人脂肪来源间充质干细胞成骨及成软骨的潜能

背景：人脂肪来源间充质干细胞是种具有较强的体外增殖和多系分化能力的成体干细胞,可以从美容吸脂手术中获得,取材方便,原料来源丰富,在生物治疗应用方面蕴藏着巨大的价值。 目的：体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,探讨其基本生物学特性及成骨成软骨的潜能。 方法：取美容吸脂获得的脂肪组织,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养;观察细胞形态、测定细胞周期、流式细胞仪鉴定细胞表面标志;取第3代细胞,分别加入成骨诱导培养基及成软骨诱导培养基行体外成骨及成软骨诱导。 结果与结论：体外培养人脂肪来源间充质干细胞呈纤维样形态,原代细胞24 h内贴壁,培养5~7 d 后开始形成细胞集落;经细胞周期检测显示G₀/G₁,S和G₂/M所占比例分别为(88±2)%,(12±2)%和0.03%。经流式细胞仪检测CD29和CD105呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达。RT-PCR检测显示,人脂肪间充质干细胞经成骨诱导分化后细胞中骨桥蛋白mRNA呈阳性表达,经软骨诱导分化后细胞中Ⅱ型胶原mRNA呈阳性表达。结果证实,实验成功体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,其具有向成骨细胞和软骨细胞分化的潜能。     

小鼠胎肝间充质干细胞的分离及鉴定

目的 分离培养小鼠胎肝间充质干细胞（flMSCs）。方法 改良贴壁法分离BABL/c胎鼠肝脏间充质干细胞，测定生长曲线检测增殖能力；流式细胞术分析细胞周期和表型；体外诱导贴壁细胞向脂肪、软骨、骨组织分化并鉴定。结果 贴壁法分离的flMSCs呈均一梭形，细胞倍增时间约为24 h。83.76%±2.88% 的flMSCs处于G0/G1期，表达间质系列表面标志CD44, CD29, 不表达造血细胞表面标志CD45, CD11b; 诱导后能向脂肪、软骨、骨组织方向分化。结论 贴壁法可以分离flMSCs, 传代有助其纯化；flMSCs具有强增殖能力和分化潜能，是理想的干细胞治疗来源。     

脐血间充质干细胞的分离鉴定及其向脂肪和成骨的分化

目的分离鉴定脐血(UCB)中的间充质样干细胞(MLSC),探索其向脂肪和成骨分化的可行性。方法用羟乙基淀粉沉淀法分离脐血有核细胞,利用细胞贴壁生长特性分离纯化脐血间充质样干细胞;流式细胞仪检测其表面标志;多种成分联合诱导其向脂肪、成骨方向分化,细胞化学染色检测诱导后的细胞变化。结果培养得到一组间充质样干细胞,不表达造血细胞的标志(CD34/CD45/CD14)及内皮细胞的标志CD106,强表达间充质细胞的标志CD29、CD44和CD13,在适当的诱导条件下可向脂肪及成骨方向分化。结论脐血中含有间充质样干细胞,表达间充质干细胞的表面标记,并可以向脂肪、成骨方向分化,因此可以作为组织工程的种子细胞。     

人羊水来源干细胞生物学性状的研究

目的对人羊水标本进行体外分离培养,建立人羊水来源干细胞的体外培养体系,对其生物学形状进行研究。方法贴壁法体外分离获得人羊水来源干细胞,多次传代扩增后,采用流式细胞仪和RT-PCR技术检测细胞表面抗原的表达。结果羊水干细胞原代生长较慢,传代后生长迅速,体外倍增时间约36h,流式细胞仪检测证实细胞表达CD29、CD44、CD105等间充质干细胞标志,不表达造血干细胞标志CD45和CD133。RT-PCR检测显示羊水干细胞表达Oct-4、Nanog基因。结论实验成功分离获得羊水中具有干细胞性质的细胞群,采用贴壁法分离获得的干细胞体外增殖能力强,表达间充质干细胞表面标志,符合间充质干细胞的特点。     

全骨髓直接贴壁分离人骨髓间充质干细胞的生物学特性****☆

背景：体外分离培养骨髓间充质干细胞成为实验研究和临床应用的关键环节。 目的：采用全骨髓培养法分离人骨髓间充质干细胞,建立一种简单、有效的分离培养骨髓间充质干细胞的方法。 方法：通过全骨髓培养法分离培养人骨髓间充质干细胞,并通过传代进行纯化和扩增培养。分别在特定诱导体系中诱导人骨髓间充质干细胞向脂肪、成骨及软骨细胞分化。 结果与结论：采用全骨髓培养分离法能获得90%以上纯度的骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD73、CD90、CD105,不表达造血细胞表型CD34、CD45和HLA-DR;细胞倍增时间为(24.04±0.49) h;细胞周期分析表明：G0~G1期和S+G2+M期所占比例分别为71.63%和28.37%;诱导分化结果显示,人骨髓间充质干细胞能够向脂肪、骨和软骨细胞分化。说明全骨髓分离培养法是一种较好的分离人骨髓间充质干细胞的方法。     

体外培养兔脂肪源性间充质干细胞的成骨成脂分化

背景:脂肪源性间充质干细胞具有自我更新能力且在体外特定条件下具有多向分化潜能,在临床上具有广泛的应用前景。然而,脂肪源性间充质干细胞的分离培养仍存在诸多困难与不足。目的:体外分离培养获得兔脂肪源性间充质干细胞,对其形态学、生物学特性进行观察,并鉴定其向成骨、成脂分化的潜能。方法:切取兔颈背区皮下脂肪,用胶原酶消化法分离兔脂肪源性间充质干细胞,进行体外培养,流式细胞仪检测细胞表面标志物,CCK-8法检测细胞活性并绘制细胞生长曲线。第4代兔脂肪源性间充质干细胞向成脂、成骨诱导分化后进行油红O染色、茜素红染色、碱性磷酸酶染色,观察其成脂、成骨分化潜能。结果与结论:兔脂肪源性间充质干细胞呈长梭形漩涡样贴壁生长,能稳定传代至第10代,增殖能力强;流式细胞仪检测可高表达CD29、CD90及CD44,而CD34和CD45表达较低;成脂诱导后的兔脂肪源性间充质干细胞油红O染色呈阳性;成骨诱导后的兔脂肪源性间充质干细胞碱性磷酸酶和茜素红染色均呈阳性,以上结果显示实验成功分离培养出兔脂肪源性间充质干细胞,获得的细胞生长稳定,增殖活跃,高表达间充质干细胞的表面抗原以及具有向成骨、成脂等多向分化的潜能,有望为骨组织工程提供理想的种子细胞。     

人脂肪间充质干细胞的分离培养及其鉴定

背景:人脂肪间充质干细胞在不同的条件下被成功诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、肝脏细胞等中胚层细胞,同时也可以向其他胚层分化,证明脂肪间充质干细胞是多分化潜能干细胞。目的:探讨人脂肪间充质干细胞的分离、鉴定方法。方法:整形外科吸脂术获得腹部皮下脂肪,0.075%Ⅰ型胶原酶消化,贴壁培养获得人脂肪间充质干细胞,绘制细胞增殖曲线,进行流式细胞、细胞周期、免疫荧光等检测,并验证其是否具有多功能分化潜能。结果与结论:获得形态较均一的长梭形的人脂肪间充质干细胞,细胞增殖良好,有明显的指数生长期,体外能长期培养存活,并保持不分化状态;流式检测细胞高表达CD105、CD90,低表达CD34、CD45;多数细胞周期检测G0/G1期占80%以上。能向成脂、成骨诱导分化。结果表明,实验分离获得的细胞是具有脂肪间充质干细胞特性的细胞,为深入研究人脂肪间充质干细胞打下基础。     

成人脂肪间充质干细胞的定向成骨诱导

背景：脂肪分离可获得大量的间充质干细胞并成功向骨、软骨、脂肪、心肌等多个方向诱导分化。 目的：建立成人脂肪间充质干细胞体外分离培养、成骨分化方法,并探讨脂肪间充质干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景。 方法：通过胶原酶消化法从成人脂肪中分离间充质干细胞,进行体外培养,流式细胞仪检测细胞表面标记物,CCK8检测细胞活性,成骨诱导液诱导干细胞向骨细胞分化,BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶,茜素红染色检测钙结节形成,RT-PCR检测碱性磷酸酶,骨桥蛋白表达变化。 结果与结论：利用脂肪抽吸液成功培养出脂肪间充质干细胞,且能稳定传代,增殖能力旺盛;流式细胞仪检测证实有特定的间充质干细胞表面标记物表达;成骨诱导脂肪间充质干细胞后呈典型的成骨细胞形态;碱性磷酸酶染色阳性,茜素红染色后可见钙结节形成,成骨诱导培养0,3,7,14,21,28 d,RT-PCR定量检测结果证实碱性磷酸酶、骨桥蛋白阳性表达。说明用酶消化法可以从人脂肪中分离得到脂肪间充质干细胞;脂肪间充质干细胞可向骨细胞诱导分化,阳性表达骨桥蛋白,碱性磷酸酶,是一种优良的骨组织工程的种子细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞

背景:研究显示兔脂肪干细胞的体外分离方法大多数为Ⅰ型胶原酶消化法,采用组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞尚不多见。目的:采用组织块贴壁法从兔脂肪组织中分离培养兔脂肪干细胞,并进行成脂、成骨的诱导分化。方法:采用组织块贴壁法分离出兔脂肪干细胞,进行体外培养,观察其形态特征。取对数生长期的第3代细胞,用MTT法绘制其生长曲线;流式细胞仪检测其表面抗原CD29、CD44、CD45的表达情况;分别用成脂和成骨诱导培养液诱导其向脂肪细胞和成骨细胞分化,油红O、茜素红染色定性鉴定。结果与结论:体外培养的兔脂肪干细胞呈梭形纤维样细胞形态,生长力旺盛。流式细胞术分析结果显示,第3代兔脂肪间充质干细胞强表达CD29,CD44,阴性表达CD45。兔脂肪干细胞经成脂诱导14 d后,油红O染色阳性;成骨诱导培养14 d后,茜素红染色阳性。提示组织块贴壁法可以分离培养出兔脂肪干细胞。     

人脂肪源性干细胞多潜能分化特性

目的原代分离培养人脂肪干细胞(ADSCs),探讨细胞增殖及多向分化,间充质干细胞相关特性。方法取人吸脂术的脂肪组织通过酶消化法分离培养ADSCs,观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期和表面抗原的表达,用茜素红、甲苯胺蓝和油红O染色鉴定向骨、软骨及脂肪诱导分化。结果人ADSCs呈长梭形、旋涡状生长,传至第15代的ADSCs仍具较强的增殖能力,ADSCs具有干细胞特性,高表达标记CD90和CD44的间充质干细胞,不表达内皮细胞标记CD31,而CD49d低表达,CD106阴性。成骨诱导后可见钙结节形成并被茜素红染成紫红色,软骨诱导后分泌大量蛋白多糖,被甲苯胺蓝染成蓝色,成脂诱导后细胞内可见大量脂滴被油红O染色红色。结论人脂肪干细胞可分化成间充质干细胞,具有稳定增殖和成骨、成软骨和成脂等多向分化潜能。     

Immunomodulatory function of whole human umbilical cord derived mesenchymal stem cells

Bone marrow derived mesenchymal stem cells (MSCs) play a critical role in immune modulation. However, immunomodulatory function of whole human umbilical cord derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) remains unclear. In this study, UC-MSCs were separated from whole umbilical cord using a single enzyme digestion. UC-MSCs (CD73⁺, CD90⁺, CD105⁺, and CD34⁻, CD45⁻, HLA-DR⁻) were differentiated into adipocytes, osteocytes and chondrocytes in vitro under specific stimulatory environments. UC-MSCs suppressed umbilical cord blood lymphocyte proliferation stimulated by mitogen, and ELISA showed that the secretion of INF-γ was downregulated, and the secretion of IL-4 was upregulated, with CD8⁺ T cells markedly decreased and CD4⁺ T cells changed lightly. Moreover, the infusion of UC-MSCs in recipient mice transplanted with donor bone marrow cells ameliorated acute graft-versus host disease (aGVHD) and extended survival. In conclusion, UC-MSCs might negatively modulate immunoreactions, and have application potential in the treatment of aGVHD caused by allogeneic stem cells transplantation.     

Notch信号介导共培养脐带间充质干细胞和造血干细胞的相互作用

目的:探讨脐带间充质干细胞(UC-MSC)体外与造血干细胞共培养后Notch信号分子的改变。方法:通过胶原酶消化方法分离UC-MSC,通过流式细胞仪检测以及成脂、成骨和成软骨诱导鉴定UC-MSC具备间充质干细胞的特性。进而,将UC-MSC与脐血CD34+造血干细胞(HSC)体外培养,实时PCR方法检测MSC及CD34+细胞表面Notch配体及受体表达以及表达是否存在变化;在共培养体系中加入Notch信号阻滞剂DAPT(γ-secretase抑制剂),比较Hes-1基因活化状态的改变。结果:体外实验显示:UC-MSC在形态学、细胞表面表型和诱导分化能力上均具备间充质干细胞的特性。UC-MSC及CD34+细胞表面存在Notch信号配体及受体的表达,共培养后Jagged 1、Notch1基因表达明显增加;共培养后CD34+细胞中的Hes-1基因表达明显增加而加入DAPT后Hes-1基因表达未检出明显改变。结论:UC-MSC支持造血中,Notch信号可能发挥重要作用。     

两种培养体系条件下人脐带间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：无支架体外诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法主要包括高密度微团培养、单层细胞培养、与软骨细胞体外共培养等,其中高密度微团培养和体外单层细胞培养因操作简便易行,诱导成功率高受到广泛关注。 目的：寻求一种更佳的无支架体外诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法。 方法：组织块法分离人脐带间充质干细胞,流式细胞仪鉴定其表面标志。收集第3代人脐带间充质干细胞分别采用平面诱导培养和离心管聚集成团培养,使其向软骨细胞分化。 结果与结论：人脐带间充质干细胞的细胞表型CD105⁺/CD29⁺/CD44⁺/CD31^-/CD34^-/CD40^-CD45^-/HLA^-DR^-。未诱导的人脐带间充质干细胞表达微弱的软骨细胞标志物,经诱导后葡萄糖胺聚糖和Ⅱ型胶原表达量显著增加,其中聚集成团培养的表达量高于平面培养。实时定量PCR结果显示,诱导后细胞较诱导前均高表达葡萄糖胺聚糖、Ⅱ型胶原和SOX-9 mRNA,其中聚集成团培养的表达量高于平面培养。说明人脐带间充质干细胞在聚集成团培养体系中诱导更有利于其分化成软骨细胞。     

人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的 探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)在体外向心肌细胞分化的能力及移植后对急性心肌梗死大鼠心功能恢复的影响.方法 胶原酶胰酶消化法分离脐带MSCs.取第4-6代脐带干细胞,采用5-氮胞苷诱导,免疫组织化学和免疫荧光法对诱导后细胞进行鉴定.建立大鼠心肌梗死模型,并按完全随机法将其分为2组(n=10):细胞移植组和空白对照组.将培养脐带MSCs移植到大鼠梗死心肌周围,4周后,免疫荧光法鉴定移植细胞,并超声检测心功能改变.结果 体外诱导后,细胞的形态不断发生变化,诱导后的细胞表达心肌特异性α-肌动蛋白、肌球蛋白和肌钙蛋白T,阳性率在50%以上.细胞移植4周后,脐带MSCs在缺血心肌内存活并分化为心肌样细胞,心功能检测显示脐带MSCs移植组大鼠在移植后4周的左心室射血分数[(68.4±15.2)%]比对照组大鼠明显增加[(53.2±13.4)%,P＜0.05].结论 人脐带MSCs能够在体内外分化为心肌样细胞,并能促进心脏功能的恢复.     

Very small embryonic-like stem cells with maximum regenerative potential get discarded during cord blood banking and bone marrow processing for autologous stem cell therapy

Very small embryonic-like stem cells (VSELs) are possibly lost during cord blood banking and bone marrow (BM) processing for autologus stem cell therapy mainly because of their small size. The present study was conducted on human umbilical cord blood (UCB, n=6) and discarded red blood cells (RBC) fraction obtained after separation of mononuclear cells from human BM (n=6), to test this hypothesis. The results show that VSELs, which are pluripotent stem cells with maximum regenerative potential, settle along with the RBCs during Ficoll-Hypaque density separation. These cells are very small in size (3-5 μm), have high nucleo-cytoplasmic ratio, and express nuclear Oct-4, cell surface protein SSEA-4, and other pluripotent markers such as Nanog, Sox-2, Rex-1, and Tert as indicated by immunolocalization and quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR) studies. Interestingly, a distinct population of slightly larger, round hematopoietic stem cells (HSCs) with cytoplasmic Oct-4 were detected in the "buffy" coat, which usually gets banked or used during autologus stem cell therapy. Immunohistochemical studies on the umbilical cord tissue (UCT) sections (n=3) showed the presence of nuclear Oct-4-positive VSELs and many fibroblast-like mesenchymal stem cells (MSCs) with cytoplasmic Oct-4. These VSELs with nuclear Oct-4, detected in UCB, UCT, and discarded RBC fraction obtained after BM processing, may persist throughout life, maintain tissue homeostasis, and undergo asymmetric cell division to self-renew as well as produce larger progenitor stem cells, viz. HSCs or MSCs, which follow differentiation trajectories depending on the somatic niche. Hence, it can be concluded that the true stem cells in adult body tissues are the VSELs, whereas the HSCs and MSCs are actually progenitor stem cells that arise by asymmetric cell division of VSELs. The results of the present study may help explain low efficacy reported during adult autologous stem cell trials, wherein unknowingly progenitor stem cells are injected rather than the pluripotent stem cells with maximum regenerative potential.     

绿色荧光蛋白转基因小鼠不同源性间充质干细胞原代培养及生物学特性比较

 目的： 探讨绿色荧光蛋白转基因小鼠脐带和骨髓源性间充质干细胞 （MSCs）的体外分离培养方法、生物学特性、表面标志及多向分化潜能。方法：应用Ⅱ型胶原酶消化培养法分离脐带MSCs及密度梯度离心法分离骨髓MSCs进行体外培养。在倒置显微镜下观察2种细胞的生长特点,运用生长曲线和MTT法检测其原代细胞增殖能力,台盼蓝法测定细胞传代成活率,采用流式细胞术测定2种第3代（P3）细胞DNA周期及表面标志物的表达,并比较其向成脂细胞和成骨细胞的分化潜能。结果：酶消化法分离培养的脐带MSCs 1 d后,细胞贴壁呈成纤维形,2 d后呈漩涡状生长且增殖明显,3 d后达80%融合即可传代;应用密度梯度离心法分离骨髓MSCs,体外培养4 d后,细胞贴壁呈圆形、梭形和多角形生长,5 d后呈克隆样生长且增殖明显,7 d后达80%融合即可传代。原代培养的脐带MSCs生长曲线近似“S”形,骨髓MSCs 生长曲线较平缓;MTT法显示脐带MSCs在3～5 d增殖较明显,骨髓MSCs 7 d后细胞增殖较明显。2种P3细胞传代成活率均为96%以上,G0/G1期细胞均为85%以上,无明显差异（P>0.05）;2种P3细胞CD44、CD90和CD105阳性率均为(60.7±2.3)%以上高表达,CD45、CD19、CD14和CD79a均为(25.6±4.8)%低表达,两者无明显差异（P>0.05）;2种MSCs在体外均具有向成骨细胞和成脂细胞分化的潜能,脐带MSCs向成骨及成脂细胞分化率均为90%以上,与骨髓MSCs的分化潜能比较有显著差异（P<0.05）。结论：脐带MSCs较骨髓MSCs具有较强的增殖能力及分化潜能。绿色荧光蛋白转基因小鼠的脐带MSCs可作为较好干细胞示踪的细胞源。