模拟粪便标本单增李斯特菌和伊氏李斯特菌TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应检测方法

目的建立一种TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR),用于模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的快速检测。方法以单增李斯特菌特异基因hly和伊氏李斯特菌特异基因smcL作为靶基因,合成2对引物和其相应的荧光探针,制作标准曲线,建立从模拟粪便标本中直接检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的TaqMan双重real-time PCR。利用李斯特菌属中其他种李斯特菌及常见致病菌验证引物、探针的特异性;通过制备模拟粪便标本并对其进行二次增菌后,分别提取DNA,采用TaqMan双重real-time PCR进行检测,以达到快速检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的目的。结果采用本研究建立的TaqMan双重real-time PCR对模拟粪便标本的检测结果显示特异性良好,与其他种李斯特菌和其他病原菌均无交叉反应。模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的检测下限分别为2.45×103cfu/g和2.92×103cfu/g;模拟粪便标本在3 h内可得出检测结果,当模拟粪便标本中单增李斯特菌含量为6 cfu/g和伊氏李斯特菌含量为5 cfu/g时,经过增菌后使用双重real-time PCR可检测出阳性结果。结论本研究建立了以单增李斯特菌的特异基因hly和伊氏李斯特菌的特异基因smcL为靶基因的TaqMan双重realtime PCR检测方法,该方法具有特异性好、敏感性高、快速易操作等优点,可用于临床、食品及环境标本的快速诊断,以及我国人群中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的携带或感染状况的调查分析。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测沙门菌（A～F群）方法的建立和应用

目的 建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测沙门菌,评价其优越性.方法 根据沙门菌保守的HilA基因序列合成引物和探针,建立快速检测沙门菌的实时荧光定量PCR.结果 所建立的实时荧光定量PCR具有简便、快速、敏感性高、特异性强、抗干扰性好和可重复性强等特点,与实际应用检测结果相符.结论 建立的实时荧光定量PCR可用于口岸食品和公共场所从业人员的沙门菌检测.     

实时荧光PCR同时检测沙门菌和单核细胞增生利斯特菌

目的建立一种同时检测沙门菌、单核细胞增生利斯特菌的快速检测方法。方法分别针对沙门菌invA基因、单核细胞增生利斯特菌hlyA基因设计引物和探针,进行多重实时荧光PCR（TaqMan）检测。结果经过对多重实时荧光PCR反应条件的优化,对沙门菌、单核细胞增生利斯特菌检测的灵敏度达到11.5fg和25．5fg。结论实时荧光PCR能够有效地同时检测沙门菌、单核细胞增生利斯特菌,并且该方法操作简便、快速,具有良好的灵敏性和特异性。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测沙门菌(A～F群)方法的建立和应用

目的建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测沙门菌,评价其优越性。方法根据沙门菌保守的H ilA基因序列合成引物和探针,建立快速检测沙门菌的实时荧光定量PCR。结果所建立的实时荧光定量PCR具有简便、快速、敏感性高、特异性强、抗干扰性好和可重复性强等特点,与实际应用检测结果相符。结论建立的实时荧光定量PCR可用于口岸食品和公共场所从业人员的沙门菌检测。     

多重聚合酶链反应鉴别单核细胞增生李斯特菌的研究

目的：建立一种快速有效地鉴定李斯特菌属和鉴别单核细胞增生李斯特菌（Lm)的方法。方法：以具有李斯特菌种、属特异性的iap基因和Lm特异的溶血素基因（hlyA)为靶目标，分别设计双重聚合酶链反应（PCR）和三重PCR鉴别李斯特菌，并比较2种PCR方法的特异性。结果：双重和三重PCR方法检测李斯特菌属和Lm标准株，均具有良好的特异性：进行三重PCR检测，可出现3个条带，其中2条为Lm的特征性条带（700，4200bp)，另1条为其他李斯特菌的iap基因片段（1200bp)，但是双重PCR不能鉴别部分Lm食品分离株，而三重PCR则可以鉴别。结论：建立的三重PCR法可用于李斯特菌属细菌特异性鉴定和混合培养物中Lm的特异性鉴别。     

空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157多重PCR分子检测研究

目的建立同时检测空肠弯曲菌、单核细胞增生性李斯特菌(简称单增李斯特菌)和大肠杆菌O157的多重聚合酶链反应(PCR)检测技术。方法根椐空肠弯曲菌mapA基因序列、单增李斯特菌的编码溶血素(hly)基因序列和大肠杆菌的O157抗原(rfbE)基因序列,分别设计了3对特异引物,PCR扩增的目的基因片段为589 bp、360 bp和194bp;并对反应条件进行了优化。结果对3种致病菌检测,多重PCR检测DNA的敏感度分别为空肠弯曲菌2.264 ng、单增李斯特菌37.92 ng、大肠杆菌2.100 ng,样品检测时间6~8 h。结论该方法操作简便,检测周期短,特异性和敏感度高,为同时检测污染样品中空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157奠定了基础。     

空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157多重PCR分子检测研究

目的建立同时检测空肠弯曲菌、单核细胞增生性李斯特菌（简称单增李斯特菌）和大肠杆菌O157的多重聚合酶链反应（PCR）检测技术。方法根椐空肠弯曲菌mapA基因序列、单增李斯特菌的编码溶血素（hly）基因序列和大肠杆菌的O157抗原（rfbE）基因序列,分别设计了3对特异引物,PCR扩增的目的基因片段为589 bp、360 bp和194bp;并对反应条件进行了优化。结果对3种致病菌检测,多重PCR检测DNA的敏感度分别为空肠弯曲菌2.264 ng、单增李斯特菌37.92 ng、大肠杆菌2.100 ng,样品检测时间6-8 h。结论该方法操作简便,检测周期短,特异性和敏感度高,为同时检测污染样品中空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157奠定了基础。     

食品中志贺活菌叠氮溴乙锭实时荧光聚合酶链反应技术研究

目的 利用叠氮溴乙锭（ethidium monoazide bromide,EMA）实时荧光聚合酶链反应（PCR）技术,建立一种简便、快速、特异、灵敏的在食品中检测志贺活菌的方法。方法 根据志贺菌ipaH基因保守序列设计特异性引物和探针。用不同EMA浓度、不同光照次数优化样品EMA前处理条件。用已知菌验证志贺活菌检测的敏感性和志贺死菌检测的抑制性。用31株志贺菌、26株单增李斯特菌、24株沙门菌、25株副溶血弧菌、11株阪崎肠杆菌、10株致病性大肠埃希菌和1株大肠埃希菌验证方法的特异性和稳定性。同时用本研究方法和常规分离培养法,对30件模拟样品进行实样验证。结果 志贺活菌EMA实时荧光PCR方法的循环阈值（Ct）=32.10~3.19log（菌量）（R2=0.994）。最低检测浓度为2.20 CFU/反应。对死菌DNA抑制效率99.97%。31株志贺菌Ct值最低为15.04,最高为26.54,而97株非志贺菌的Ct值均35或无Ct值（呈一条直线）。重复试验Ct值变异系数3。30件模拟样品采用本研究方法和常规分离培养法的检测结果一致,但采用EMA实时荧光PCR方法耗时不超过7.5 h,而常规分离培养方法则需要3～5 d。结论 EMA实时荧光PCR技术是一种快速简便、特异性强、灵敏度高、仅检测志贺活菌的方法,建议在食品检测中推广应用。     

多重PCR快速检测3种食源性致病菌

目的建立一种能同时检测金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌3种致病菌的多重PCR检测方法。方法采用LB培养液对金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌标准菌株进行增菌。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、产单核李斯特氏菌的hlvA基因、沙门氏菌的invA基因设计引物,通过多重聚合酶链反应（PCR）对上述3种食源性致病菌的目的基因进行扩增,同时对反应体系进行优化。结果对平均浓度为5cfu／ml的金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门氏菌在LB培养液中进行8h振荡培养,可以检出阳性结果;把金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌、沙门菌、志贺菌、蜡样芽孢杆菌、大肠埃希菌0157、阪崎肠杆菌7种菌混合在一起提取混合基因组DNA进行PCR扩增,显示出很好的特异性结果。结论建立的多重PCR检测方法适用于金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌的快速检测,具有快速、简便、灵敏的特点,可广泛应用于食品卫生检测、食物中毒应急处理和临床检验等领域。     

沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR快速检测技术的建立与应用

目的建立快速同时检测沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌的多重聚合酶链反应(PCR)技术。方法根据沙门菌hilA基因、志贺菌ipaH基因及副溶血性弧菌tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定特异性和灵敏度。结果该多重PCR技术能在8 h内同时检测3种目的菌,通过检测其他9种常见食源性致病菌,结果表明该方法特异性好,多重PCR检测灵敏度分别为:沙门菌104cfu/mL,志贺菌102cfu/mL,副溶血性弧菌104cfu/mL。并进行了人工模拟食品和粪便样品的检测。结论初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR检测技术。     

应用磁免疫技术快速检测三种新发病原菌

目的 应用磁免疫分离技术(IMS)建立对3种新发病原菌(O139群霍乱弧菌、EHEC O157 ∶ H7、单增李斯特菌)的快速检测方法。 方法 将IMS分别与显色培养(chromogenic media,Ch)和荧光定量PCR技术结合,建立了IMS-Ch、IMS-PCR两种新方法,研究不同方法的灵敏性和特异性,并对高危样品的检测效果进行评价。 结果 IMS-Ch法24 h能检出目标菌含量 50 cfu/10 g 的样品,IMS-PCR法用于检测EHEC O157 ∶ H7和霍乱弧菌,9 h可达检出限为10~20 cfu/10 g,实际检测效果评价的尤等指数95%。 结论 IMS-PCR是一种可信的快速筛选方法,IMS-Ch法为较国标法灵敏、快速的确证方法。     

Evaluation of an enzyme-linked fluorescent assay for the detection of Listeria monocytogenes from food

The VIDAS Listeria monocytogenes II (LMO2) method, which is an automated enzyme-linked fluorescent immunoassay (ELFA), was used for rapidly, specifically and sensitively detecting L. monocytogenes in food samples. All 31 L. monocytogenes strains examined gave positive results. The other bacterial species except Salmonella showed completely negative results, but it was suspected that Salmonella spp. had given a false-positive reaction to the assay. As the detectable limit of the assay was 10? cfu/ml in a food suspension, food samples were required to be enriched in order to increase the number of the bacteria to the detectable limit. However, the ELFA was reconfirmed to be applied satisfactorily as a rapid and precise method for the detection of L. monocytogenes in various food samples, even if the culture had to be enriched for 12 h prior to the assay.     

模拟粪便标本中的单增李斯特菌的分离和检测

目的 建立针对粪便标本中单增李斯特菌的分离鉴定方法,评价方法的检测下限,以提高感染人群标本中单增李斯特菌的检出率,了解我国人群中该菌的携带及感染情况。 方法 对模拟人粪便标本进行二次增菌,采用Real-time PCR检测,并同时分离培养获得该病原菌。 结果 当每克模拟粪便标本中含有7 cfu的单增李斯特菌时,经过增菌后的标本用Real-time PCR方法可检测出阳性结果,并能够通过单增李斯特菌的选择培养基分离得到病原菌。 结论 本研究为从粪便标本中分离单增李斯特菌和由单增李斯特菌引起的食物中毒事件的病原学调查提供了技术支持,有利于对我国人群中单增李斯特菌的携带或感染状况进行调查分析。     

利用双重TaqMan荧光定量聚合酶链反应技术鉴别诊断粪便标本中的伤寒和甲型副伤寒沙门菌

目的建立针对粪便标本中伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌的检测方法,评价该方法的特异性、敏感性及检测下限,以提高感染人群粪便标本中两种病原的检出效率。方法分别根据伤寒沙门菌特异基因STY1633及甲型副伤寒沙门菌特异基因SPA4289设计特异性引物及探针,优化反应条件,建立双重TaqMan荧光定量聚合酶链反应(dual taqman fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)体系。利用44株伤寒沙门菌、30株甲型副伤寒沙门菌、88株其他血清型沙门菌染色体DNA及引起发热的其他病原菌,评价该方法的特异性和灵敏性,并对伤寒沙门菌及甲型副伤寒沙门菌的粪便模拟标本进行检测下限评价,同时利用10份伤寒患者、20份甲型副伤寒患者及48份其他病原所致发热和/或伴腹泻的患者粪便标本进行特异性、敏感性验证。结果利用本方法检测的伤寒、副伤寒沙门菌纯菌及伤寒、甲型副伤寒患者标本扩增阳性,其余的非伤寒沙门菌、致腹泻的其他5种肠道致病菌及引起发热症状的8种常见非肠道病原菌纯菌及相应患者标本均扩增阴性。在对纯伤寒沙门菌DNA及甲型副伤寒沙门菌DNA检测中,双重TaqMan荧光定量PCR法的最低检测限分别为1 pg/反应(194拷贝/反应)及2.5 pg/反应(485拷贝/反应)。以粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中,增菌前伤寒沙门菌检测下限达102cfu/g,增菌后可达1 cfu/g;增菌前甲型副伤寒沙门菌检测下限达104cfu/g,增菌后可达10 cfu/g。结论本研究建立了特异性好、灵敏度高的检测粪便中伤寒沙门菌及甲型副伤寒沙门菌的双重TaqMan荧光定量PCR方法,为伤寒及甲型副伤寒疾病的同时快速诊断及鉴别诊断、某些不明原因发热及腹泻症状的病原的初步鉴定提供了简易手段。     

基于单一基因的反转录-环介导等温核酸扩增技术快速检测甲型副伤寒沙门菌

目的建立反转录-环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)方法特异检测甲型副伤寒沙门菌。方法针对甲型副伤寒沙门菌特异保守hsdM基因设计引物,通过优化反应条件,建立检测该靶基因的RT-LAMP体系。利用多种血清型沙门菌及非沙门菌菌株DNA评价该方法的特异性及敏感性。同时对甲型副伤寒沙门菌全血模拟标本及粪便模拟标本进行敏感性检测,并利用临床样本进行初步验证。结果等温65℃条件下,30~60 min内完成RTLAMP反应,利用该方法检测130株甲型副伤寒沙门菌均为阳性,其他非甲型副伤寒沙门菌均扩增阴性。对纯菌RNA检测中检测下限为50 pg/反应,约为19 000个拷贝/反应。在以全血模拟样本的检测中,敏感性达80 cfu/ml,略高于PCR检测低限。对粪便模拟标本的检测中,对原始样品检测下限为500 cfu/g;增菌后样品检测下限为0.8 cfu/g,比PCR检测低限高2~10倍。临床样本中甲型副伤寒患者血液标本检测均阳性,而伤寒样本检测均阴性。结论建立了敏感性高、特异性好的检测甲型副伤寒沙门菌的RT-LAMP方法,为甲型副伤寒沙门菌感染的快速诊断提供了简易手段,可试用于甲型副伤寒的早期诊断。     

沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR快速检测技术的建立与应用

目的建立快速同时检测沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌的多重聚合酶链反应（PCR）技术。方法根据沙门菌hilA基因、志贺菌ipaH基因及副溶血性弧菌tdh基因序列设计引物，进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系，测定特异性和灵敏度。结果该多重PCR技术能在8h内同时检测3种目的菌，通过检测其他9种常见食源性致病菌，结果表明该方法特异性好，多重PCR检测灵敏度分别为：沙门菌10^4cfu／mL，志贺菌10^2cfu／mL，副溶血性弧菌10^4cfu／mL。并进行了人工模拟食品和粪便样品的检测。结论初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR检测技术。