小鼠CD4~+ CD25~+ Foxp3~+调节性T细胞体外扩增

目的:本研究旨在探讨CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞体外扩增的方法。方法:采用磁珠分选小鼠CD4+T细胞,αCD3单克隆抗体包被24孔板,加入αCD28单克隆抗体、雷帕霉素、rhIL-2,培养3周后,流式细胞仪测定培养细胞中CD4+CD25+T细胞的含量,实时定量PCR检测CD4+CD25+T细胞Foxp3 mRNA的表达;单向混合淋巴细胞反应和增殖抑制试验测定扩增的CD4+CD25+T细胞的增殖及其抑制功能;ELISA检测培养上清中IL-10和TGF-β1的含量。结果:小鼠CD4+T细胞培养3周后,CD4+CD25+T细胞达(76.05±2.73)%,高于未加雷帕霉素组(52.17±1.36)%(P<0.001),磁珠分选的CD4+CD25+T细胞Foxp3 mRNA的表达是未加雷帕霉素组的5倍(P<0.001),增殖能力是未加雷帕霉素组的0.29倍(P<0.001),对CD4+T细胞增殖抑制能力是未加雷帕霉素组的3.6倍(P<0.001),培养上清中IL-10和TGF-β1分别是对照组的1.8倍和1.6倍(P<0.001)。结论:小鼠CD4+T细胞在含有1μg/ml的αCD28、rhIL-2 100 U/ml和终浓度为10 nmol/L雷帕霉素的培养体系中培养3周后能有效扩增CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞。     

小鼠CD4＋ CD25＋免疫调节性T细胞体外扩增及功能检测的研究

目的 探讨小鼠CD4＋ CD25＋调节性T细胞（Tregs）的体外扩增方法及扩增后Tregs的免疫功能.方法 利用免疫磁珠法分离小鼠Tregs;采用anti-CD3mAb＋rIL-2和Allo-APC＋rIL-2两种方法进行体外扩增,通过TRANSWELL培养系统、细胞因子表达及CFSE染色标记等方法检测Tregs免疫抑制作用的机制.结果 体外分离的Tregs纯度为89.5％;活细胞率约为98％.Tregs扩增的倍数在两组各时间点差异无统计学意义.扩增后CD4＋ CD25＋T细胞、CD4＋T细胞和CD4＋ CD25-T细胞的每分钟计数（CPM）分别为1 470、12 700和14 300.混合淋巴细胞反应（MLR）中当CD4＋：CD25＋T细胞的比例为1∶1时,抑制率为79％,比例为8∶1时,抑制率为33％.CFSE标记后,进入分裂周期的CD4＋T细胞的百分比在未加入CD4＋ CD25＋T细胞组为83.7％,加入CD4＋ CD25＋T细胞组为31.7％,差异具有统计学意义（P=0.0006）.CD4＋ CD25＋T细胞对CD4＋T细胞的增殖抑制率在Transwell和Non-Transwell的培养系统中分别为＜5％和95％.Transwell培养组中IL-2含量高于Non-Transwell组,差异具有统计学意义[Transwell培养组为（158.33±2.08）pg/mL,Non-Transwell组为（23.00±2.00） pg/mL,P ＜0.0001].结论 采用免疫磁珠法分离小鼠Tregs可行,Tregs可有效扩增;Tregs的作用机制为抑制CD4＋T细胞的增殖及抑制CD4＋T细胞分泌IL-2;其抑制作用需要细胞-细胞间接触;体外扩增后的Tregs仍具有免疫特性,其体外免疫抑制作用增强.     

人CD4~+CD25~+调节性T细胞体外扩增研究

目的:建立有效的体外培养扩增人CD4+CD25+Treg细胞的体系,为临床输注供者来源的CD4+CD25+细胞抑制急性移植物抗宿主病(Auctegraft versus host disease,aGVHD)提供实验基础。方法:用免疫磁珠分选法从健康人外周血淋巴细胞中得到CD4+T细胞、CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+Treg细胞。分别进行长期培养、扩增;流式分析其表型及FOXP3表达,MTT法检测体外扩增的CD4+CD25+Treg对自体和异体的CD4+T细胞增殖的抑制作用。结果:经过3周培养,三组细胞均有明显的扩增。磁珠分选后的CD4+CD25+Treg细胞的扩增倍数为(20±8)倍,细胞纯度由89.28%±2.43%下降到76.36%±2.38%。CD4+CD25-T细胞组扩增迅速,倍数为(110±21)倍,并且CD4+CD25+Treg细胞的比例由培养前0.55%±0.27%增加到53.73%±3.81%。CD4+T细胞组扩增倍数为(89±8)倍,并且CD4+CD25+Treg细胞的比例由10.63%±3.87%增加到70.93%±1.71%。体外抑制实验显示体外扩增的CD4+CD25+T细胞对自体和异体的CD4+T细胞增殖均有明显的抑制作用,并且随着效靶比浓度的降低而降低。而且其各浓度梯度的抑制作用在自体和异体之间无明显的差异。结论:我们在体外成功扩增了CD4+CD25+Treg细胞,并且具有免疫抑制功能,其中CD4+T细胞组扩增倍数大,细胞数量多,细胞纯度有很大提高,方法简便,有望应用于临床试验。     

主动免疫治疗前后原因不明复发性流产CD4~+ CD25~+调节性T细胞数量与功能变化的研究

目的探讨CD4+ CD25+调节性T细胞(Tr)在原因不明复发性流产(URSA)患者主动免疫治疗中的作用。方法徐州妇幼保健院对2009.03至2009.11就诊于门诊的20例URSA患者,采用双荧光标记流式细胞分析技术,通过体外增殖抑制实验计算抑制率来评价检测其淋巴细胞主动免疫治疗前后外周血CD4+ CD25brightTr数量与功能的变化。结果主动免没治疗后URSA组外周血中CD4+ CD25brightTr数量较治疗前明显增加,功能明显增强(P0.05)。主动免疫治疗后,妊娠成功的妇女CD4+ CD25brightTr较妊娠失败者数量和功能明显改善。结论主动免疫治疗可提高外周血CD4+ CD25brightTr数量,使功能增强。CD4+CD25brightTr可能在调控母胎界面局部免疫耐受中起到重要作用,有可能成为URSA患者主动免疫治疗的监测指标之一。     

CD4+ CD25+调节性T细胞在流产中的研究进展

CD4+CD25+调节性T细胞(Tr)是一个具有独特免疫调节功能的T细胞亚群.Tr免疫学特性主要在于抑制自身反应性T细胞的活化,并参与外周免疫耐受,对维持机体内环境的稳定起重要作用.Tr在流产中发挥重要的免疫调节作用.     

CD4~+CD25~+调节性T细胞和肿瘤免疫

近期研究发现一个有独特免疫调节功能的T细胞亚群 :CD4 + CD2 5 + 调节性T细胞 ,不仅能抑制自身免疫性疾病发生 ,还可能参与肿瘤免疫的调节。这群细胞具有免疫无能和免疫抑制特性 ,通过与细胞直接接触发挥作用 ,而不依赖于其分泌的细胞因子。肿瘤环境中CD4 + CD2 5 + 调节性T细胞比例增加 ,导致肿瘤免疫失调 ,去除这群细胞可有效诱导肿瘤免疫 ,为肿瘤治疗提供了一种新的方法。     

CD4+CD25+调节性T细胞对B细胞免疫应答的抑制作用

CD4 CD25 调节性T细胞(CD4 CD25 Treg细胞)主要来源于胸腺,在体内外抑制CD4 或CD8 T细胞的活化及增殖,是维持自身免疫耐受的重要机制之一。近来研究发现该调节性T细胞除了能够抑制T细胞的免疫应答外,还能够抑制B细胞免疫应答,包括抑制B细胞活化和抗体生成,从而抑制主要由抗体介导的自身免疫性疾病的发生。     

CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞在子宫内膜癌患者外周血中的表达及意义

探讨在子宫内膜癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的表达情况及意义。采用流式细胞术检测84例术前子宫内膜癌患者及40例子宫肌瘤患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+细胞比例及Foxp3平均荧光强度,采用qRT-PCR检测两组患者外周血中Foxp3的mRNA表达情况,同时采用ELISA检测外周血中TGF-β1和IL-17含量。与子宫肌瘤组比较,子宫内膜癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例虽略有升高但没有统计学意义(P=0.08),而CD4+CD25+细胞内Foxp3的平均荧光强度明显升高(P<0.001)。子宫内膜癌患者外周血中Foxp3的mRNA表达要明显多于子宫肌瘤组(P<0.001)。子宫内膜癌患者外周血中TGF-β1、IL-17的含量要多于子宫肌瘤组。子宫内膜癌患者外周血中的Foxp3+Treg细胞表达增多,这些细胞可能通过增加细胞因子TGF-β和IL-17的分泌从而调节机体对肿瘤细胞免疫反应的方向,最终促进子宫内膜癌的发生和发展。     

树突状细胞扩增抗原特异性CD4+ CD25+调节性T细胞研究进展

CD4+CD25+调节性T细胞(Tr)是同时具有免疫低反应性和免疫抑制性功能两大特征的T细胞.研究证实,CD4+ CD25+ Tr在抑制器官特异性自身免疫性疾病及GVHD是抗原特异性的,因此,应用器官特异性而不是多克隆性的Tr将大大促进以Tr为基础的免疫治疗.而具有调节活性的CD4+ CD25+ Tr仅占人类外周血CIM+ T细胞的1%～2%,因此,研究体外大量扩增的方法 对于以Tr基础的治疗至关重要.研究表明,树突状细胞(DC)作为机体强有力的专职抗原递呈细胞可以扩增具有抗原特异性的CD4+ CD25+ Tr且能增加后者的抑制活性,这为治疗自身免疫性疾病及GVHD提供了新的治疗前景.     

ConA对CD4~+CD25~+调节性T细胞早期活化和功能的影响

目的:观察常用丝裂原ConA对CD4+CD25+调节性T细胞抑制功能的影响与早期活化标志CD69之间的关系。方法:用免疫磁珠分离BALB/c小鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25-效应性T细胞,加入不同浓度的ConA,12 h后收集细胞,流式细胞术分析其CD69的表达。CFSE标记CD4+CD25-效应性T细胞,按2∶1比例与CD4+CD25+调节性T细胞共同培养,培养同时加ConA,3 d后流式细胞仪分析ConA对CD4+CD25+调节性T细胞抑制CD4+CD25-效应性T细胞增殖的影响。结果:ConA能剂量依赖性地升高CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25-效应性T细胞CD69的表达,对两群细胞CD69的升高表现出了相似的作用;另外,ConA在上述浓度能剂量依赖激活CD4+CD25+调节性T细胞的抑制功能。结论:ConA在体外对CD4+CD25+调节性T细胞活化和功能具有促进作用。ConA能一定程度模拟抗原,因而可用于评价药物对调节性T细胞的活化和功能影响。     

过继转输TSA诱导的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞对不明原因复发性流产的治疗作用

目的观察过继转输TSA诱导的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（CD4＋CD25＋Treg）对不明原因流产的作用机制及妊娠预后的影响。方法以雌性CBA/J×雄性BALB/c为正常妊娠模型,以雌性CBA/J×雄性DBA/2J为自然流产模型,使用免疫磁珠方法分选雌性CBA/J小鼠脾脏CD4^＋CD25^＋Treg细胞,并使用流式细胞术检测分选纯度。采用TSA对流产孕鼠外周CD4^＋/CD25^-T细胞Foxp3基因特定位点进行表观修饰,以实现Foxp3稳定、持久的表达,并将CD4^＋Treg分别转输至流产模型孕4d（着床期）的雌性CBA/J孕鼠,于孕14d分别观察宿主孕鼠的胚胎吸收率。结果与对照组比较,过继转输TSA诱导的CD4^＋CD25^＋Treg细胞的宿主孕鼠的胚胎吸收率（11.27%）显著下降。结论孕早期过继转输TSA诱导的CD4^＋CD25^＋Treg细胞疗法能诱导宿主母胎免疫耐受,有利于妊娠的维持。     

CD4^＋CD25^＋FOXP3^＋调节性T细胞在与原因不明反复自然流产的相关性研究

目的探讨外周血中CD4＋CD25＋FOXP3＋调节性T细胞（CD4^＋CD25^＋FOXP3^＋Tr）在原因不明反复自然流产（URSA）发病中的作用。方法应用三色荧光标记流式细胞术检测21例原因不明反复自然流产妇女（URSA组）、20例正常妊娠妇女（正常对照组）外周血中CD4^＋CD25^＋FOXP3^＋Tr及T细胞亚群水平的表达情况。结果URSA组妇女外周血中CD4^＋CD25^＋FOXP3^＋Tr表达率为（1.36±0.61）%,明显低于正常对照组（5.59±1.02）%,两组比较差异显著（P（0.05）,但两组相比较外周血中T细胞亚群CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋、CD4^＋/CD8^＋水平无显著差异（P（0.05）。结论原因不明反复自然流产的发生可能与患者外周血中CD4^＋CD25^＋FOXP3^＋Tr数量减少有关。     

CD4+CD25+免疫调节性T细胞对CD4+T细胞介导的移植物抗宿主病预防作用的研究

目的研究CD4+CD25+免疫调节性T(Treg)细胞在小鼠骨髓移植后,对移植物抗宿主病的预防作用及其作用机制.方法用C3H(H-2k)小鼠骨髓作为供体,提取C3H(H-2k)小鼠CD4+T及CD4+CD25+T细胞,C3H×B6(H-2k/b)F1小鼠为骨髓移植的受者.在受者接受致死量全身放射后,输注供者去除T细胞的骨髓(ATBM),使其造血功能重建(ATBM组).于不同的实验组给予CD4+(CD4组)T细胞,CD4+CD25+T(CD25组)或二者同时输注(CD4/CD25组).观察各组小鼠移植物抗宿主病(GVHD)的发生率.结果所有10只ATBM组小鼠至骨髓移植后60天仍全部存活,无GVHD发生;所有10只CD4组小鼠在骨髓移植10天内全部死于GVHD(P＜0.01);所有5只CD25组小鼠于骨髓移植后60天仍全部存活,无明显GVHD发生(P＞0.05);同样,所有6只CD4/CD25组小鼠至骨髓移植后仍全部存活,无明显GVHD发生(P＞0.05).结论在同种异基因小鼠的骨髓移植模型中,CD4+CD25+T不诱导GVHD的发生,并有预防CD4+T细胞介导的GVHD发生的作用.     

CD4+CD25+调节性T细胞在肿瘤免疫中的作用

CD4+CD25+调节性T细胞(Tr)是体内自然发生的调节性T细胞的重要亚群,具有无反应性和免疫抑制两大特性,主要通过与靶细胞的直接接触而起作用,其在体内不仅参与自身免疫性疾病、移植排斥反应等,还在肿瘤的发生、发展及免疫治疗中发挥重要作用.近几年来,Tr在肿瘤免疫中的作用倍受关注.     

CD4+CD25+Treg在急性淋巴细胞白血病患者外周血中的表达及其体外实验研究

目的初步探讨CD4 CD25 调节性T细胞(CD4 CD25 regulatory T cells,CD4 CD25 Treg)在急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL)患者化疗前及化疗缓解后外周血中的表达水平,并研究患者血清能否诱导外周血CD4 CD25-T细胞转化为CD4 CD25 Treg。方法①采用流式细胞术分别检测ALL初诊组、化疗完全缓解或部分缓解组及正常对照组外周血中CD4 CD25 T细胞所占比例,然后通过荧光定量RT-PCR检测各组外周血中转录因子Foxp3mRNA的表达水平,并逐层分析比较。②采集正常人外周血单个核细胞后,对照组用正常人血清,实验组用患者血清并分别设浓度梯度进行培养,72h后采用流式细胞术、荧光定量RT-PCR分别检测CD4 CD25 T细胞和Foxp3mRNA表达。结果ALL化疗缓解组CD4 CD25 T细胞及Foxp3mRNA表达水平均明显高于ALL初诊组和正常对照组(P<0.05),后两者之间CD4 CD25 T细胞水平无统计学差异(P>0.05),但ALL初诊组Foxp3mRNA含量较正常对照组明显升高(P<0.01),差异具有统计学意义;并且血清培养对照组CD4 CD25 T细胞水平及Foxp3mRNA含量均明显低于实验组(P<0.05),且其表达并不随血清浓度的增加而升高。结论CD4 CD25 Foxp3 Treg在ALL初诊组及化疗缓解组患者外周血中比例明显升高,且初步表明患者血清中的可溶性物质可诱导外周血CD4 CD25 T细胞转化为CD4 CD25 Treg,提示CD4 CD25 Treg可能是ALL免疫抑制的一个重要原因。     

慢性乙型肝炎患者外周血CD4~+CD25~+Treg与CD4~+和CD8~+ T淋巴细胞亚群的相关研究

目的:探讨慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的含量和CD4+CD8+T淋巴细胞亚群分布,两者之间相关性及与HBV的相关性。方法:采用流式细胞术检测50例慢性乙型肝炎患者和20例健康对照者外周血中CD4+CD25high、CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达及CD3/CD4/CD8 T淋巴细胞亚群,荧光定量PCR法检测HBV DNA含量。结果:慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25highTreg明显高于健康对照组(P0.01),且随HBV DNA载量增加,患者外周血中CD4+CD25highTreg细胞的水平逐渐升高。慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞也相应增高,且与CD4+CD25highTreg细胞的变化成正相关(r=0.890,P0.001)。与健康对照组比较,患者组CD4+T细胞百分率及CD4+/CD8+比值均降低,而CD3+T细胞和CD8+T细胞百分率差异无显著性(P0.05)。CD4+CD25highTreg细胞与HBV DNA取对数后成正相关(r=0.782,P0.001),与谷丙转氨酶(ALT)成正相关(r=0.432,P0.005);与CD3+、CD4+、CD8+T细胞水平及CD4+/CD8+比值均无相关性(P0.05)。CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD4+/CD8+比值与HBV DNA载量之间亦无相关性(P0.05)。结论:慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞增高,且与HBV的复制水平及ALT增高具有一致性,而T细胞亚群是否可作为监测CHB患者免疫状态的指标需进一步探讨。