针对HBVS区的siRNA的抗病毒活性

目的: 体外观察siRNA对HepG2 2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(HBV)S-mRNA及HBsAg,HBeAg产生的影响. 方法: 设计并合成针对HBV S区的三条siRNA,构建含上述siRNA的表达载体pSilencer ZY1,pSilencer ZY2和pSilencer ZY3,pSilencer HK2测序及酶切鉴定后用脂质体介导重组质粒转染HepG2 2.2.15细胞,用酶免分析法对HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg进行检测,用逆转录聚合酶链反应检测HBV S-mRNA.结果: 成功构建了针对HBV S区的siRNA的表达载体,三条siRNA均可程度不同地抑制HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg的分泌,72 h抑制率达高峰,对HBsAg的抑制率分别为81%,29%及78%,对HBeAg的抑制率分别为35%,3%及49%,并有抑制HBV S-mRNA的作用.结论: 针对HBV S区的siRNA能明显抑制HBV的复制.     

HBV对肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15中MMP-2及MMP-9的表达影响

目的研究基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9在肝细胞癌(HCC)细胞系HepG2和HepG2.2.15中的表达情况,探讨乙型肝炎病毒(HBV)对肝癌细胞系(HepG2,HepG2.2.15)中MMP-2、MMP-9表达的影响及其与癌细胞侵袭转移之间的关系。方法用明胶酶谱法检测HepG2细胞和稳定转染了HBV质粒的HepG2.2.15细胞中MMP-2和MMP-9的表达情况,观察两种细胞的某些生物学活性,用细胞生长曲线检测两者的生长速度。结果明胶酶谱法检测HepG2细胞中MMP-9的表达水平高于HepG2.2.15细胞(P<0.05),而两者MMP-2的表达差异不显著(P>0.05)。细胞生长曲线显示HepG2细胞的生长速度快于HepG2.2.15细胞。结论通过体外鉴定肝细胞癌细胞系HepG2细胞和HepG2.2.15细胞生长状态的差异,揭示了HBV的细胞内感染过程中HBV对肝细胞癌的生长具有一定的影响。HBV可影响明胶酶MMP-2和MMP-9的分泌及活性,进而对肿瘤的侵袭转移产生一定的影响。     

热休克蛋白B1抑制HBV复制的研究

目的 探讨热休克蛋白B1 (heat shock protein B1,HSPB1)对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响.方法 采用Western blot检测正常肝细胞系(HepRG)和HBV稳定复制细胞系(HepAD38和HepG2.2.15)中HSPB1的蛋白水平.在HBV稳定复制细胞系(HepAD38和HepG2.2.15)中转染pCMV6-HSPB1质粒及对照质粒,采用Western blot验证HSPB1过表达水平,实时荧光定量PCR和Southern blot检测HSPB1过表达对HBV复制中间体表达的影响;qRT-PCR检测HSPB1过表达对HBV3.5 kb mRNA表达的影响;ELISA检测HSPB1过表达对HBV s抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)分泌的影响.在肝癌细胞系Huh-7中共转染pCH9/3091和pCMV6-HSPB1质粒,采用Western blot验证HSPB1过表达水平,实时荧光定量PCR和Southern blot检测HSPB1过表达对瞬时转染的HBV复制中间体表达的影响.结果 HSBP1在HepAD38和HepG2.2.15中的表达明显低于HepRG.HSPB1在HepAD38和HepG2.2.15细胞中成功过表达,在过表达HSPB1的HepAD38和HepG2.2.15细胞中HBV复制中间体水平以及3.5 kb mRNA水平均降低,细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的分泌水平也降低.HSPB1在转染pCH9/3091的Huh-7细胞中成功过表达,HSPB1过表达抑制了瞬时表达的HBV的复制水平.结论 HSPB1可以抑制HBV复制.     

siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.     

HBV全基因组克隆转染细胞系的建立

目的:建立HBV体外细胞培养体系. 方法:构建HBV全基因克隆质粒pcDNA3-3HBV,稳定转染HepG2细胞,G418筛选. ELISA检测细胞上清液HBsAg,HBeAg的表达,免疫组化检测细胞内HBcAg的表达,RT-PCR检测细胞S基因mRNA的表达,PCR检测细胞上清液DNA. 结果:成功构建了HBV全基因克隆质粒pcDNA3-3HBV,稳定转染HepG2后,培养上清HBsAg,HBeAg阳性,细胞内HBcAg呈核浆型分布,且以浆型分布为主. RT-PCR证实有HBV S基因 mRNA 的表达,上清中HBV S及前S基因阳性,荧光定量PCR检测显示培养上清中HBV 滴度达1×108拷贝/L. 结论:重组质粒pcDNA3-3HBV能在HepG2细胞中表达、转录、复制,该细胞培养体系能产生较高水平的HBV.     

人MxA基因重组真核载体抗乙型肝炎病毒作用的实验室研究

目的:研究重组真核载体PcDNA3.l-MxA体外抗HBV的作用,为研究MxA基因(myxovirus-resistant A)治疗慢性HBV感染奠定基础.方法:将构建成功的重组真核载体PcDNA3.l-MxA转染入HepG 2.2.15.将HepG 2.2.15分为实验组(转染PcDNA3.1-MxA的HepG 2.2.15)和对照组(转染PcDNA3.1的HepG 2.2.15),应用RT-PCR方法检测两组HepG2.2.15内MxAmRNA(P<0.01),并应用ELISA法检测两组HepG2.2.15内HBsAg、HBeAg的水平.结果:RT-PCR扩增结果显示实验组的MxAmRNA水平均较对照组明显升高,实验组HBsAg、HBeAg水平明显低于对照组(均P<0.01).结论:转染重组真核载体PcDNA3.l-MxA HepG2.2.15内MxA蛋白明显抑制了HBV DNA的复制及表达,为进一步研究MxA蛋白体内抗病毒作用提供理论.     

Adr亚型HBV转染人胎盘滋养层细胞株的体外研究

目的通过转染adr亚型HBV-DNA,建立可复制HBV的人胎盘滋养层细胞(HPT-8)。方法采用脂质体介导的方法将重组真核表达质粒pcDNA3-3HBV转染人胎盘滋养层细胞,经G418筛选,通过ELISA、免疫组化、PCR等方法对转染细胞和培养上清分别进行检测。结果HPT-8细胞稳定转染质粒pcDNA3-3HBV后,第1、2代转染细胞的培养上清ELISA检测显示HBsAg、HBeAg阳性,免疫组化检测显示转染细胞胞浆中HBsAg、HBcAg呈阳性信号,PCR检测培养上清中HBV-DNA呈阳性,荧光定量PCR检测其滴度达9×106拷贝/L,并且转染滋养细胞中有HBV-rcDNA和HBV-cccDNA存在。结论重组质粒pcDNA3-3HBV能在人滋养层细胞中表达、转录、复制。     

RNA干涉对乙型肝炎病毒复制和表达的影响

目的：观察HBV S区和C区特异性的小发夹RNA（shRNA）表达载体对HepG2.2.15细胞中HBV复制和表达的影响。方法：采用含有pol Ⅲ启动子的真核表达载体pSilenceCircle-U6构建针对HBV S区和C区的特异性shRNA表达质粒SC-S和SC-C。实验设立SC-S组、SC-C组、无关对照SC-N组和空白对照组,采用不同浓度的重组载体转染HepG2.2.15细胞,并作用不同时间。应用ELISA方法检测细胞上清液中的HBeAg和HBsAg,用斑点杂交方法检测细胞上清中的HBV DNA。结果：成功构建了含目的序列的重组质粒SC-S和SC-C。SC-S对HBeAg和HBsAg表达的抑制率明显高于SC-C;随着给药浓度的增加,SC-S对HBeAg和HBsAg表达的抑制率逐渐增强;SC-S转染HepG2.2.15细胞后第3天产生明显抑制效应,对HBeAg及HBsAg表达的抑制率在第6天达高峰,第9天抑制率仍较高。斑点杂交结果显示,SC-S对HBV复制的抑制效应强于SC-C。结论：构建的HBV S区和C区特异性shRNA表达质粒有明显、高效抑制HBV复制和表达的作用。     

miR-122表达载体的构建及其对HepG2.2.15细胞增殖的抑制作用

目的构建miR-122表达载体并检测其表达对HepG2.2.15细胞恶性表型的逆转作用。方法以HepG2.2.15细胞基因组DNA为模板,PCR扩增miR-122前体cDNA序列,以质粒pSilencer3.1-H1 neo为母本,构建miR-122表达载体将其转染HepG2.2.15细胞。表达后,利用ELISA检测HepG2.2.15细胞HBV复制和表达的变化,利用CCK8检测细胞增殖的变化。结果构建的miR-122表达载体可在HepG2.2.15细胞中表达。转染后HepG2.2.15细胞中HBV复制、表达以及细胞增殖均被抑制。结论 miR-122表达载体可在HepG2.2.15细胞中有效表达,其表达可抑制HBV复制、表达以及细胞增殖。     

小鼠白细胞介素-21基因重组腺病毒可控制慢性HBV感染

目的 观察小鼠白细胞介素-21基因重组腺病毒(Ad-GFP-mIL-21)在慢性HBV感染小鼠中的表达以及其对病毒清除和HBV特异性抗体产生的作用.方法 Ad-GFP-mIL-21体外感染HepG2.2.15细胞后分别采用ELISA和Western blot检测上清和细胞mIL-21的表达;尾静脉注射rAAV8-1.3HBV至野生型C57BL/6小鼠体内建立HBV持续表达模型,12周后实验组尾静脉注射Ad-GFP-mIL-21,以注射空载GFP重组腺病毒或PBS为对照组,荧光显微镜观察Ad-GFP-mIL-21在小鼠体内各器官的表达情况,ELISA检测各组小鼠血清HBsAg、HBsAb、HBcAb和mIL-21的水平.结果 Ad-GFP-mIL21可在体外感染HepG2.2.15细胞,且上清mIL-21水平与重组载体的滴度和感染时间相关.注射Ad-GFP-mIL21至HBV持续表达小鼠后第4天观察到绿色荧光主要在肝细胞表达;与处理前相比,注射第4天血清mIL-21水平显著升高(P<0.05),而HBsAg滴度则明显下降;实验组和对照组小鼠在注射第13天血清HBsAb均为阴性;与对照组相比,实验组小鼠血清HBcAb水平显著升高(P<0.05).结论 Ad-GFP-mIL-21在HBV持续感染小鼠体内可表达mIL-21,并能下调血清HBsAg滴度和促进HBcAb产生,提示其在体内具有控制慢性HBV感染的作用.     

凹陷蛋白-1基因在乙型肝炎相关性肝癌中的表达及其意义

目的 探讨候选抑癌基因凹陷蛋白(Caveolin)-1在肝细胞癌(HCC)中的表达及其与HCC侵袭、转移的关系.方法 对123例HCC标本以及MHCC-97L和MHCC-97H肝癌细胞株进行实时荧光PCR法、免疫组化法及Western印迹法检测Caveolin-1 mRNA及蛋白表达,分析其表达与肿瘤侵袭、转移性间的关系.结果 Caveolin-1在肝癌组织中较癌旁组织表达明显下调(P<0.05);HCC 中的表达水平与大/小肝癌(≥5 em或<5 cm)、AFP表达水平、有无大血管侵袭、肿瘤单发或多发及pTNM分期5个因素均呈显著负相关(P<0.05),其在MHCC-97H细胞株中的表达显著低于MHCC-97L(P=0.000);Caveolin-1与HBx表达显著负相关(P=0.044).结论 Caveolin-1表达与HCC侵袭转移密切相关,其表达下调,预示HCC的预后不良;有可能存在HBx蛋白下调Caveolin-1表达的机制.     

乙肝相关性肝癌患者中Foxp3启动子区甲基化及其表达的研究

目的:研究乙肝相关性肝癌患者中Foxp3启动子区甲基化及其表达,探讨Foxp3在乙肝相关性肝癌发病中的意义。方法:使用real time RT-PCR检测34例肝癌组织中Foxp3mRNA的水平,通过焦磷酸测序的方法检测Foxp3的甲基化水平。结果:HBV阳性肝癌组织中Foxp3mRNA表达水平高于HBV阴性组,具有显著差异;HBV阳性与阴性肝癌组织中Foxp3的甲基化水平不具有统计学差异。结论:原发性肝癌患者中HBV感染使Foxp3mRNA表达升高,Foxp3mRNA表达升高可能不是或不完全是通过甲基化修饰来调控的。     

乙肝病毒(HBV)感染对肝细胞癌(HCC)患者A-to-I RNA编辑的影响

 目的 探究乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者肝脏正常组织和癌组织中腺嘌呤转变为次黄嘌呤（adenine to inosine,A-to-I）RNA编辑活性的影响。方法 从基因表达数据库（gene expression omnibus,GEO）收集28套成对正常组织和癌组织的转录组数据,分为HBV阴性正常组织（HBV-N）组、HBV阴性癌组织（HBV-T）组、HBV阳性正常组织（HBV+N）组和HBV阳性癌组织（HBV+T）组。用SPRINT软件进行位点鉴定后,从催化酶表达水平、位点编辑水平和位点所在基因的基因本体论（gene ontology,GO）富集通路层面进行分析。结果 在正常组织和癌组织中均发现HBV感染时腺苷酸脱氨酶1（adenosine deaminases acting on RNA 1,ADAR1）表达水平更高。癌组织中HBV阳性样本的A-to-I RNA编辑水平上升,正常组织中则无此现象。两类组织中HBV阳性样本编辑基因显著富集在细胞增殖、基因调控相关信号通路。结论 HBV感染上调ADAR1的表达,从而改变宿主编辑事件活性,这对HCC的发生发展可能有促进作用。     

原发性肝细胞癌癌组织中p33ING1b与p53基因的表达

目的研究p33ING1b与p53蛋白在原发性肝细胞癌中表达的相关性及ING1b基因在原发性肝细胞癌中的突变率.方法应用免疫组织化学SP方法检测了57例原发性肝细胞癌癌组织、51例癌旁肝组织及12例正常肝组织中p33ING1b和p53蛋白的表达,并分析了原发性肝细胞癌癌组织中乙肝病毒(HBV)的感染率;应用聚合酶链式反应(PCR)联合单链构象多态性(SSCP)方法检测了28例配对癌及癌旁肝组织中ING1b基因两个外显子的突变情况,对有异常泳动条带的DNA片段分别克隆测序.结果在57例原发性肝细胞癌癌组织中,p33ING1b、p53蛋白的阳性率分别为42.1%和57.9%,p33ING1b、p53表达均呈阳性者有19例(33.3%),且两者在癌组织中阳性分布区域相同;p33ING1b蛋白表达与p53蛋白表达在癌组织中呈显著正相关(r=0.783, P<0.01);配对癌旁肝组织及正常肝组织中p53蛋白表达均为阴性,p33ING1b蛋白在13例癌旁肝组织及2例正常肝组织中呈弱阳性表达;在57例原发性肝癌组织中有35例(61.4%)HBV X蛋白呈阳性,其病理类型均为肝细胞肝癌,在51例癌旁肝组织中检出HBV X蛋白阳性者39例(76.47%),癌组织中HBV感染与p33ING1b、p53蛋白表达均有关(P<0.01);PCR-SSCP结果表明,ING1b基因在原发性肝细胞癌中突变率较低为7.1%(2/28).结论 p33ING1b、p53蛋白在原发性肝细胞癌中的表达呈显著正相关,p33ING1b的存在可能还有其他不依赖p53蛋白的途径;HBV感染与p33ING1b、p53蛋白表达均有关;基因突变不是p33ING1b丧失抑癌功能的主要因素.     

HBV相关及HCV相关肝细胞肝癌组织中8-羟基脱氧鸟苷酸和CD34及Ki-67的表达研究

目的 比较HBV相关与HCV相关肝细胞肝癌(HCC)组织中8-羟基脱氧鸟苷酸(8-OHdG)、CD34及Ki-67的表达,分析三者与临床病理特征的关系.方法 选取HCC患者110例,其中HBV相关HCC 90例(B-HCC组),HCV相关HCC 20例(C-HCC组),患者均行手术治疗,术后病理证实诊断.对癌组织标本中8-OHdG、CD34、Ki-67进行免疫组织化学染色,半定量评分评价染色结果.比较B-HCC组和C-HCC组各标记物的表达情况.结果 B-HCC组、C-HCC组癌组织中8-OHdG阳性表达率均为100.0%,按阳性细胞百分比＞25%分层比较,B-HCC组8-OHdG表达强(++～+++)者占67.8%(61/90),C-HCC组占90.0%(18/20),两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).B-HCC组8-OHdG的表达与有无门静脉瘤栓、临床分期有关(P＜0.01),而C-HCC组8-OHdG的表达与各临床指标无关.B-HCC组CD34指数≥120者占8.9%(8/90),C-HCC组占35.0%(7/20),两组间差异有统计学意义(P＜0.05).B-HCC组Ki-67阳性表达率为95.6%,C-HCC组为100.0%,按表达强度分层比较,两组Ki-67表达强度间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 在HBV相关及HCV相关HCC形成中,8-OHdG代表的氧化应激及CD34代表的血管密度参与作用的程度可能不同.     

p53, p73, nm23-H1基因在肝细胞肝癌中的表达与临床病理的关系

目的：研究p53,p73,nm23-H1基因在肝细胞肝癌中的表达与临床病理学关系。方法：应用免疫组织化学方法（SABC法）研究18例正常肝、12例肝硬化、78例肝细胞肝癌的p53,p73,nm23-H1基因的表达情况。结果：18例正常肝，12例肝硬化中p53和p73基因表达阴性和弱阳性；p53,p73,nm23-H1基因在肝细胞肝癌中表达率分别为55．13％，52．56％，66．66％；p53的表达在不同的临床分期、 病理学分级、有无转移和是否乙型肝炎之间差异有显著性意义（P＜0．05或P＜0．01），而与AFP含量间无显著意义；p73基因表达与病理学分级，是否乙型肝炎和有无肝内或门静脉转移之间差异显著（P＜0．01），与临床分期、AFP含量间无显著意义；nm23-H1的表达与临床分期、AFP含量间有显著性意义（P＜0．05），和肝内或门静脉转移呈负相关（P＜0．01），而与病理学分级、是否乙型肝炎无差异性。结论：p53,p73和nm23-H1可作为肝细胞肝癌发生、发展和预后的主要参考指标之一。     

宁夏地区乙型肝炎病毒基因BCP区A1762T/G1764A突变与肝细胞癌的相关性

目的 通过分析宁夏地区HBV基因核心启动子A1762T/G1764A双基因突变的特征,探讨其与乙型肝炎相关原发性肝癌的相关性.方法 收集宁夏地区104例慢性乙肝患者和88例乙肝相关肝细胞癌患者的一般病例资料及血清,采用荧光定量PCR法检测两组患者HBV DNA定量值;采用巢式PCR扩增及测序方法检测HBV C启动子A1762T/G1764A（ntA1762A→T和nt1764G→A）双突变情况;采用多因素Logistic回归分析肝细胞癌发生的危险因素.结果 104例慢性乙肝组和88例肝细胞癌组对比发现年龄、e抗原阴性、HBVDNA水平、乙肝肝硬化、HBV A1762/G1764A双位点突变均可能与肝细胞癌的发生有关,多因素Logistic回归分析结果提示年龄＞50岁、e抗原阴性、乙肝肝硬化、HBV A1762T/G1764A双突变与肝细胞癌发生呈正相关,而与HBV DNA＞10^5拷贝/mL呈负相关（P=0.000,OR=0.257）.结论 宁夏地区乙肝病毒基因BCP区A1762T/G1764A基因双突变是肝细胞癌发生的危险因素.     

乙型肝炎相关性肝癌患者血清低拷贝HBV DNA检测的临床分析

目的 通过对乙型肝炎相关性肝癌(HCC)患者血清低拷贝HBV DNA的检测,探讨乙肝病毒低复制水平与肝癌发生、发展的相关性,明确乙型肝炎患者血清低拷贝HBV DNA检测的临床意义。 方法 在所有乙型肝炎相关性HCC患者中,选取85例血清HBV DNA水平持续小于1 000 IU/ml的患者,对其病情发生、发展、演变进行系统的回顾分析,同时获得其血清,进行乙型肝炎标志物、肝功能、甲胎蛋白及低拷贝HBV DNA的检测,最后分析各项指标与低拷贝HBV DNA的相关性,分析其临床意义。 结果 85例乙型肝炎相关性HCC患者当中,乙型肝炎标志物HBeAg阳性者有15例,占17.65%,HBeAg阴性者70例,占82.35%。肝功能指标(ALT及AST)异常者52例,占61.18%。甲胎蛋白(AFP)异常升高者65例,占76.47%。低拷贝HBV DNA水平大于20 IU/ml者72例,占84.71%。低拷贝HBV DNA水平小于20 IU/ml者13例,占15.29%。 结论 乙型肝炎相关性HCC与乙型肝炎病毒持续复制有关,常规的HBV DNA检测只能检测HBV DNA水平大于1 000 IU/ml的患者,乙肝病毒低复制患者往往会被忽视,导致患者不能及时抗病毒治疗而使得病情发展。因此这种检测已不能满足临床的实际要求,乙型肝炎患者低拷贝HBV DNA检测更有临床指导意义。      

骨桥蛋白在肝癌中表达的临床意义

目的:探讨骨桥蛋白(OPN)在肝细胞癌中的表达的临床意义.方法:应用Western blotting法检测21例肝癌及癌旁组织、12例正常肝组织中OPN的表达以及应用免疫组化法对85例肝癌组织、10例肝硬化组织和10例正常肝组织进行OPN、血管内皮生长因子(VEGF)、CD34的检测,用Weidner法计算微血管密度(MVD).并分析OPN的表达与临床病理特征之间的关系.结果:Western blotting检测结果表明OPN在肝癌组织中的表达显著增高(P＜0.01),且OPN高表达和肝癌早期复发转移显著相关(P=0.003).免疫组化法检测结果表明OPN在肝癌组织中的表达显著高于肝硬化组织和正常组织(P＜0.05):且OPN在肝癌组织中的高表达和肿瘤包膜不完整(P=0.03)、感染HBV(P=0.03)和发生早期转移、复发(P=0.018)显著相关;OPN和VEGF在肝癌中的表达呈正相关(r=0.71,P＜0.01);OPN在肝癌组织的表达与MVD呈正相关(r=0.44,P＜0.01).结论:OPN在肝癌组织中显著高表达,且OPN与包膜是否完整、感染HBV和早期复发转移相关.OPN和VEGF、MVD的表达显著相关,OPN可能参与了肿瘤血管生成的过程.