汉族散发法洛四联症患儿GATA6、TBX20基因的表达研究

目的:通过研究中国汉族法洛四联症(tetralogy of Fallot,TOF)患儿心肌中GATA6、TBX20基因的表达变化,初步探讨GATA6、TBX20基因与汉族TOF分子发病机制之间的关系。方法:实验组选取中国汉族TOF患儿15例,年龄6.5个月～8岁,平均1.9岁,术中常规切除并留取右心室流出道肥厚心肌;对照组选取汉族室间隔缺损患儿15例,年龄4.5个月～5岁,平均2.2岁。术中留取患儿右心房壁少量心肌组织。提取心肌组织RNA,应用实时荧光聚合酶链反应检测两组心肌中的GATA6、TBX20基因mRNA表达;应用免疫组化染色技术,检测两组心肌中的GATA6、TBX20蛋白的表达并进行统计学比较分析。结果:TOF患者心肌中GATA6、TBX20基因mRNA和蛋白表达水平均较对照组显著降低,差异有统计学意义;同时,TOF患儿心肌TBX20mRNA水平与患儿肺动脉指数呈正相关(r=0.6782,P<0.05)。结论:人类心肌中存在GATA6、TBX20mRNA和蛋白的表达;在中国汉族人群中,TOF的发生可能与心肌组织中GATA6、TBX20基因表达下调有关。     

姜黄素通过抑制p300/CBP下调酒精诱导的胎鼠心脏GATA4及NKX2.5过表达

目的:探讨p300/CBP是否参与介导了孕期酒精暴露所致的心脏核心转录因子GATA4和NKX2.5的过表达,为防治酒精所致的先天性心脏病提供新的切入点。方法:选取C57BL/6小鼠作为研究对象,随机分为对照组、酒精组、DMSO+酒精组和姜黄素+酒精组。收集胚胎16.5d胎鼠心脏,采用染色质免疫共沉淀技术和Western blot检测小鼠心脏组织中GATA4、NKX2.5启动子区域p300/CBP的结合量及组蛋白ac-H3的乙酰化水平。运用RT-PCR检测GATA4、NKX2.5基因mRNA表达量。结果:ChIP-RT-PCR结果显示,酒精能够显著提高GATA4、NKX2.5启动子区域p300/CBP的结合量及组蛋白ac-H3的乙酰化水平(均P0.01)。Western blot结果表明,酒精能够显著提高胎鼠心肌组蛋白ac-H3表达水平(P0.01)。RT-PCR结果显示,酒精能够显著上调GATA4、NKX2.5基因mRNA表达量(均P0.01)。姜黄素(p300/CBP抑制剂)能够显著降低GATA4和NKX2.5基因启动子区域p300/CBP的结合量,纠正酒精所致的组蛋白ac-H3的高乙酰化,并下调GATA4和NKX2.5基因mRNA过表达(均P0.05)。结论:p300/CBP介导的组蛋白ac-H3高乙酰化可能是孕期酒精暴露致GATA4、NKX2.5基因过表达的关键调控因素。姜黄素通过抑制p300/CBP在启动子区域的结合能显著降低酒精所致的组蛋白H3高乙酰化,下调GATA4、NKX2.5基因过表达,可能成为防治孕期酒精暴露致子代心脏发育畸形的干预新靶点。     

儿童先天性心脏病TBX20基因突变及功能探讨

目的：对先天性心脏病（先心病）患儿进行TBX20基因突变研究,探讨TBX20基因与先心病发生机制之间的关系。方法：对203例中国汉族先心病患儿（病例组）进行TBX20基因编码区测序,同期300例门诊体检健康儿童为对照组,检测可能的先心病相关性基因突变。对新发现的突变应用蛋白质结构预测服务器I-TASSER进行同源建模,对TBX20基因野生型及突变后的蛋白质结构模型进行预测分析。并进一步构建TBX20野生型及突变型表达载体,分别转染到COS7细胞中,通过双荧光素酶报告基因检测它们在NKX2.5、GATA4协同作用下对下游靶基因心钠素（ANF）启动子转录激活作用的影响。结果：（1）病例组1例房间隔缺损患儿发现一个新的TBX20基因错义突变c.187G>A(A63T),DNA序列中第187位鸟嘌呤突变为腺嘌呤,导致氨基酸序列中第63位丙氨酸变为苏氨酸,在对照组中均未发现该变异。（2）对错义突变A63T进一步研究中,TBX20同源建模显示第63位的非极性、疏水性丙氨酸变为极性、亲水性的苏氨酸,与Gly65、Gly68间的氢键断裂,与Asp62、His64形成新的氢键,导致蛋白质构象发生变...     

CRELD1基因在汉族完全型房室间隔缺损患儿心肌组织表达情况的初步分析

目的探讨CRELD1基因在完全型房室间隔缺损（CAVSD）患儿心肌组织中的表达情况。方法实验组选取CAVSD患儿5例,平均年龄1．2岁;对照组选取室间隔缺损（VSD）患儿5例,平均年龄1．9岁。患儿手术过程中剪取右心房适量心肌组织,应用基因芯片技术对两组标本CRELD1基因表达进行检测,比较两者差异。结果CRELD1基因在两组病例的表达差异无统计学意义。结论CRELD1基因在CAVSD与VSD患儿心肌组织中表达情况近似,提示CRELD1基因可能与多种先心病相关,或者CAVSD可能是一种多基因的遗传性疾病。     

心肌营养素-1对三个主要心肌转录因子转录表达的选择性的研究

目的研究心肌营养素-1（cardiotrophin-1,CT-1）对三大主要心肌转录因子的选择性作用,在转录因子水平探讨CT-1肥大刺激作用的特殊机制。方法应用半定量RT-PCR及免疫组化技术,鉴定CT-1对心肌细胞形态学影响。测定CT-1对大鼠心肌细胞GATA4、MEF2以及NKX2-5基因转录的时间、剂量依赖影响。结果GATA4与NKX2-5的表达均与CT-1具有时间、剂量依赖关系,而CT-1则未对MEF2的表达产生影响。从作用时间上看,NKX2-5的表达在1×10-10mol/L的CT-1刺激1h时即开始明显增加,而GATA4的表达则在3h时显著性增加,NKX2-5的表达增强的时间较GATA4略早。结论CT-1以时间和剂量依赖性的方式上调大鼠心肌细胞GATA4及NKX2-5mRNA表达,对大鼠心肌细胞MEF2mRNA表达没有明显影响。     

常见左向右分流型先天性心脏病分子遗传学研究

房间隔缺损(ASD)、室间隔缺损(VSD)、动脉导管未闭(PDA)、房室隔缺损(AVSD)是常见左向右分流型先天性心脏病,分子生物学及分子遗传学研究表明,相关基因改变可能是导致此类先心病发病的原因之一。Nkx2.5、TBX5、GATA4、TFAP2B、CRELD1作为转录因子及功能基因,可通过复杂的调控机制直接、间接地参与心脏的正常发育。近年来诸多研究表明,上述相关基因突变,可能与ASD、VSD、PDA、AVSD的发生相关。     

诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的 观察乳鼠心肌细胞条件培养液、SalB 、5-氮胞苷(5-aza)及SalB联合5-aza体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制.方法 分离培养及鉴定大鼠MSCs,培养乳鼠心肌细胞,收集条件培养液对其进行分组诱导:①SalB(终浓度为250 μg/L),②5-aza组(终浓度为10 μg/L),③SalB联合5-aza组(终浓度分别为250 μg/L与10 μmol/L),④乳鼠心肌细胞条件培养液,⑤未加诱导剂的阴性对照组.选取MSCs进行诱导,诱导周期为4 w.倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化,免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)表达,实时荧光定量RT-PCR法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4 mRNA的相对表达量.结果 细胞形态学显示,诱导后的MSCs体积增大,增殖减慢,并出现肌管样结构;免疫细胞化学结果显示,诱导后的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT,与5-aza组相比,SalB组和条件培养液两组蛋白表达较低,SalB联合5-aza组蛋白表达升高;实时荧光定量RT-PCR结果显示除阴性对照组外,其他四组表达心肌分化早期基因,SalB联合5-aza组诱导后的MSCs的心肌早期分化基因表达明显高于其他三组.结论 SalB联合5-aza诱导MSCs表达心肌特异性肌钙蛋白cTnT;上调心肌早期基因NKX2.5、GATA-4mRNA的表达,证实其能够向心肌细胞分化能力;条件培养液不能上调心肌细胞的早期基因和蛋白,不能诱导其分化.     

TBX5基因rs3825214位点多态性和心房颤动的相关性

目的探讨TBX5基因多态性与心房颤动的相关性。方法房颤患者100例(房颤组)和非房颤患者(对照组)107例进行TBX5基因rs3825214单核苷酸多态性和房颤的关联研究。所有患者均采集外周血提取基因组DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检查患者TBX5基因rs3825214多态性的基因型和等位基因分布。结果 TBX5基因rs3825214位点在入选人群中存在多态性,分别为GG、AG和AA型,其基因型频率在房颤组和对照组分别依次为28.0%,60.0%,12.0%和15.9%,50.5%,33.6%。GG基因型在房颤组的频率分布显著高于对照组(P=0.035),AA基因型在房颤组的频率分布明显低于对照组(P<0.001)。G和A等位基因频率在房颤组和对照组分别为56.0%,44.0%和41.1%,48.9%,G和A等位基因频率在两组间的差异有统计学意义(P=0.001)。结论 TBX5基因rs3825214位点多态性与房颤的发生有相关性,G等位基因可能是房颤的易感基因,GG基因型可能增加了房颤发生的危险性。     

妊娠合并心脏病患者MMP-1、GATA6、PTX3水平与不良妊娠结局的关系研究

目的探讨妊娠合并心脏病患者基质金属蛋白酶-1 (MMP-1)、GATA结合蛋白6 (GATA6)、正五聚蛋白3(PTX3)与不良妊娠结局的关系。方法选取2019年1月至2021年1月温州市中西医结合医院收治的妊娠合并心脏病患者42例,根据是否发生不良妊娠结局分为观察组(20例)和对照组(22例),比较两组的妊娠风险及MMP-1、GATA6 m RNA和PTX3水平,分析MMP-1、GATA6 mRNA和PTX3与妊娠风险分级关系及预测不良妊娠结局的价值。结果观察组妊娠风险分级与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组MMP-1、PTX3高于对照组,GATA6 m RNA低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);MMP-1和PTX3与妊娠风险分级呈正相关(r=0.598、0.829,均P<0.05),GATA6 mRNA与妊娠风险分级呈负相关(r=-0.690,P<0.05)。多因素logistic回归分析显示MMP-1、GATA6 m RNA和PTX3是不良妊娠结局的相关影响因素(均P<0.01);联合MMP-1、GATA6 mRNA和...     

心房颤动患者射频消融术影响TBX5和NKx2.5及其调控微小RNA

目的探讨心房颤动(房颤)患者射频消融术对转录因子TBX5和NKx2.5及其调控微小RNA(miRNA)的影响作用,寻找可能的miRNA调控干预靶点。方法选择行房颤射频消融术患者30例(房颤组),其中阵发性、持续性和永久性房颤各10例,健康体检者10例(对照组)。射频消融术前和术后3个月分别取外周血,使用miRNA芯片进行全基因组miRNA表达谱微阵列分析,实时PCR对调控结构蛋白的主要miRNA表达差异结果进行验证,通过mirbase、miranda、targetscan数据库进行靶基因分析。结果与对照组比较,房颤组术前转录因子TBX5和NKx2.5mRNA表达明显异常;主要参与调控TBX5的miRNA共有hsa-miR-892a等8种,hsa-miR-186-5p等4种主要miRNA术前表达下调,术后显著上调(P<0.05)。与对照组比较,房颤组参与调控NKx2.5的miRNA有hsa-miR-3149等3种,手术前后均有显著性改变(P<0.05)。结论房颤射频消融术逆转了调控转录因子TBX5、NKx2.5的主要miRNA异常,为房颤射频消融术后窦性心律的恢复和维持奠定了基础。这些miRNA有可能成为未来房颤干预的靶点。     

单纯性法洛四联症TBX1基因的表达研究

目的分析TBX1基因与单纯性法洛四联症的相关性。方法应用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳方法对2005年3月至2009年5月沈阳军区总医院收治的100例法洛四联症患者TBX1基因突变情况进行分析;以β-actin为内对照,半定量RT-PCR分析32例法洛四联症患者TBX1基因表达情况。结果所有患者TBX1基因9个外显子未发现致病突变,TBX1基因mRNA表达水平明显低于正常对照(P<0.001)。结论 TBX1基因编码区的突变可能不是单纯性法洛四联症的致病原因而该基因转录水平的异常可能是参与其发生的一种潜在机制。     

Wnt-3a对Connexin43及相关基因的表达调控

目的 探讨信号分子Wnt3a蛋白对缝隙连接蛋白43(connexin43)的表达调控作用,以期揭示Wnt3a与connexin43在心脏发育过程中的特定联系与作用.方法 以本室自行构建pCD-NA3.1/wnt-3a真核表达载体转染大鼠心肌细胞系H9c2,在细胞水平通过RT-PCR及Western-blot实验方法研究Wnt-3a对其中Cx43表达及心脏发育相关基因的影响.结果 经转染wnt-3a后,H9c2细胞系中connexin43的表达明显上调,同时与心脏发育相关的GATA4,Nkx2.5基因表达也明显上调.结论 Wnt3a信号通路对connexin43表达存在影响;并可能对心脏发育存在调控作用.