脂氧素A4对脂多糖活化小鼠巨噬细胞NF-κB和TNF-α转化酶的影响

目的 研究脂氧素A4（LXA4）对脂多糖（LPS）活化的小鼠巨噬细胞NF-κB及TNF-α转化酶的影响。方法 小鼠RAW 264．7巨噬细胞株培养于细胞培养板,随机分为空白对照组、LPS处理组（LPS 1μg/ml）和LPS＋LXA4组（LPS 1μg/ml＋LXA4 10^-7mol/L）。酶联免疫吸附法测定上清液TNF-α水平,提取细胞总蛋白,Western blot法测定NF-κB p65、IκB-α及TNF-α转化酶含量,荧光素酶报告质粒测定NF-κB活性。结果 LXA4抑制LPS活化的RAW 264．7巨噬细胞IκB-α降解、NF-κB p65核转位及NF-κB活性,同时抑制TNF-α蛋白表达和上调TNF-α转化酶蛋白表达。结论 LXA4通过抑制NF-κB活性和下调TNF-α转化酶表达而减少LPS活化的RAW264．7巨噬细胞分泌TNF-α。     

氯胺酮对脂多糖诱导人单核细胞NF-κB表达和肿瘤坏死因子-α释放的影响

目的研究氯胺酮(KT)对脂多糖(LPS)诱导的人单核细胞核因子κB(NF-κB)表达和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)释放的影响,探讨氯胺酮抗炎效应的机制。方法将采集分离的健康志愿者外周血单核细胞接种于培养板,按培养液不同分为四组,每组20孔。LPS组:加入1 mg·L-1 LPS 1 ml;对照组:加入等体积生理盐水;LPS KT 20mg·L-1组:加入20mg·L-1 KT 1 ml后加入LPS 1 ml;LPS KT 100 mg·L-1组:加入100 mg·L-1 KT 1 ml后加入LPS 1 ml。按孵育时间不同分成5个亚组,每组4孔,分别于孵育0．5、2、6、12和16 h取细胞及细胞培养上清液,应用免疫细胞化学染色法检测细胞NF-κB p65 表达,计算阳性率,酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中TNF-α浓度。结果与对照组比较,LPS、 LPS KT 20 mg·L-1、LPS KT 100 mg·L-1组NF-κB p65阳性率孵育0．5 h增加,2 h时达高峰。TNF-α浓度在孵育2 h时开始升高,6 h时达高峰。与LPS组比较,LPS KT 20 mg·L-1组NF-κB p65阳性率在孵育0．5、2 h时,TNF-α浓度在2、6 h时降低,LPS KT 100 mg·L-1组NF-κB p65阳性率在0．5、2、6 h时, TNF-α浓度在2、6、12、16 h时降低。与LPS KT 20 mg·L-1组比较,LPS KT 100 mg·L-1组NF-κB p65阳性率在孵育2、6 h时,TNF-α浓度在6、12、16 h时降低(P<0．05或0．01)。结论 KT抑制LPS诱导人单核细胞NF-κB的表达和TNF-α的释放,其作用可能与剂量有关。     

镧对内毒素/脂多糖诱导的巨噬细胞核因子KB活化的抑制作用

目的了解稀土元素镧对内毒素/脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ)核因子κB(NF-κB)活化的影响,并探讨其机制。方法分离培养小鼠腹腔 Mφ,分为:空白对照组,无刺激因素;LPS 组,用1μg/ml LPS 刺激30 min;镧离子(La~(3 ))组,用2.5 μmol/L La~(3 )刺激30 min;La~(3 ) LPS 组,先后用2.5μmol/L La~(3 )、1μg/mI LPS 各刺激30 min;La~(3 )/LPS 组,2.5μmol/L La~(3 )刺激30 min 后,洗涤细胞,再加入1μg/ml LPS 刺激30 min。采用细胞免疫荧光染色法观察 NF-κB在各组细胞中的分布与表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)法捡测胞核中 NF-κB/p65蛋白活性;蛋白质印迹法检测细胞核内 NF-κB/p65蛋白及胞质中核因子抑制蛋白α(IκBα)的表达量。ELISA 法测定各组细胞培养上清液中肿瘤坏死冈子α(TNF-α)的含量。结果 (1)免疫荧光染色显示,空白对照组、La~(3 )组、La~(3 ) LPS 组和 La~(3 )/LPS 组 Mφ绿色荧光多分布于胞质,胞核荧光强度分别为42±7、73±30、48±11和67±19;LPS 组绿色荧光集中于胞核,荧光强度为116±14,明显高于其余4组(P<0.01)。(2)胞核 NF-κB/p65蛋白活性:LPS 组吸光度值为0.435±0.066.与空白对照组(0.048±0.027)、La~(3 )组(0.062±0.049)、La~(3 ) LPS 组(0.066±0.031)、La~(3 )/LPS 组(0.108±0.017)比较,明显偏高(P<0.01)。(3)LPS 组 Mφ胞核 NF-κB/p65蛋白表达水平明显高于其余4组,胞质 IκBα蛋白表达水平明显低于其余4组。(4)TNF-α含量:La~(3 )组培养上清液中 TNF-α含量低于试剂盒检测下限(25 pg/ml)及空白对照组(P<0.05),La~(3 ) LPS 组和 La~(3 )/LPS 组低于 LPS 组(P<0.01),但高于空白对照组。结论 LPS 可激活小鼠腹腔 MφNF-κB/p65核移位,并使胞核中 NF-κB/p65的表达量和活性升高、胞质 IκBα蛋白表达下调,导致 TNF-α分泌增多。镧可抑制上述效应。     

利多卡因对LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞NF-κB活性的影响

目的 探讨利多卡因对LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞NF-κB活性的影响.方法 取wistar大鼠腹腔巨噬细胞,以2 × 106/ml的密度接种于12孔培养板,每孔1 ml.纯化处理后随机分为5组,每组10孔.正常对照组(C组)加入RPMI-1640培养液1 ml,L组加入含100 ng/ml LPS的RPMI1640培养液1 ml,LL1组、LL2组和LL3组分别加入含有2、20、200μg/ml利多卡因+100 ng/ml LPS的RPMI-1640培养液1 ml.孵育24 h后,收集上清液,测定高迁移率族蛋白B1(HMGB1)浓度;取细胞沉淀,测定HMGBl mRNA表达水平和NF-κB活性.结果 与C组比较,其他各组HMGB1浓度、HMGB1mRNA表达和NF-κB活性均升高(P＜0.05);与L组及LL1组比较,LL2组和LL3组上述指标降低(P＜0.05).LL3组HMGB1 mRNA表达水平低于LL2组(P＜0.05).结论 利多卡因可抑制LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞NF-κB活化,从而抑制HMGB1的合成与释放.     

核因子kB活化对烧伤血清诱导单核细胞细胞因子表达的影响

目的了解核因子(NF)κB活化对烧伤血清诱导单核细胞活化分泌细胞因子的作用,探讨烧伤血清激活单核细胞的机制。方法收集体外培养的人外周血单核细胞(PBMC),分别用正常人血清、烧伤患者血清、烧伤患者血清 吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)刺激后依次分为对照组、烧伤血清组、PDTC组。采用电泳迁移率分析法检测刺激前及刺激0.5、1.0、2.0、4.0h时PBMC的NF-κB活性;酶联免疫吸附测定法和原位杂交法检测刺激前及刺激1.0、2.0、4.0、6.0h时PBMC培养上清液中肿瘤坏死因子(TNF)α、白细胞介素(IL)8水平及TNF-αmRNA、IL-8mRNA的表达情况。结果血清刺激后,烧伤血清组PBMC NF-κB活性迅速升高,刺激1.0h时达峰值(30.2±3.5)×104积分灰度值,与对照组(4.4±0.8)×104积分灰度值比较差异有统计学意义(P<0.01).刺激2.0h后逐渐下降;而PDTC组NF-κB活性无明显升高,刺激1.0h时为(6.8±0.9)×104积分灰度值。烧伤血清组刺激PBMC1.0h时,TNF-αmRNA表达量和培养上清液中TNF-α水平即升高达峰值,并明显高于对照组(P<0·01);IL-8mRNA表达量和IL-8水平在刺激4.0h时达峰值,也明显高于对照组(P<0.01);而PDTC组PBMC培养上清液中TNF-α刺激1.0h时达峰值(0.52±0.06)μg/L;刺激4.0h时IL-8达峰值(239±20)ng/L,与对照组[(0.13±0.07)μg/L、<156ng/L]比较,差异有统计学意义(P<0·01).结论烧伤血清可通过活化NF-κB,启动PBMC对细胞因子的合成和释放,提示NF-κB活化在烧伤血清诱导PBMC分泌细胞因子的过程中起重要作用。     

核因子κB活化对烧伤血清诱导单核细胞细胞因子表达的影响

目的了解核因子(NF)κB活化对烧伤血清诱导单核细胞活化分泌细胞因子的作用,探讨烧伤血清激活单核细胞的机制。方法收集体外培养的人外周血单核细胞(PBMC),分别用正常人血清、烧伤患者血清、烧伤患者血清 吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)刺激后依次分为对照组、烧伤血清组、PDTC组。采用电泳迁移率分析法检测刺激前及刺激0.5、1.0、2.0、4.0h时PBMC的NF-κB活性;酶联免疫吸附测定法和原位杂交法检测刺激前及刺激1.0、2.0、4.0、6.0h时PBMC培养上清液中肿瘤坏死因子(TNF)α、白细胞介素(IL)8水平及TNF-αmRNA、IL-8mRNA的表达情况。结果血清刺激后,烧伤血清组PBMC NF-κB活性迅速升高,刺激1.0h时达峰值(30.2±3.5)×104积分灰度值,与对照组(4.4±0.8)×104积分灰度值比较差异有统计学意义(P<0.01).刺激2.0h后逐渐下降;而PDTC组NF-κB活性无明显升高,刺激1.0h时为(6.8±0.9)×104积分灰度值。烧伤血清组刺激PBMC1.0h时,TNF-αmRNA表达量和培养上清液中TNF-α水平即升高达峰值,并明显高于对照组(P<0·01);IL-8mRNA表达量和IL-8水平在刺激4.0h时达峰值,也明显高于对照组(P<0.01);而PDTC组PBMC培养上清液中TNF-α刺激1.0h时达峰值(0.52±0.06)μg/L;刺激4.0h时IL-8达峰值(239±20)ng/L,与对照组[(0.13±0.07)μg/L、<156ng/L]比较,差异有统计学意义(P<0·01).结论烧伤血清可通过活化NF-κB,启动PBMC对细胞因子的合成和释放,提示NF-κB活化在烧伤血清诱导PBMC分泌细胞因子的过程中起重要作用。     

转化生长因子β1对脂多糖刺激大鼠腹膜间皮细胞上调表达促炎症因子的影响

目的 观察转化生长因子β1（TGF-β1）对脂多糖(LPS)刺激大鼠腹膜间皮细胞上调表达促炎症因子的影响，并探讨其可能的机制。 方法 把原代培养的第2代大鼠腹膜间皮细胞（RPMCs）分成对照组、LPS刺激组（1 mg/L）、TGF-β1刺激组（5 μg/L）及LPS+TGF-β1刺激组。RT-PCR和ELISA方法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6） mRNA及蛋白的表达。蛋白印迹方法检测磷酸化核因子（p-NF）-κB/NF-κB值的变化。 结果 (1)LPS可刺激RPMCs上调TNF-α和IL-6表达。LPS刺激24 h后，p-NF-κB/NF-κB值升高。(2)TGF-β1可拮抗LPS刺激大鼠腹膜间皮细胞上调TNF-α和IL-6表达，同时，也降低p-NF-κB/NF-κB值。 结论 在体外培养的大鼠腹膜间皮细胞，TGF-β1可拮抗LPS的致炎作用，其作用机制可能是通过抑制NF-κB的活化而介导。     

镧对内毒素/脂多糖诱导的巨噬细胞核因子κB活化的抑制作用

目的 了解稀土元素镧对内毒素／脂多糖（LPS）诱导的小鼠腹腔巨噬细胞（Mφ）核因子KB（NF-κB）活化的影响,并探讨其机制。方法分离培养小鼠腹腔Mφ,分为：空白对照组,无刺激因素：LPS组,用1μg／mlLPS刺激30min;镧离子（La^3＋）组,用2,5μmol／L La^3＋刺激30min;La^3＋＋LPS组,先后用2,5-μmol／L La^3＋、1μg／ml LPS各刺激30min;La^3＋／L PS组,2．5μmol／L La^3＋刺激30min后,洗涤细胞,再加入1μg／ml LPS刺激30min。采用细胞免疫荧光染色法观察NF-κB在各组细胞中的分布与表达;酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测胞核中NF-κB／p65蛋白活性;蛋白质印迹法检测细胞核内NF-κB／p65蛋白及胞质中核因子抑制蛋白α（IκBα）的表达量。ELISA法测定各组细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。结果 （1）免疫荧光染色显示,空白对照组、La^3＋组、La^3＋＋LPS组和La^3＋／LPS组M小绿色荧光多分布于胞质,胞核荧光强度分别为42±7、73±30、48±11和67±19;LPS组绿色荧光集中于胞核,荧光强度为116±14,明显高于其余4组（P〈0.01）。（2）胞核NF-κB／p65蛋白活性：LPS组吸光度值为0．435±0．066,与空白对照组（0．048±0．027）、La^3＋组（0．062±0．049）、La^3＋＋LPS组（0.066±0.031）、La^3＋／LPS组（0．108±0.017）比较．明显偏高（P〈0．01）。（3）LPS组M由胞核NF-κB／p65蛋白表达水平明显高于其余4组,胞质IκBα蛋白表达水平明显低于其余4组。（4）TNF-α含量：La^3＋组培养上清液中TNF-α含量低于试剂盒检测下限（25pg／m1）及空白对照组（P〈0.05）,La^3＋＋LPS组和La^3＋／LPS组低于LPS组（P〈0．01）,但高于空白对照组。结论 LPS可激活小鼠腹腔M由NF-κB／p65核移位,并使胞核中NF-κB／p65的表达量和活性升高、胞质IκBα蛋白表达下调,导致TNF-α分泌增多。镧可抑制上述效应。     

锌指蛋白A20抑制脂多糖诱导大鼠腹膜间皮细胞NF-κB活化、CD40表达及TNF-α的分泌

目的：探讨锌指蛋白A20（zinc finger protein A20）对脂多糖（LPS）诱导的大鼠腹膜间皮细胞（RPMCs）炎症反应的影响.方法：分离及培养RPMCs,将细胞随机分成对照组、LPS组、转染A20组、空载体组.脂质体转染A20质粒（pGEM-T easy-A20）至RPMCs 24 h后分别在LPS刺激不同时间点收获细胞提取蛋白及细胞上清液.用Western blotting 检测细胞A20和IκBα（inhibitor of nuclear factor-κB-α）蛋白的表达;RT-PCR检测CD40和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA的表达;用ELISA法检测培养上清液TNF-α蛋白水平.结果：与LPS组及空载体组相比,转染A20组RPMCs IκBα蛋白无明显降解（P＆lt;0.05）;CD40、TNF-α mRNA表达及细胞培养上清液TNF-α蛋白水平均明显降低（P＆lt;0.05）;与对照组相比,差异无统计学意义（P＆gt;0.05）.结论：A20可抑制LPS诱导的RPMCs核转录因子-κB（NF-κB）活化及炎症反应.     

藁本内酯抑制星形胶质细胞中NF-κB依赖的细胞因子的表达

目的观察藁本内酯(LIG)对脂多糖(LPS)诱导的星形胶质细胞中促炎性细胞因子表达的抑制作用。方法将原代培养成功的星形胶质细胞随机分成四组,对照组(C组)、LPS组、LIG组、BAY组。C组未加入任何药物刺激细胞;LPS组加入浓度为1μg/ml的LPS刺激细胞6h;LIG组用浓度为50μM的LIG预孵育细胞30min后,再加入LPS刺激6h;BAY组用浓度为20μM的核转录因子(NF)-κB抑制剂BAY11-7082预孵育细胞30min后,再加入LPS刺激6h。采用Real-time PCR方法检测促炎性细胞因子白细胞介素(IL)-1β、肿瘤细胞坏死因子(TNF)-α、IL-6 mRNA的表达;采用Western blot方法检测pNF-κB p65的表达。结果与LPS组比较,C、LIG和BAY组IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA的表达明显减少(P0.05)。与LPS组比较,C、LIG组pNF-κB p65蛋白的表达明显降低(P0.05)。结论藁本内酯可通过抑制原代培养的星形胶质细胞中NF-κB的活化来抑制LPS诱导的促炎症相关的细胞因子的表达。     

核因子-κB圈套对Kupper细胞活化的抑制作用及其机制

目的探讨核因子-κB（NF-κB）圈套对大鼠Kupper细胞（KCs）活化的抑制作用及其机制。方法分离大鼠KCs并随机分为3组：正常对照组、内毒素（LPS）刺激组及NF-κB圈套组，后者KCs在LPS刺激前转染NF-κB圈套。除对照组外，两个实验组培养液中加入终浓度为1mg／L的LPS。于LPS刺激6h后，凝胶电迁移率改变分析法（EMSA）检测NF-κB蛋白结合活性，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测KCs膜表面CD80mRNA表达，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL）-6表达情况。结果转染NF-出圈套可以高效抑制KCs激活。EMSA结果显示NF-κB活性仅为LPS组的0．53，RT—PCR结果显示KCs CD80 mRNA表达仅为LPS组的0．46，ELISA结果显示培养上清TNF-α表达量仅为LPS组的0、37，IL-6仅为LPS组的0．60。结论NF-κB圈套可以高效抑制NF—κB的转录活性，降低KCs膜表面共刺激分子和细胞因子的产生，为活体内应用NF—κB圈套提供了可靠的实验依据。     

异丙酚对内毒素性急性肺损伤大鼠中性粒细胞NF-κB活化的影响

目的 探讨异丙酚对内毒素性急性肺损伤(ALI)大鼠中性粒细胞NF-κB活化的影响.方法 健康清洁级SD大鼠60只,3月龄,体重250～350 g,雌雄不拘,随机分为5组(n=12):对照组(C组)、ALI组和不同剂量异丙酚组(Pl组、P2组、P3组).ALI组经股静脉注射LPS 5 mg/kg;Pl组、P2组和P3组经股静脉注射LPS 5 mg/kg后立即分别静脉输注异丙酚5、10和15 mg·kg-1·h-1,输注时间2 h;C组经股静脉注射10 ml生理盐水.异丙酚输注结束时,行肺组织病理学评分,采集颈动脉血样,测定中性粒细胞总NF-κB和活化的NF-κB的表达水平.结果 与C组比较,ALI组、P1组和P2组肺组织病理学评分和中性粒细胞活化的NF-κB表达水平升高,P3组肺组织病理学评分升高(P＜0.05);与ALI组比较,P2组和P3组肺组织病理学评分降低,P1组～P3组中性粒细胞活化的NF-κB表达水平降低(P＜0.05);P1组～P3组肺组织病理学评分和中性粒细胞活化的NF-κB表达水平依次降低(P＜0.05);各组中性粒细胞总NF-κB表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 异丙酚减轻大鼠内毒素性急性肺损伤的机制可能与抑制外周血中性粒细胞NF-κB的活化有关.     

硫喷妥钠预先给药对肿瘤坏死因子-α激活Jurkat细胞NF-κB活性的影响

目的探讨硫喷妥钠预先给药对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)激活Jurkat细胞NF-κB水平的影响。方法选择人T淋巴瘤细胞系Jurkat细胞,浓度调节至1×105/ml,实验分两部分,1．将细胞随机分为6组:空白对照组不加入药物;TNF-α5 U/ml组;400、1 000μg/ml硫喷妥钠组;400μg/ml硫喷妥钠 +TNF-α 5 U/ml组和1000 μg/ml硫喷妥钠+TNF-α 5 U/ml组:加入硫喷妥钠1 h后洗去,再加入5 U/ml TNF-α;在加入TNF-α后1 h提取细胞核蛋白,采用凝胶电泳迁移率分析方法测定NF-κB活性,Western 杂交法对NF-κB的抑制因子IκB-α进行半定量研究。2．将细胞随机分为8组,空白对照组不加入药物;TNF-α5U/ml组;其他6组先用1 000μg/ml硫喷妥钠孵育1 h,随后用PBS冲洗,加入新鲜完全培养基,分别在培养后即刻、2、4、6、8、10 h加入TNF-α 5 U/ml刺激1 h,用上述方法测定NF-κB活性。结果 TNF-α可激活Jurkat细胞的NF-κB活性,下调IκB-α表达,1000μg/ml硫喷妥钠可抑制TNF-α激活 Jurkat细胞的上述改变。1000μg/ml硫喷妥钠被洗脱后8 h以内对NF-κB活性有抑制作用。结论 1 000μg/ml硫喷妥钠对人淋巴瘤Jurkat细胞TNF-α激活的NF-κB活性具有一定的抑制作用,与上调 IκB-α表达有关,而且可以被该细胞记忆数小时。     

脂质体介导NF-κB圈套寡核苷酸体外转染Kupffer细胞的实验研究

目的 研究核因子κB(NF-κB)圈套寡核苷酸(decoy oligodeoxyribonucleotide,ODN)体外借助阳离子脂质体转染大鼠Kupffer细胞(KCs)的效率,并观察其对KCs活化的抑制作用.方法 24只Wistar大鼠分为3组,每组8只.(1)对照组:分离培养正常大鼠KCs;(2)LPs组:KCs培养液中加入终浓度为1 ms/L的LPS作为刺激因素;(3)NF-κB圈套寡核苷酸组:先用阳离子脂质体(lipofectamine)将人工合成的NF-κB圈套寡核苷酸转染KCs(4μg/1×105个KCs),观察转染效果,再用1 mg/L LPS刺激,观察其对KCs活化的抑制作用,包括KCs的吞噬功能、NF-κB易位,以及膜表面分子CD4O mRNA的表达.结果 在LPS刺激下,KCs呈高度活化状态,吞噬功能增强,NF-κB向细胞核移位,细胞膜表面共刺激分子CD40 mRNA呈高表达状态,与对照组相比差异有统计学意义(t=4.01,P<0.01).在阳离子脂质体介导下,人工合成的NF-κB圈套ODN可以高效转染KCs,有效地抑制NF-κB活化,降低其下游基因的表达,与LPS组相比差异有统计学意义(t=4.89,P<0.01).结论 在脂质体介导下,NF-κB圈套寡核苷酸可以高效转染KCs,并有效抑制KCs的活化.     

CaN和CaMK Ⅱ在单核细胞活化信号传导中的作用

目的：观察CaN和CaMKⅡ在LPS诱导人单核细胞活化的细胞内信号传导过程中的作用。方法：以CaN抑制剂CsA或CaMKⅡ抑制剂KN93预处理已经分化的人单核细胞系U937后，再用LPS刺激，采用Western 印迹法检测细胞内IκB-α水平及胞核内NF-κB水平的变化，并用MTT法测定上清液中TNF-α水平变化。结果：CsA和KN93均可明显抑制LPS刺激U937细胞后胞核内NF-κB水平及上清液中TNF-α水平的升高。结论：CaN和CaMKⅡ在LPS诱导人单核细胞活化的信号传导过程中均起重要作用。     

核因子-κB在神经干细胞增殖过程中的调控作用

目的 观察核转录因子(NF)-κB信号通路的活化对体外培养的神经干细胞(NSCs)增殖的影响,探讨NF-κB在NSCs增殖过程中的调控作用.方法 采用成球悬浮法分离培养小鼠神经干细胞(mNSCs)并鉴定NSCs标志蛋白nestin;将生长状态良好的第3代mNSCs分为空白对照组、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)组、PDTC组,分别采用常规NSCs培养液、含10μg/L TNF-α的NSCs培养液、含0.1 mmol/L PDTC的NSCs培养液培养30 min、4 h和72 h;采用免疫荧光细胞化学方法 及蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测NSCs的NF-κB活化状况;采用免疫荧光细胞化学方法 检测增殖指标CyelinD1和Ki-67的表达,观察NSCs的增殖.结果 培养的mNSCs表达nestin:免疫荧光细胞化学方法 及Western blot结果显示,TNF-α可明显使p65活化由胞质转位至胞核;TNF-α组和空白对照组,CyclinD1阳性细胞率分别为(68.6±4.2)%和(38.8±3.7)%,明显高于PDTC组的(24.2±2.8)%(P＜0.05);Ki-67阳性细胞率分别为(48.2±3.6)%和(35.2±4.7)%,明显高于PDTC组的(18.7±1.8)%(P＜0.05).结论 NF-κB的激活或抑制可促进或抑制NSCs的增殖,NF-κB在NSCs的增殖过程中可能起着重要的调控作用.     

异丙酚对LPS诱导中性粒细胞Toll样受体2和Toll样受体4表达的影响

目的 探讨异丙酚对内毒素(LPS)诱导中性粒细胞Toll样受体2(TLR2)和TLR4表达的影响.方法 健康志愿者6名,年龄20～35岁,各采集外周静脉血样50 ml,加入20 U/ml肝素抗凝,分离提纯中性粒细胞,制备细胞悬液,然后随机分为6组,每组6皿:对照组(C组)不给予任何药物,置于37℃、5%CO_2培养箱中培养12 h;异丙酚脂质溶剂intralipid组(I组)、异丙酚组(P组)和LPS组(L组):分别加入intralipid(终浓度为5 μg/ml)、异丙酚(终浓度为5 μg/ml)或LPS(终浓度为1μg/ml),置于37℃、5%CO_2培养箱中孵育12 h;intralipid+LPS组(IL组)和异丙酚+LPS组(PL组)先分别加入intralipid(终浓度为5 μg/ml)或异丙酚(终浓度为5 μg/ml)后,置于37℃、5%CO_2培养箱中孵育20 min,然后加入LPS(终浓度为1μg/ml),置于37℃、5%CO_2培养箱孵育12 h.采用流式细胞仪测定中性粒细胞膜TLR2和TLR4的表达;采用荧光定量PGR检测中性粒细胞膜TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达;采用ELISA法测定培养上清液TNF-α和IL-8的浓度.结果 与C组比较,I组和P组TLB2和TLR4的表达、1NF-α和IL-8L-8的浓度差异无统计学意义(P>0.05),L组和IL组TLR2和TLR4的表达上调,L组TNF-α和IL-8L-8的浓度升高,IL组IL-8浓度升高(P<0.05);与L组比较,IL组TLR2和TLR4的表达、TNF-α和IL-8L-8的浓度差异无统计学意义(P>0.05),PL组TLR2和TLR4的表达下调,TNF-α和IL-8L-8的浓度降低(P<0.05).各组TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 异丙酚可下调LPS诱导的中性粒细胞TLR2和TLR4的表达,从而抑制炎性反应.     

清热解毒中药对TNF-α诱导的小鼠肾小球系膜细胞NF-κB信号转导通路的影响

目的:以清热解毒中药金银花、连翘等为研究对象,重点观察其对TNF-α诱导的SV40 MES 13 NF-κB信号通路的影响,探讨清热解毒中药治疗肾脏病的有效机制。方法:通过MTT检测10味清热解毒中药对SV40 MES 13生长的影响,从中选出毒性小、作用浓度范围广的3种中药金银花、连翘、蒲公英作为研究对象分别作用于TNF-α刺激的SV40MES 13细胞,MTT检测其增殖、ELISA检测细胞浆p-IκBα、细胞核和细胞浆NF-κBp65及培养上清液中MCP-1、IL-6的表达。结果:(1)TNF-α能明显促进SV40 MES 13的增殖(P<0.05或P<0.01),药物处理组能抑制TNF-α刺激的SV40MES 13的增殖(P<0.01)。TNF-α与药物联合作用时抑制作用比单独药物处理更明显,呈浓度依赖性。(2)ELISA结果显示不同药物处理组细胞浆p-IκBα、细胞核NF-κBp65蛋白表达明显减低(P<0.01),细胞培养上清液中MCP-1、IL-6的含量明显降低(P<0.01),相同浓度的3种中药以金银花作用更明显。提示清热解毒药可以浓度依赖性地抑制SV40 MES 13的IκBα的磷酸化,减少细胞核NF-κB p65表达,阻止NF-κB核转位,从而抑制NF-κB活性,减少下游因子的分泌。结论:中药金银花、连翘、蒲公英可以抑制SV40 MES 13 NF-κB炎症信号通路的激活从而抑制SV40 MES 13的增殖并减少其下游因子的表达,该作用可能是清热解毒中药改善肾脏病炎性损伤的重要机制。     

核转录因子-kB-圈套抑制血管内皮细胞核转录因子-kB激活机制的探讨

目的观察核转录因子(NF)-κB圈套(decoy)对脂多糖(LPS)刺激后人脐静脉内皮细胞NF-κB激活的抑制作用,并就其作用机制进行探讨.方法获取和培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),平均分成4组.NF-κB-圈套组和错配-圈套组分别预先以NF-κB-圈套-Lipofectamine2000复合物和错配-圈套-Lipofectamine2000复合物(对照组)处理,LPS组和对照组分别加入同体积的培养液,观察荧光标记DNA转染细胞情况.用10μg/ml LPS刺激2 h激活NF-κB,收集细胞,分别提取细胞核蛋白,检测不同组NF-κB活性以及P65和P50亚基蛋白质含量.结果转染5 h后大于90%细胞核内可观察到绿色荧光.NF-κB-圈套组NF-κB P65亚基活性显著低于错配-圈套组和LPS组,但P65和P50亚基蛋白质含量两组之间无显著差异.结论NF-κB-圈套能抑制细胞核内NF-κB的DNA结合活性,这一作用可能是NF-κB-圈套转入细胞核后占据转录因子核定位区的结果.     

电刺激对LPS诱导M1型小胶质细胞活化的影响

目的评价电刺激对LPS诱导M1型小胶质细胞活化的影响。方法将生长良好的BV2小胶质细胞采用随机数字表法分为3组(n=18):对照组(C组)、LPS组和LPS+电刺激组(LE组)。C组常规培养24 h, LPS组和LE组加入浓度为100 ng/ml的LPS培养基孵育24 h, LE组于LPS孵育前给予100 mV/mm的直流电刺激4 h。采用ELISA法检测上清液TNF-α和IL-1β浓度;免疫荧光染色法检测M1型小胶质细胞表面标志物CD32和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达水平;qRT-PCR法检测细胞CD32和iNOS的mRNA表达水平。结果与C组相比, LPS组和LE组上清液TNF-α和IL-1β浓度升高, 细胞CD32和iNOS及其mRNA表达上调(P<0.05);与LPS组相比, LE组上清液TNF-α和IL-1β浓度降低, 细胞CD32和iNOS及其mRNA表达下调(P<0.05)。结论电刺激可抑制LPS诱导M1型小胶质细胞活化, 从而减轻炎症反应。