著高于对照组(P≤0.05)。Vangl2蛋白在RA处理18h、42h时表达显著降低(P≤0.05),66h时两组表达水平无明显差异,90h时表达显著高于对照组(P≤0.05)。 结论 过量RA可能通过调节Dishevelled2和Vangl2表达干扰正常胚胎神经管的闭合过程。     

造血干细胞向淋巴系祖细胞增殖分化过程中HOXB4基因的表达

背景:HOXB4基因不仅能促进造血干细胞的扩增及其功能的活化与表达,而且体内试验表明它不会诱发白血病。因此更好地研究HOXB4在造血细胞增殖分化中的变化及作用对进一步研究造血干细胞的扩增可以提供更多的理论基础。目的:观察人类脐血造血干细胞向淋巴系祖细胞增殖分化过程中HOXB4基因表达的情况及全反式维甲酸对HOXB4基因表达的影响。方法:将培养的淋巴系造血祖细胞按干预方式不同分为2组,全反式维甲酸组:在培养体系中加入全反式维甲酸,终浓度6×10-8mol/L。正常组:不加全反式维甲酸,代之以等量的1640培养液。观察人类脐血造血干细胞经植物血凝素诱导后,在培养第3,7,12天的淋巴细胞集落形成单位生成情况。采用实时荧光定量PCR技术检测脐血造血干细胞向淋巴系祖细胞增殖分化过程中HOXB4基因的表达水平。结果与结论:人脐血造血干细胞向淋巴系祖细胞增殖分化过程中,HOXB4基因呈规律的表达。随培养时间推移,正常组和全反式维甲酸组HOXB4基因的表达均逐渐降低。与正常组比较,全反式维甲酸可上调HOXB4基因的表达。     

神经细胞黏附分子1和骨调蛋白在神经管畸形中的变化

目的初步探究神经细胞黏附分子1和骨调蛋白在神经管畸形中的变化。方法20只健康成年SD孕大鼠随机分为正常对照组和神经管畸形实验组,每组10只。通过胃饲维甲酸建立胚胎大鼠神经管畸形模型,检查了神经管畸形鼠体重的变化;用HE染色观察神经管畸形鼠神经管结构的变化;通过Western blot分析神经管畸形鼠组织中神经细胞黏附分子1和骨调蛋白的变化。结果神经管畸形鼠形态偏小,体质量为(0.34±0.45)g,明显低于正常对照组(0.53±056)g。胚胎鼠在第9天神经管处于未闭合状态,在第11天已完全闭合。胚胎第9天和11天神经管畸形大鼠的神经细胞黏附分子1比正常组表达均明显增加(P0.01)。骨调蛋白在胚胎第9 d神经管畸形大鼠中的表达比正常明显增高(P0.01),但在胚胎第11天的表达与正常相比没有差异(P0.05)。结论神经细胞黏附分子1和骨调蛋白的变化可能与神经管畸形形成有密切关系。     

维甲酸和茶多酚对结肠癌细胞微卫星序列不稳定的抑制作用

目的 以复制错误（replication error,RER^ )表型的人结肠癌细胞株RKO作为靶细胞，研究全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid,ATRA)和茶多酚（polyphenon,PP)对肿瘤细胞微卫星序列（microsatellite sequence,MS)突变的影响，并观察肿瘤细胞内碱基错误误配对修复（mismatch repair,MMR)基因hMLH1和hMSH2的表达情况。方法 将含有外源性MS（CA）14的穿梭质粒pCMV-CAR转染RER^ 人结肠癌细胞株RKO。外源性的（CA）14的突变可使质粒标记基因Lac Z恢复正常读码，表达产生β－半乳糖苷酶，后者使X－gal变蓝。全反式维甲酸和茶多酚对MS的影响可直接通过X－gal染色结果判断。利用逆转录－聚合酶链反应方法，检测经全反式维甲酸和茶多酚处理的RKO细胞中碱基错误配对修复基因hMLH1和hMSH2的表达情况。结果 全反式维甲酸1μmol/L、0．1μmol/L，茶多酚3μg/ml，对RKO细胞的增殖无明显的影响。作用1周后，均显示对外源性（CA）14的突变有明显的抑制效应。但不能诱导hMLH1和hMSH2表达。结论 全反式维甲酸和茶多酚能抑制RER^ 细胞中外源性（CA）14重复序列突变，提示两者对人癌细胞MS遗传不稳定有保护作用。其作用机理可能不是通过影响hMLH1和hMSH2的表达而起作用。     

过量维甲酸对金黄地鼠胚胎神经管维甲酸受体β表达的影响

目的探讨过量维甲酸(RA)对金黄地鼠胚胎神经管维甲酸受体(RARβ)基因和蛋白表达的影响。方法采用原位杂交和免疫组织化学方法及图像分析,半定量分析金黄地鼠胚胎神经管正常发生及RA致神经管畸形过程中RARβ转录和表达水平的变化。结果正常对照组RARβ表达水平随胚龄增加呈先降低后升高并再次减弱的趋势。实验组在灌服过量RA后3、6h,RARβ表达水平明显低于正常对照组(P<0.01);14h时表达升高显著高于正常对照组(P<0.05);22h时其表达再次降低明显低于对照组(P<0.01);46、96h表达逐渐增强,96h时明显高于对照组(P<0.01)。结论过量RA引起的RARβ转录和表达水平的变化与RA致金黄地鼠神经管畸形相关。     

桉叶油联合维甲酸对SD胎鼠脑组织Pax3和缝隙连接蛋白43表达的影响

目的探讨桉叶油联合维甲酸(RA)对SD胎鼠脑组织转录因子Pax3、缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响。方法 SD孕鼠42只,随机分为6组,每组7只,正常对照组,RA组,溶剂对照组(花生油+RA),3个实验组(桉叶油高、中、低剂量+RA)。正常对照组自由摄食饮水,溶剂对照组于孕第7~14天每只花生油2ml灌胃,每天1次,孕第10天40mg/kg RA灌胃1次。桉叶油3个剂量组于孕第7~14天分别桉叶油300、200和100mg/kg灌胃,每天1次,孕第10天40mg/kg RA灌胃1次。RA组于孕第10天40mg/kg RA灌胃1次。各组于孕21天处死孕鼠取胚胎,Western blotting、免疫组织化学技术检测胎鼠脑组织的Pax3、Cx43蛋白的表达。Real-time PCR检测脑组织Pax3、Cx43 mRNA表达。阿利新蓝和茜素红进行骨骼染色,体视显微镜下观测椎骨发育,脊柱间隙。结果维甲酸灌胃各组胎鼠椎骨数量异常的胎鼠数与正常对照组比较差异无显著性,但在维甲酸灌胃各组中,胎鼠椎骨形态异常的异常率和胎鼠椎骨分裂的百分率最低值分别为55%(桉叶油高剂量+RA组)和45.8%(桉叶油低剂量+RA组),较正常对照组高(0)(P0.05)。在维甲酸灌胃各组中,桉叶油各组胎鼠椎骨形态异常的异常率和胎鼠椎骨分裂的百分率最高值分别为62.5%(桉叶油低剂量+RA组)和55.0%(桉叶油高剂量+RA组),较维甲酸组(73.7%,73.7%)和溶剂对照组低(68.2%,63.6%,P0.05)。与正常组胎鼠比较,维甲酸灌胃各组大脑组织的Pax3、Cx43蛋白及其mRNA的表达较正常组高(P0.05),在维甲酸灌胃各组中,桉叶油灌胃各组胎鼠脑组织Pax3、Cx43蛋白及其mRNA的表达较单纯RA灌胃组低,其差异有统计学意义(P0.05)。结论桉叶油对维甲酸引起胎鼠神经管缺陷有一定的拮抗作用。其机制可能与桉叶油拮抗维甲酸上调胎鼠神经组织的Pax3、Cx43蛋白过度表达有关     

Involvement of retinoic acid and its receptor beta in differentiation of motoneurons in chick spinal cord.

Retinoic acid is known to play an important role during development of central nervous system. In order to clarify function of retinoic acid during the development, we investigated expression pattern of the chick retinoic acid receptor subtype beta gene by an in situ hybridization method. We found that expression of the beta gene is localized in neural tube at stages 16-20, then is turned to be restricted to developing motoneurons at stages 23-29. These results suggested that retinoic acid and its receptor beta are involved in differentiation of the motoneurons in spinal cord.     

Prenatal effects of retinoic acid on lumbar spinal cord development and liver antioxidants in rats

During embryonic and early postnatal development, retinoic acid (RA) regulates genes that control neuronal differentiation and neurite outgrowth from the neural tube. The effects of high levels of RA on the CNS can be detected via nitric oxide (NO), which plays a crucial role in neural transmission. The aim of the study was to investigate the prenatal influence of high levels of RA on postnatal development of nitrergic structures in lumbar spinal cord and antioxidant status. RA was administered orally at a dose of 10 mg/kg body weight to pregnant female Wistar rats during days 8–10 of gestation. Neuronal nitric oxide synthase (nNOS) of lumbar spinal cord sections was processed for visualization via nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-diaphorase (NADPH-d) histochemistry on postnatal day one, day twenty-one and in adults. The results suggest that prenatal administration of high levels of RA is not associated with postnatal morphological changes in nNOS-positive neurons in the rat lumbar spinal cord. An estimation of the activity of enzymes related to the storage of retinoid in the liver showed possible side effects. Suppression and deepening of superoxide dismutase activity persisted into adulthood, and a concurrent downregulation of glutathione reductase was noted. A decrease in reduced glutathione persisted until adulthood when other compensatory mechanisms were probably active to maintain an appropriate level.