BRCA1基因真核表达载体的构建及其功能验证

目的：构建人乳腺癌易感基因BRCA1的真核表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人BRCA1基因,将其克隆到pXJ-40-myc载体中,酶切和测序验证后转染到乳腺癌ZR75-1细胞中,通过Western印迹检测其表达情况,并用CCK8法测定细胞生长曲线。结果从人乳腺文库中扩增获得大小为5600 bp的DNA片段,并成功克隆至pXJ-40-myc载体上,经测序与目的序列完全一致;转染乳腺癌ZR75-1细胞后目的基因成功表达;细胞生长曲线结果显示,转染myc-BRCA1的乳腺癌细胞较空载体细胞生长缓慢;划痕实验说明,转染myc-BRCA1的乳腺癌细胞较空载体细胞迁袭缓慢。结论成功构建了带myc标签的人BRCA1真核表达载体,为进一步研究BRCA1在乳腺癌发生发展中的功能奠定了基础。     

醛缩酶A基因真核表达载体的构建及其生物学活性分析

目的 构建带FLAG标签的醛缩酶A(ALDOA)基因的真核表达载体,对其表达产物进行功能检测.方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增ALDOA基因,将其克隆至真核载体pcDNA3.0-FLAG中.经过酶切与测序验证,转染人胚肾293T细胞系,利用蛋白质免疫印迹实验完成其表达鉴定.转染人乳腺癌细胞MCF7和ZR75-1,使...     

带Flag标签的RNF26真核表达载体构建及功能验证

目的 构建带Flag标签的RING结构泛素连接酶26(Ring finger protein 26,RNF26)真核表达载体,表达Flag-RNF26的融合蛋白,通过细胞免疫荧光实验,观察其在人肝癌细胞HepG2中的定位及与带绿色荧光蛋白标签的死骨片1(sequestosome 1,SQSTM1)是否存在共定位.方法 ...     

DEK基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其功能鉴定

目的：构建DEK基因的RNA干扰（ RNAi）慢病毒表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法采用RNAi技术,根据DEK基因的序列,确定其有效靶序列,合成DEK基因的Oligo DNA,退火形成双链DNA,将其克隆到经BamHⅠ与EcoRⅠ酶切后的小干扰RNA（ siRNA）表达载体PSIH-H1上,产生PSIH-H1-DEK慢病毒载体,筛选阳性克隆并测序鉴定。与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染乳腺癌细胞ZR75-1,经嘌呤霉素（ puromycin,puro）筛选2周后,收集部分细胞利用实时聚合酶链反应（ real time-PCR,RT-PCR）和Western印迹分别检验DEK在信使RNA （ mRNA ）和蛋白水平的敲低效果,并通过细胞生长实验检测DEK对人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞生长的影响。结果 PCR和DNA测序结果证实,DEK siRNA慢病毒表达载体PSIH-H1-DEK构建成功。 RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的DEK siRNA可有效抑制DEK基因的表达,并由此建立了敲低DEK的稳定克隆。生长曲线实验表明, DEK siRNA可抑制人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞的生长。结论成功构建了DEK基因的RNAi慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞后,有效沉默了ZR75-1细胞中的DEK基因的表达,为进一步研究DEK基因在乳腺癌中的作用奠定基础。     

转甲状腺素蛋白真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建转甲状腺素蛋白(TTR)的真核表达载体,观察其在NIH 3T3细胞中的表达及定位.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到TTR编码序列,将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,构建质粒pcDNA3-TTR-HA.重组质粒通过PCR、酶切测序等证明构建正确后经脂质体转染NIH 3T3细胞,固定并染色后通过荧光显微镜观察该融合蛋白的表达及定位.结果 重组质粒经鉴定证明构建正确.转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要分布在细胞质中.结论 成功构建带HA标签的TTR真核表达载体,该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位,为深入研究TTR在细胞内的相关生物学功能奠定了基础.     

肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定

目的构建编码肿瘤相关抗原MART-1融合基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达His-MART-1融合蛋白,并对蛋白进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR法扩增编码MART-1的基因片段,将该基因片段克隆到含有His标签的pET-28b原核表达载体上,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白并进行脱盐,SDS-PAGE电泳和Western blotting法鉴定。通过ELISA法检测经树突状细胞提呈后的His-MART-1融合蛋白对特异性CD4+T细胞的刺激作用。结果重组质粒经双酶切、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。His-MART-1融合蛋白经表达纯化后,分子量约13kD,与预期值相符。Western blotting证实该融合蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合。His-MART-1融合蛋白经树突状细胞提呈后能刺激MART-1特异性CD4+T细胞分泌IFN-γ。结论成功构建了编码MART-1基因原核表达载体pET-28b-MART-1,表达及纯化获得该融合蛋白,并证实其具有良好的免疫原性。     

pcDNA3.1(-)/PSMA7真核表达质粒的构建及其在A549细胞中的表达

目的 构建pcDNA3.1(-)/PSMA7真核表达质粒并建立人肺腺癌细胞株A549的稳定表达株.方法 采用RT-PCR法从正常人支气管上皮细胞株HBE135-E6E7中克隆得到PSMA7 cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接.双酶切和测序鉴定后,再将PSMA7片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上.构建好的pcDNA3.1(-)/PSMA7真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后,经脂质体转染法转入A549细胞株中,经CA18筛选,得到阳性克隆细胞株,再用RT-PCR及Westem blotting法检测转染后PS-MA7的mRNA及蛋白表达水平.结果 pcDNA3.1(-)/PSMA7质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实.目的 基因PSMA7的序列完全正确,真核表达质粒构建成功.RT-PCR检测显示,转染pcDNA3.1(-)/PSMA7组的PSMA7 mRNA表达水平(2.698±0.661)明显高于未转染组(1.243±0.176)和转染pcDNA3.1(-)组(1.198±0.514,P<0.05),后两者间无明显差异.Western blotting检测同样显示,转染pcDNA3.1(-)/PSMA7组的蛋白表达水平(1.978±0.661)明显高于未转染组(0.891±0.234)和转染pcDNA3.1(-)组(0.782±0.375,P<0.05),后两组间亦无明显差异.结论 成功构建了PSMA7基因的真核表达质粒,并建立了稳定表达PSMA7的A549细胞株,为后续研究奠定了基础.     

人hTERT基因的pCIneo真核表达载体的构建Q78

构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）片段的基因的pCIneo真核表达载体。方法：根据hTERTmRNA序列设计引物,人胚肾转化细胞系293总RNA反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增后克隆到载体pCIneo上,并进行酶切鉴定及测序。结果-酶切结果表明hTERT基因已经插入pCIneo真核表达载体,测序结果显示,核苷酸序列的同源性为99．89％,氨基酸序列的同源性为100％。结论：成功构建hTERT基因的pCIneo真核表达载体,为其下一步的研究奠定了基础。     

HSA—sTRAIL融合蛋白的表达质粒pPICZαA—HSA—sTRAIL的构建

目的:构建pPICZαA-HSA-sTRAIL真核表达质粒。方法:用PCR方法扩增sTRAIL基因,然后克隆入pPICZαA载体,构建pPICZαA-sTRAIL质粒,然后将HSA基因克隆入pPICZαA-sTRAIL质粒,构建pPICZαA-HSA-sTRAIL真核表达质粒。重组子均进行酶切鉴定和PCR鉴定,最后进行DNA测序验证。结果:PCR方法克隆出目的基因,并成功构建了pPICZαA-HSA-sTRAIL质粒。酶切鉴定、PCR鉴定和DNA测序均证明构建的表达质粒完全与预期一致。结论:成功构建了pPICZαA-HSA-sTRAIL真核表达质粒。     

生物素化标签真核表达载体的构建及其在蛋白检测中的应用

目的构建生物素化标签真核表达载体,利用生物素化蛋白检测快速、灵敏、简便的特点,对传统的Western印迹和pull down技术进行改进和优化。方法利用pCI neo载体骨架构建生物素化真核表达载体。将红色荧光蛋白插入表达载体,用辣根过氧化物酶标记的链亲和素对融合蛋白进行Western印迹检测;将萤火虫荧光素酶插入表达载体,利用pull down技术定量分析生物素化效率;将丙型肝炎病毒NS4B蛋白插入表达载体,通过pulldown技术研究丙型肝炎病毒NS4B蛋白的蛋白质间相互作用。结果构建的生物素标签真核表达载体能使目的蛋白生物素化。报告基因定量分析结果表明目的蛋白生物素化效率达72%。将该载体表达的融合蛋白应用于Western印迹和pull down技术中可实现无需特异性抗体的一步法快速检测。结论将生物素化标签真核表达载体用于Western印迹和pull down技术,建立了快速、灵敏、简便的融合蛋白质检测新方法,为生命科学领域提供了一种有利的研究工具和通用技术平台。     

pcDNA3.1+Ape1质粒转染对人脐静脉内皮细胞辐射敏感性的影响

目的 探讨pcDNA3.1+Ape1质粒转染对血管内皮细胞电离辐射敏感性的影响。方法 以pcDNA3.1+空载体转染、未转染细胞作对照,在细胞转染pcDNA3.1+Ape1质粒后48 h,给予3组细胞2、4、6和8 Gy高能X线照射,采用碱性单细胞凝胶电泳和克隆形成实验,分析在不同辐射剂量条件下pcDNA3.1+Ape1质粒转染对人脐静脉内皮细胞辐射敏感性的影响。结果 与未转染细胞相比,3 μg pcDNA3.1+Ape1质粒转染细胞的初始OTM和残存OTM值在2 Gy照射时显著降低(P<0.01),但8Gy照射时差异无统计学意义(P>0.05);SF₂显著增高(P<0.05),但SF₄、SF₆及SF₈的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 pcDNA3.1+Ape1质粒转染可增加内皮细胞对低剂量电离辐射的抵抗能力。     

不含POU结构域的八聚核苷酸结合蛋白(NONO)真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建小鼠的不包含POU结构域的八聚核苷酸结合蛋白(NONO)真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达和定位.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织总RNA,通过RT- PCR扩增得到NONO编码序列,将该序列克隆至带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,构建质粒pcDNA3-NONO-HA.通过PC...     

人野生型和突变型CITED2真核表达质粒的构建与表达

目的 构建人转录辅助因子CITED2突变型(c.573-578del6)及野生型真核表达质粒并检测两种重组质粒CITED2蛋白的表达情况.方法 分别以健康儿童和CITED2基因突变的先天性心脏病患儿血细胞DNA为模板,PCR定向克隆扩增野生型和突变型CITED2编码链,分别T/A克隆至pMD19-T simple质粒上,筛选出野生型和突变型CITED2的T载体重组质粒.应用DNA重组技术将T载体重组质粒上的CITED2基因片段亚克隆入真核表达载体pEGFP-C1,构建pEGFP-C1-wtCITED2和pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒,并分别转染至HEK293细胞,24h后在荧光显微镜下观察质粒转染情况,48h后应用流式细胞仪检测转染效率,Western blotting检测CITED2蛋白的表达.结果 成功构建了人野生型pEGFP-C1-wtCITED2和突变型pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒.转染至HEK293细胞后24h,在荧光显微镜下可观察到各转染组EGFP的表达,转染后48h流式细胞仪检测转染效率为50％ ～ 60％,Western blotting检测可见CITED2蛋白与EGFP的融合表达.结论 成功构建了人转录辅助因子CITED2突变型及野生型真核表达质粒,并检测到CITED2蛋白的表达.     

人源抗-HBsAg dsFv-IFN融合基因的构建及在CHO细胞中的表达

目的 :探讨用抗体工程技术研制乙型肝炎导向干扰素。方法 :在已有的抗HBsAg_dsFv的基础上 ,用重叠延伸PCR的方法将抗_HBsAg_dsFvVL 基因和α_干扰素基因连接 ,形成融合基因。为避免IFN与dsFv空间折叠的影响 ,其间引入 15个氨基酸的柔性短肽 ;分别构建重链VH 基因、轻链VL_IFN融合基因的CHO表达载体 ,共转染CHO细胞。结果 :从细胞培养上清中检测到有抗病毒活性的IFN存在 ,有抗_HBsAg活性 ,但dsFv与抗原的结合活性较低。结论 :本研究为研制乙肝导向干扰素奠定了基础。     

抑癌基因p27真核细胞表达质粒的构建

目的：构建抑癌基因P27真核细胞表达质粒，为研究P27在创面修复及瘢痕形成中的分子机制提供物质基础。方法：PCR法从含有P27全长的质粒中合成P27CDNA片段，连接酶连接至PUC19质粒测序，证明PCR产物序列完全正确，限制性酶切PUC19-P27，获得P27cDNA片段，连接酶连接至pcDNA3，克隆出真核表达质粒pcDNA3-P27。结果：PCR合成p27cDNA片段序列正确，凝胶电泳证明己将p27cDNA片段正确克隆到pcDNA3-P27中。结论：成功构建了抑癌基因p27的真核表达载体pcDNA-p27。