PODXL参与瘢痕疙瘩成纤维细胞的过度增殖

目的探讨podocalyxin样蛋白(PODXL)基因对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的影响。方法 RT-qPCR检测正常皮肤成纤维细胞(hDF)和瘢痕疙瘩成纤维细胞(hKF)中PODXL mRNA的表达量;用重组PODXL基因的shRNA慢病毒表达载体感染瘢痕疙瘩成纤维细胞下调PODXL基因的表达量; EdU法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞的周期和凋亡率;蛋白质印迹(Western blot)检测细胞中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、丝苏氨酸蛋白激酶(AKT)总蛋白和磷酸化蛋白。结果与正常皮肤成纤维细胞相比,PODXL mRNA在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达量显著增加(P0.05);下调PODXL基因表达显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖(P0.05),阻滞细胞周期于S期,促进细胞的凋亡(P0.05),降低PI3K和AKT磷酸化蛋白水平(P0.05)。结论 PODXL在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达量显著增加;下调PODXL基因表达可能通过抑制PI3K/AKT信号通路激活,从而将细胞周期阻滞在S期,抑制细胞的增殖和诱导凋亡。     

CML患者骨髓单个核细胞基因表达谱分析

目的 探讨慢性髓细胞性白血病(CML)的基因表达变化。方法 分别从正常人和CML患者骨髓样品中抽取骨髓单个核细胞,分离出cDNA片段,然后再逆转录成cRNA并标记后,与人的全基因组表达谱芯片杂交,ABI 1700芯片分析系统进行分析基因表达谱的差异。结果 总共发现差异表达的基因有6706个,其中与CML相关的差异基因有75个(上调19个,下调56个)。结论 全基因组寡核苷酸基因芯片在分析基因表达谱差异研究中具有广泛的应用价值。     

哮喘患儿外周血单个核细胞全基因组表达谱的差异研究

 目的： 筛选哮喘患儿与对照组儿童外周血的基因表达谱差异,寻找与哮喘防治相关的靶基因。方法：从5名哮喘患儿和5名对照组儿童外周血单个核细胞中提取总RNA,利用全基因组表达谱芯片进行检测,选取经非配对t检验计算所得P≤0.05、同时基因表达变化≥2倍的差异表达基因,以荧光定量PCR（qRT-PCR）验证芯片结果。通过生物信息学软件对初步筛选的差异基因进行层次聚类分析和Gene Ontology (GO)功能分类分析。结果：从45 033条表达基因谱中筛选出哮喘患儿与对照组儿童差异表达2 倍以上且P≤0.05的已命名基因758个（含上调基因345个,下调基因413个）,其GO生物学过程功能分类主要涉及免疫反应、对外部刺激的反应、信号转导及分子功能的负性调节、细胞死亡、凋亡及其调节等。其中有29个基因与哮喘、气道炎症或气道重构有关,且变化趋势与文献报道一致（含上调基因14个,下调基因15个）,并可被层次聚类分析划分为9类。qRT-PCR验证结果与芯片结果一致。结论：用全基因组表达谱芯片可以筛选出哮喘患儿与对照组儿童外周血单个核细胞中的差异表达基因, 进一步的数据挖掘很可能寻找到与哮喘防治相关的靶基因或靶通路。     

不同氧体积分数对人胚胎干细胞基因表达谱的影响

背景：低氧培养人胚胎干细胞的相关研究主要集中在干细胞多能性的维持及分化方面,而低氧对人胚胎干细胞基因表达水平的影响研究甚少。 目的：观察不同氧体积分数对人胚胎干细胞基因表达谱的影响。 方法：分别在低氧(体积分数5%O2)和常氧(体积分数21%O2)的条件下持续培养FY-hES-7细胞,收集晚期(第52代)细胞,运用全基因组表达谱芯片技术检测不同氧体积分数组FY-hES-7细胞的基因表达谱,并进行差异基因的功能富集分析及通路分析。 结果与结论：与常氧组相比,低氧组表达上调(>2倍)的基因1 840个,表达下调(>2倍)的基因1 676个。利用基因本体分析发现低氧组表达上调基因与细胞表面受体信号转导、免疫反应、离子转运、生物代谢及细胞活动等功能相关,而表达下调基因则与转录调控,依赖DNA的转录调控、神经分化、细胞形态、胚胎形态、胚胎器官及各系统发育等功能相关。通路分析发现低氧组表达上调的基因与细胞因子受体的相互作用、免疫反应以及造血系统等通路的改变相关,而表达下调的基因则多与胚胎发育及肿瘤通路改变相关。不同氧体积分数下长期培养的人胚胎干细胞基因表达谱存在明显的差异,低氧组出现差异表达基因的功能分析表明低氧有助于人胚胎干细胞的自我更新,防止分化及降低成瘤性。     

口腔鳞状细胞癌及癌旁正常组织基因表达谱芯片检测

背景：近年在整体水平上以高通量分子扫描手段为基础的基因组学、蛋白质组学以及计算机辅助设计等技术的整合及相互关联的“技术链”的应用已在乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤等的研究中取得了丰硕的成果,但关于口腔鳞状细胞癌的研究较少。 目的：实验通过基因表达谱芯片检测口腔鳞状细胞癌组织与癌旁正常组织的基因表达谱。 方法：收集广东省口腔医院2013年手术切除的口腔鳞癌及癌旁正常组织各2例,采用Roche NimbleGen全基因组表达谱芯片进行口腔鳞癌及癌旁正常组织的基因表达谱检测。 结果与结论：按差异基因筛选标准,从32 448条检测基因中筛选出口腔鳞癌肿瘤组织的差异基因共有7 872条,占筛选基因总数的24%;其中上调表达的基因有3 800条,下调表达的有4 072条。结果证实,通过基因表达谱芯片检测并根据表达差异1倍以上的筛选标准得到了7 872个表达差异的基因。由此可见肿瘤的发生发展不是单个或几个基因的作用结果,以往实验往往针对某个或某几个基因的研究有很大的局限性。同时也说明了肿瘤的产生是多基因成网络相互调节作用的结果,而且这个网络的作用关系是非常复杂的。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程     

膀胱移行细胞癌免疫相关基因的研究

目的 探讨人膀胱移行细胞癌组织中免疫功能相关基因的表达变化。方法使用人肿瘤基因表达谱芯片检测11例膀胱移行细胞癌组织基因表达谱的变化，以寻找与免疫功能相关的差异表达的基因。结果以正常膀胱黏膜组织为对照，膀胱肿瘤组织中有87个基因表达明显下调，102个基因表达明显上调。其中与免疫功能相关的基因有17个，明显上调基因8个，明显下调基因9个。结论膀胱肿瘤的发生、发展与多种免疫功能相关基因的异常表达有关。     

瘢痕疙瘩组织中c-myc、ras原癌基因的表达

目的 探讨c-myc、ras原癌基因表达与瘢痕疙瘩形成的关系。方法 应用免疫组织化学方法检测c-myc、rasp21蛋白在30例瘢痕疙瘩组织和26例正常皮肤组织中的表达和分布。结果 c-myc蛋白在瘢痕疙瘩成纤维细胞中呈强阳性表达，与正常皮肤对照组相比，差异有显著性（P〈0．001），在瘢痕疙瘩的成纤维细胞中，rasp21蛋白缺乏表达。结论 瘢痕疙瘩中c-myc蛋白表达升高提示c-myc原癌基因的激活，c-myc原癌基因可能参与了成纤维细胞的分化增殖、胶原合成与降解以及对细胞因子的调控，并导致瘢痕增生；ras原癌基因在瘢痕疙瘩形成中可能不突变或不起主要调控作用，这可能是瘢痕疙瘩较少癌变的原因。     

基因芯片筛选HepG2与HepG2.2.15细胞中的差异表达基因

目的 探讨HepG2细胞及HepG2.2.15细胞中差异表达的基因并对其基因表达谱进行生物学信息分析.方法 用Trizol一步法提取HepG2细胞及HepG2.2.15细胞的总RNA,并纯化mRNA,反转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记的cDNA探针,与基因芯片杂交;采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析,把图像信号转化为数字信号,最后以差异为2倍的标准来确定差异表达基因.结果 在54614个基因表达谱的筛选中,发现有4462个基因表达水平显著上调,2592个基因表达水平显著下调.结论 HBV基因组及其表达产物对于肝细胞基因表达谱有显著影响,可能参与了肝癌的发生发展.     

先天性小耳畸形相关差异表达基因的初步研究

目的研究先天性小耳畸形的基因表达谱并验证差异表达基因。方法以我科收治的单侧先天性小耳畸形患者为研究对象,同一患者的残耳软骨组织为实验组,正常侧耳软骨组织为对照组。通过Agilent Arraystar Human Lnc RNA Microarray V3.0研究残耳和正常侧耳软骨组织基因表达谱的差异。通过实时定量PCR方法验证差异表达基因。结果先天性小耳畸形软骨组织中差异表达基因共553条,其中表达上调的基因120条(如FGFR2基因上调2.64倍),表达下调的基因433条(如ZNF44基因和Wdr82基因分别下调2.00倍和3.65倍)。这些差异表达基因涉及胚胎发育、肢体形成、骨骼发育及信号转导等生物学事件。q PCR结果显示,与对照组相比,实验组软骨组织中FGFR2(t=4.588,P0.01)基因表达上调,而ZNF44(t=5.398,P0.01)和Wdr82(t=5.519,P0.01)基因表达下调。与基因表达谱芯片结果一致。结论筛选了先天性小耳畸形的差异表达基因,FGFR2、ZNF44和Wdr82基因表达变化可能与先天性小耳畸形发病有关。     

病理性瘢痕与正常皮肤的蛋白质组学研究

目的: 通过比较病理性瘢痕与正常皮肤组织的蛋白质组表达差异,寻找和筛选出病理性瘢痕形成机制中的特异蛋白质。方法: 运用蛋白质组学技术,对8例瘢痕疙瘩、8例增生性瘢痕患者的组织和3例正常皮肤组织进行差异双向电泳(2D-DIGE),选择差异蛋白质斑点,进行MALDI-TOF/TOF质谱分析和生物信息学分析。结果: 成功建立病理性瘢痕和正常皮肤组织的双向凝胶电泳图谱,瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和正常皮肤组织凝胶电泳图谱中平均蛋白质斑点数分别为2 978、2 975和3 053。与正常皮肤组织相比,我们对瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中差异超过4倍的斑点进行质谱分析和数据库检索,共鉴定出36种不同蛋白,包括:瘢痕疙瘩和增生性瘢痕表达相同的16种蛋白,其中上调蛋白8种,下调蛋白8种;只在瘢痕疙瘩中表达的有11种不同蛋白,其中上调9种,下调2种;只在增生性瘢痕中表达的有9种不同蛋白,其中上调4种,下调5种。结论: 蛋白质组学较好地显示了病理性瘢痕与正常皮肤组织间的蛋白质表达差异;进一步研究鉴定出的差异蛋白质,有可能对揭示病理性瘢痕形成机制提供新的思路。     

PSMA基因沉默的前列腺癌细胞中肿瘤转移相关基因表达的芯片分析

目的: 探讨前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen, PSMA)在前列腺癌转移过程中的作用通路。方法: 针对PSMA mRNA序列设计合成siRNA序列,脂质体转染LNCaP细胞特异性下调PSMA基因的表达,通过肿瘤转移基因芯片分析84个肿瘤转移相关基因的表达差异。结果: 成功设计了siRNA序列并制备最佳干扰效果的干扰样,mRNA干扰效果达到75%以上,蛋白水平干扰效果达68%以上。通过基因芯片检测发现在下调PSMA基因表达后,有CDH6、CXCL12等10个基因发生了显著上调,而CCL7、MDM2等4个基因发生显著下调表达。结论: 初步发现PSMA参与前列腺癌转移信号通路的调节,为进一步研究PSMA的生物学功能,探索前列腺癌的转移机制奠定了基础。     

人Smad7腺病毒表达载体的构建及体外表达

用DNA直接克隆连接的方法,构建人Smad7腺病毒重组质粒,再用293细胞包装。重组腺病毒经扩增、纯化后,感染体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞,用RT-PCR方法检测细胞中人Smad7mRNA的转录。经酶切和PCR鉴定证实了人Smad7重组腺病毒质粒构建成功,RT-PCR证实瘢痕疙瘩细胞中有腺病毒载体介导的Smad7mRNA的过度表达。结果证实构建的人Smad7腺病毒表达载体可在体外细胞中表达,并可进一步应用于瘢痕疙瘩基因治疗方面的研究。     

乙型肝炎病毒E抗原肝细胞作用蛋白AK026018表达谱芯片的研究

目的 应用基因芯片技术,筛选能被乙型肝炎病毒E抗原（HBeAg）肝细胞作用蛋白AK026018反式调节的靶基因,初步研究该蛋白的生物学功能.方法 应用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术,从HepG2细胞中扩增编码AK026018蛋白的全基因,构建真核表达载体,转染肝母细胞瘤系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果 经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确.在8464个基因表达谱的筛选中,发现有122个基因有差异表达,其中78种基因表达水平显著下调,45种基因表达水平显著上调.结论 成功地应用DNA芯片技术筛选出HBeAg结合蛋白新基因AK026018的反式调节蛋白,证明该基因对于肝细胞基因表达谱有显著影响.     

K562细胞VEGF基因表达下调后的基因表达谱改变

目的探讨血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因VEGF表达下调对白血病K562细胞株基因表达谱的影响。方法采用脂质体介导的方法将抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体pcDNA-RZ转染白血病细胞株K562、G418抗性筛选获得阳性克隆；抽提基因组DNA，用PCR方法验证核酶基因已转入K562细胞；荧光定量PCR和免疫印迹反应检测白血病细胞中VEGF mRNA和蛋白表达量的改变；应用cDNA微阵列技术检测VEGF基因表达下调对白血病K562细胞株基因表达谱的影响。并用逆转录PCR验证PCNA、GSN基因的表达改变。结果抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体pcDNARZ转入白血病细胞株K562、G418筛选两周获得阳性克隆，PCR检测证实核酶基因整合入白血病细胞基因组DNA；与K562及K562／PC细胞（转染空质粒的K562细胞）相比，转染VEGF核酶基因的K562／RZ细胞VEGF mRNA和蛋白的表达量明显降低，芯片中共有表达差异的基因191条，包括周期相关基因、细胞凋亡相关基因、癌基因以及细胞信号和传递蛋白等基因，其中104条表达下调，87条表达上调。逆转录PCR证实GSN基因表达上调，PCNA基因表达下调。结论VEGF基因表达下调能引起白血病K562细胞株基因表达谱的改变，这些基因的改变可能对白血病细胞增殖、分化和凋亡等生物学行为产生了一定的影响。     

Identification and characterization of cartilage oligomeric matrix protein as a novel pathogenic factor in keloids

To elucidate pathogenic molecules in keloids, microarray analysis was performed using RNAs extracted from keloid-derived fibroblasts and normal skin-derived fibroblasts from the same patient with a typical keloid. Among 11 up-regulated extracellular matrix genes, cartilage oligomeric matrix protein (COMP) was most prominently increased. Up-regulation of COMP mRNA and protein was confirmed in the keloid tissue by quantitative RT-PCR and Western blot. Using immunohistochemistry, we compared 15 keloids and 6 control normal tissues using a COMP-specific antibody and found that COMP stained positively in 10 keloids (66.7%), whereas no staining was observed in normal tissues, demonstrating the ectopic expression of COMP in keloids. Comparing keloids smaller or larger than 10 cm(2), the larger keloids were significantly more intensely stained with the COMP-specific antibody. Because COMP reportedly accelerates collagen type I fibril assembly, we examined whether extracellular type I collagen deposition is altered by silencing COMP mRNA by small interfering RNA (siRNA). Immunocytochemistry showed at 96 hours after transfection with COMP siRNA that the extracellular deposition of type I collagen was decreased compared to that observed with control siRNA. Further, COMP knockdown decreased amount collagens type I to V in the medium and on the cell surfaces. Our data suggest that COMP facilitates keloid formation by accelerating collagen deposition, thus providing a new therapeutic target.     

RNA干扰敲低GSK-3β对瘢痕疙瘩形成影响的体外研究

目的:利用RNA干扰技术探讨糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KFB)的抑制效果。方法:将针对人GSK-3β基因设计合成的3对特异性小干扰RNA(siRNA)分别转染体外培养的人KFB,通过RT-PCR和Western blot筛选出干扰人KFB GSK-3β基因表达的最佳siRNA,进而转染人KFB,并用RT-PCR和Western blot检测GSK-3β及相关蛋白的m RNA和蛋白表达。结果:1434序列具有最佳的GSK-3βm RNA和蛋白抑制效率。转染GSK-3βsiRNA后,KFB的β-catenin、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p-GSK-3β和Wnt2的蛋白水平下降,KFB活力下降,且随着培养时间的延长,细胞生长受抑制程度增大,细胞倍增时间明显延迟。结论:转染靶向GSK-3β的siRNA可有效降低该基因在KFB内的表达,从而抑制了瘢痕疙瘩生长,具有潜在的治疗前景。     

去卵巢和雌激素替代治疗对心肌细胞基因表达谱的影响

目的：本实验通过高通量的cDNA微阵列技术，研究去卵巢和雌激素替代治疗对心肌细胞基因表达谱的影响，寻找雌激素的靶基因。方法:用 1 400 个基因构建的cDNA微阵列检测假手术组（Ⅰ）、去卵巢组（Ⅱ，去势组）和雌激素替代治疗组（Ⅲ，替代组）3组SD雌鼠心肌组织的基因表达差异,随机选2个基因用半定量RT-PCR验证检测结果。结果:假手术组和去势组共检出心肌差异表达的基因177个，其中去卵巢导致上调的基因91个，下调的基因86个；去势组和替代组共检出心肌差异表达的基因164个，其中雌激素替代治疗后导致上调的基因113个，下调的基因54个。Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅱ比较，相同的差异表达基因54个，雌激素明显影响心肌膜通道和载体（18个）、细胞受体（9个）、信号转导相关基因（7个）和细胞代谢（6个）的mRNA水平。而大部分基因（45个）是在去势组表达下调，在雌激素替代组表达上调。RT-PCR实验证实了cDNA微阵列结果 。结论：长期雌激素替代治疗明显影响心肌细胞膜通道和载体、信号转导、细胞受体和细胞代谢等相关基因的表达。长期雌激素替代治疗可通过增加Na+,K+-ATPase和Na+/H+交换蛋白的基因表达，稳定心肌细胞内Na+和K+的浓度。雌激素还可抑制多巴胺受体基因的表达，预防心肌肥大、充血性心衰等心脏疾病的发生。     

Hsp701A基因的RNA干涉对HepG2细胞化疗敏感性的影响

目的：研究Hsp701A基因靶向siRNA表达载体对肿瘤细胞化疗药物敏感性的影响。方法：构建Hsp701A靶向小干涉RNA（siRNA）的真核表达载体，并转染HepG2细胞，以证实siRNA真核表达载体RNAi的有效性。用四唑蓝（MTT）比色法检测HepG2细胞对白藜芦醇、顺铂的敏感性。结果：以构建的Hsp701A基因靶向siRNA的真核表达载体稳定转染HepG2细胞后，两种RNAi组细胞中Hsp701ARNA和蛋白的表达水平均明显下降。Hsp701A基因靶向siRNA真核表达载体转染后，HepG2细胞对不同化疗药物的敏感性有不同程度的增加（P〈0．05）。结论：Hsp701A基因的RNA干涉可增强HepG2细胞对化疗药物的敏感性。     

携带小鼠白细胞介素-12 siRNA基因重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞中的表达

目的:构建载有白细胞介素-12干扰RNA(IL-12si RNA)基因的,能在树突状细胞(DC)表达的重组腺病毒载体,为免疫耐受提供基础。方法:将IL-12p35si RNA和IL-12p40si RNAcDNA克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle2,得到重组质粒,并与腺病毒骨架质粒BD Adeno-XTM体外连接后代共转化大肠杆菌DH5α菌株,重组腺病毒质粒经过293细胞的包装扩增及氯化铯(CsCl)纯化,生成带有IL-12p35和IL-12p40si RNA基因的重组腺病毒载体,感染DC细胞。结果:经形态学、病毒DNA酶切、聚合酶链反应(PCR)和逆转录(RT)等方法的鉴定,证实了载体构建的正确性;经测定,病毒滴度为2.5×1010efu/ml。结论:成功构建带有IL-12p35si RNA和IL-12p40si RNAcDNA的重组腺病毒载体,其所携带的载体能够转染小鼠DC并干扰其在DC中表达,为进一步的研究奠定了基础。