含癌胚抗原片段的重组腺相关病毒转染树突状细胞疫苗的体外杀伤作用

目的：观察研究人外周血单核细胞来源的树突状细胞（DC）转染含癌胚抗原（CEA）片段的重组腺相关病毒后所诱导的特异性T细胞对直肠癌细胞株LOVO和SW480的体外杀伤作用。方法：抽取HLA表型为A11的健康志愿者外周血，分离单核细胞，体外培养，使用含CEA片断的重组腺相关病毒转染未成熟DC，诱导特异性T细胞。检测体外培养的DC和CTL活性，并使用MTT法检测细胞毒性T细胞（CTL）对LOVO细胞的杀伤作用。结果：转染或未转染的体外培养的成熟DC高表达CD40、CD86、IL-12，诱导的细胞毒性T细胞高表达IFN-γ；转染后DC诱导特异性细胞毒性T细胞可有效识别并杀伤HLA-A11阳性的LOVO细胞。结论：重组腺相关病毒转染DC，不明显改变DC表型和刺激淋巴细胞增殖、分化功能，可诱导自体细胞毒性T细胞增殖，含CEA片断的腺相关病毒转染DC诱导自体细胞毒性T细胞对LOVO细胞有明显杀伤作用，DC疫苗可以作为直肠癌患者免疫治疗的有效补充。     

人外周血单核细胞来源树突状细胞转染重组腺相关病毒诱导特异性T细胞的效应

目的:观察人外周血单核细胞来源的树突状细胞转染含前列腺特异性抗原片段的重组腺相关病毒后,其所诱导的特异性T细胞对前列腺癌细胞株LNCaP和DU145的体外杀伤抑制作用。方法:实验于2006-05/10在南方医院肿瘤科生物室完成。①对象:HLA-A2基因亚型的健康自愿供血者1名,对本实验知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准。作为靶细胞的前列腺癌细胞株LNCaP、DU145以及携带前列腺特异性抗原基因的重组腺相关病毒由美国阿肯色大学生物治疗中心刘勇教授惠赠。②实验方法:抽取HLA表型为A2的健康自愿供血者外周血50mL,Ficoll法分离单核细胞体外培养,磷酸盐缓冲液洗涤6孔板,收集悬浮细胞作为效应T细胞,贴壁细胞即为树突状细胞。向6孔板内加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和携带前列腺特异性抗原基因的重组腺相关病毒,第4天加入白细胞介素4,第6天加入肿瘤坏死因子α,至培养第7天收获悬浮细胞即为成熟的树突状细胞。③实验评估:应用流式细胞仪检测树突状细胞表面分子标记的表达。以ELISA法检测树突状细胞分泌白细胞介素12的含量。将成熟树突状细胞与效应T细胞分别按1:10、1:20、1:40进行共培养,将未经过树突状细胞共育的T细胞设置为空白对照组,ELISA法检测效应T细胞分泌干扰素γ的含量。LNCaP、DU145靶细胞分别与效应T细胞按效靶比5:1、10:1、20:1、40:1进行共培养,MTT法检测效应T细胞对两种靶细胞的杀伤作用。结果:①树突状细胞表面分子标记的表达:经携带前列腺特异性抗原基因的重组腺相关病毒致敏后的树突状细胞,培养8d后高表达CD83.CD40.HLA-DR,CD80,CD1a,CD86,分别为65.8%,66.0%,96.7%,70.0%,61.9%.79.0%。②树突状细胞释放白细胞介素12含量检测:与培养第1天比较,第7天成熟树突状细胞释放白细胞介素12的含量显著升高(P<0.05)。③效应T细胞释放干扰素γ含量检测:与空白对照组比较,树突状细胞:T细胞按1:10、1:20、1:40共培养后所释放的干扰素γ含量均明显升高(P<0.01.0.01,0.05),且随树突状细胞加入比例的提高有所增加。④效应T细胞的细胞毒性作用检测:效应T细胞可有效识别并杀伤HLA-A2阳性的LNCaP细胞,其抑制作用在效靶比为10:1、20:1、40:1时均显著强于DU145细胞株(P<0.01)。结论:经携带前列腺特异性抗原基因的重组腺相关病毒转染后的树突状细胞,其细胞表型和刺激淋巴细胞增殖、分化的功能无明显改变,可诱导自体效应T细胞增殖,该效应T细胞对LNCaP细胞具有明显杀伤作用。     

人脐血树突状细胞体外诱导抗白血病细胞毒效应

为了体外观察树突状细胞 (DC)诱导的抗白血病细胞毒效应 ,采用细胞因子组合体外扩增培养脐血单个核细胞 (CBMNC) ,对产生的DC进行形态学观察、免疫表型检测和功能鉴定 ;用DC制备细胞毒T淋巴细胞 (CTL)和51Cr释放法测定CTL的溶靶细胞毒性。结果表明 :CBMNC中T细胞亚群与成人外周血相似 ;CD1a阳性细胞含量极少 ,仅为 (0 .4 1± 0 .0 9) % ;在DC扩增培养过程中 ,DC形态发生明显变化 ,胞体变大 ,形态不规则 ,有的细胞出现毛刺状突起 ,有的细胞出现粗大树根状突起 ;在培养 15天时 ,细胞群中CD1a阳性细胞达 (2 8.4± 3.5 5 ) % ,有 (6 3.6 7± 2 3.33) %的细胞表达CD86 ,(8.7± 1.4 9) %的细胞表达CD83,(32 .5± 1.5 3) %的细胞表达HLA DR ;产生的DC对异基因淋巴细胞具有明显的增殖刺激作用 ;经冻融的HL 6 0全细胞抗原脉冲的DC致敏自体T淋巴细胞产生的CTL对HL 6 0细胞具有特异性细胞毒效应。结论 :本研究中的脐血DC培养体系能产生较高含量的DC ,脐血DC在体外能诱导产生抗白血病细胞毒效应。     

腺相关病毒介导癌胚抗原转染树突状细胞对免疫功能的调节作用

目的:近年来,树突状细胞参与调节作用的研究较多。实验拟验证重组腺相关病毒(rAAV)介导癌胚抗原基因转染树突状细胞后其的免疫调节作用的变化。方法:实验于2006-06/2006-11在美国阿肯色大学医学院基因治疗中心完成。①实验方法:取健康人外周血(自愿捐献),采用改良Ficoll密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞,取贴壁细胞,分为rAAV/CEA转染组和空白对照组,均采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4、肿瘤坏死因子-α诱导树突状细胞前体细胞成熟,将成熟树突状细胞与末梢血淋巴细胞按比例混合培养,可得到激活的细胞毒性T淋巴细胞。②实验评估:采用流式细胞仪检测树突状细胞表面标志表达,细胞毒性T淋巴细胞的免疫表型变化,细胞毒性T淋巴细胞γ-干扰素表达。采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测树突状细胞的白细胞介素12和白细胞介素10表达。结果:①rAAV/CEA转染树突状细胞的CD14较空白对照组降低,共刺激分子CD40、CD80、CD83、CD86表达均较空白对照组高。②成熟树突状细胞细胞因子表达中,rAAV/CEA转染组的白细胞介素12较空白对照组升高,白细胞介素10降低。③与空白对照组比较,rAAV/CEA转染组能高表达CD8 T细胞和其表型CD69,CD8/CD56的T细胞比例上调,CD25 CD4 的T细胞减少。④rAAV/CEA转染的细胞毒性T淋巴细胞表达相对较高水平的γ-干扰素,与杀伤实验结果相吻合。结论:rAAV/CEA转染树突状细胞能够激活细胞毒性T淋巴细胞的特异性杀伤作用,与树突状细胞和细胞毒性T淋巴细胞等免疫细胞表面标志变化和细胞内细胞因子水平变化相关。     

K562细胞RNA负载人树突状细胞后体外诱导特异性CTL的研究

目的探讨人的树突状细胞(dendriticcell,DC)体外经K562细胞株总RNA转染后,能否诱导出p210蛋白表达,并诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。方法自健康人浓缩白细胞制品(白膜)分离有粘附特性的单核细胞(PBMC),经GMCSF、IL4培养5d后,获得未成熟的DC(imatureDC,imDC);体外以脂质体DOTAP或直接电穿孔转染K562细胞总RNA。抽提转染前后以及转染24h后的DC内RNA进行RTPCR检测,Westernblot分析p210蛋白表达,以及诱导CTL杀伤K562细胞功能检测等。PBMC以每组5×106/ml,分别在不同组分的培养液中培养DC,通过细胞计数、流式细胞仪测定CD1a表达、细胞纯度来估计制备效果。结果RTPCR检测表明DC经K562总RNA转染后,细胞内出现BcrAbl的cDNA条带,24h后消失。Westernblot试验表明转染24h后,开始表达p210特征性蛋白;并且明显促进T细胞对K562的杀伤活性。1%自体血浆体积分数RPMI1640培养的DC的CD1a表达量最高,并且细胞获得数量也仅屈居第二,为总体评价较高的一组。结论应用肿瘤总RNA负载DC来制备DC疫苗具有可行性,预示改良的DC疫苗抗肿瘤的广泛应用前景。     

体外诱导人脐血树突状细胞介导T细胞抗白血病的细胞毒性效应研究

为了研究脐血淋巴细胞能否在体外培养成为特异性杀伤白血病细胞的杀伤性T细胞(CTL),联合细胞因子体外诱导脐血单个核细胞分化为树突状细胞(DC),再吞噬凋亡白血病细胞并将其抗原呈递给相同脐血的T淋巴细胞,得到杀伤性T细胞。用形态学及流式细胞术检测DC。CTL细胞的杀伤功能用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定。结果表明:12份脐血标本均可培养出形态典型的DC,DC的表面标志CD1a 、HLA DR 、CD86 、CD83 表达水平显著升高(P<0.05)。CTL可以杀伤未经培养的白血病细胞(效∶靶=50∶1对AML细胞的平均杀伤率为44.76±17.42%,对ALL细胞的平均杀伤率为8.50±4.25%),对相同患者缓解期的骨髓细胞杀伤率极低。结论: 在外体应用多种细胞因子刺激可诱导脐血单个核细胞分化成典型的DC;负载有白血病抗原的DC可诱导同一脐血的淋巴细胞生成白血病特异的杀伤性T细胞(CTL),所得CTL可特异性杀伤未经培养的白血病细胞而不严重伤害相同患者缓解期的骨髓细胞。     

细胞膜表达的HLA-G诱导免疫耐受性树突状细胞的产生

为了探讨体外诱导免疫耐受性树突状细胞（dendritic cell,DC）产生的方法及其机制,利用人HLA-G1真核表达载体转染K562细胞并与DC共培养后,用流式细胞术检测DC表面CD80、CD86、ILT3和ILT4分子表达情况,同时采用氚胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法检测DC对T细胞功能的影响。结果表明,膜表达的HLA-G1分子与树突状细胞作用后,DC表面免疫共刺激分子CD80、CD86表达下调,而抑制性分子ILT3、ILT4表达上调。HLA-G1作用后DC异基因抗原诱导淋巴细胞增殖的活性明显下降。结论：HLA-G1分子可以在体外条件下,下调DC表面免疫共刺激分子水平,促进ILT3、ILT4表达,诱导免疫耐受性树突状细胞产生。     

人工抗原呈递细胞复合物体外诱导特异性T淋巴细胞活化的研究

本研究旨在以人工抗原呈递细胞（artificial antigen—presenting cells，amPfs）体外模拟树突状细胞生物学功能，探讨诱导特异性T淋巴细胞活化、增殖的作用。以磁性微珠为载体，选取慢性髓系白血病特异性抗原CML28作为目标抗原肽，通过抗原表位预测软件获取CML28表位序列（Vltfaedsv），并以该抗原表位与MHC分子（HLA—A2-Ig）偶联，作为第一信号分子，B7—1分子作为第二信号分子，将两种信号分子同时负载于磁珠表面，构建人工APC复合体；取HLA—A2^＋的健康骨髓捐赠者骨髓单个核细胞，以磁珠分选出CD8^＋T淋巴细胞并与人工APC复合体系统共培养。培养过程中加入羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（5，6-carboxylfluorescin diacetate succinimidyl ester，CFSE），并以此检测T细胞增殖，用流式细胞仪检测特异性T细胞增殖程度。结果发现：实验组中CML28一特异性T细胞增殖程度明显增高，实验组平均值为（17.34±0．35）％，对照组平均值为（2．25±0．43）％，两者比较差异显著（P〈0．01）。结论：人工APC复合体系统在体外能模拟人体抗原呈递细胞，刺激CD8^＋T特异性淋巴细胞活化、增殖。     

成人外周血来源的树突状细胞的体外诱导

目的:以外周血单核细胞为前体细胞,建立体外诱导树突状细胞(dendriticcell,DC)的方法。方法:用密度梯度离心法、贴壁法从健康人外周血获取单核细胞,加入IL-4、GM-CSF和TNF-α培养7～9d成为DC,进行细胞形态学、表面标志及混和淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction,MLR)的鉴定。结果:外周血单核细胞经诱导培养后,具有典型的树突状形态特征,表达高水平的MHC-II类抗原和CD86共刺激分子以及多种表面标志,在MLR中能有效地刺激同种异体的淋巴细胞增殖。结论:外周血单核细胞可以成功地诱导为具有典型形态特征及功能的DC。     

HA-1树突状细胞核酸疫苗的构建及其特异性CTL的诱导

本研究以次要组织相容性抗原HA-1为靶点，构建HA-1树突状细胞核酸疫苗用于造血干细胞移植后抗白血病治疗。体外培养移植供者树突状细胞，用流式细胞术、混合淋巴细胞反应检测其免疫活性，通过电转法将HA-1基因转染树突状细胞，构建树突状细胞核酸疫苗。48小时后检测HA-1蛋白表达情况。将转染后的树突状细胞与同基因淋巴细胞共孵育诱导特异性CTL，应用LDH释放实验检测其体外杀伤活性。结果表明：经外周血单核细胞诱导的树突状细胞表达树突状细胞表型，能刺激同种淋巴细胞增殖。电转48小时后，Western blot可检测到HA-1蛋白表达。诱导的CTL体外杀伤活性高于对照组。结论：次要组织相容性抗原HA-1可作为造血干细胞移植后抗白血病治疗的靶点。     

慢性髓性白血病人源树突状细胞的细胞毒作用及其体外扩增

本研究观察来源于慢性髓性白血病患者的CD34 细胞经两步培养扩增后产生的树突状细胞的抗白血病 免疫功能。从慢性髓性白血病患者骨髓或外周血中分离出CD34 细胞或外周血单个核细胞分别进行两步培养。 首先将其与rhFlt3-L和rhTPO共育7天,再与rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4共同培养14天,以诱导树突状细胞产 生:同时以rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4直接诱导体系作对照。获得的DC通过流式细胞仪检测免疫表型,电镜分 析细胞超微结构及G显带法进行的染色体分析后,并用MTT法检测DC刺激T细胞增殖能力及T细胞对CML细 胞的杀伤作用.结果表明:慢性髓性白血病的CD34 细胞经过rhFlt3-L和rhTPO的初始扩增培养7天后,CD34 细 胞总数扩增77±5倍。用rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4诱导培养14天,DC产率达到(39±8)％,细胞扩增倍数及 DC比例均明显高于直接诱导产生的培养方法(P<0.01),且此DC能刺激自体或异体T细胞增殖,进而杀伤CML 细胞。结论:两步法体外扩增培养可明显提高DC前体总数及产率,优于直接诱导培养;CML细胞来源的DC可诱 导产生抗白血病免疫反应。     

慢性粒细胞白血病树突状细胞对特异性抗白血病T细胞的作用

树突状细胞（ＤＣ）是有效的抗原呈递细胞,我们从初诊慢性粒细胞白血病慢性期（ＣＭＬＣＰ）患者的外周血中培养出ＤＣ,探讨其对特异性抗白血病Ｔ细胞（ＡｎｔｉＬＢＴ）的作用。病例和方法１　病例　初诊ＣＭＬＣＰ患者１６例。均有ｔ（９;２２）染色体异常。其中男１０例,女６例。年龄３２（１８～４５）岁。分别将与其中６例患者ＨＬＡ相合的６名健康亲属作为正常对照。２　单个核细胞（ＭＮＣ）的分离制备　取肝素抗凝的外周血或骨髓２～３ｍｌ,按文献［１］分离外周血单个核细胞（ＰＢＭＮＣ）或骨髓单个核细胞（ＢＭＭＮ…     

骨髓细胞来源的树突状细胞体外刺激T淋巴细胞增殖的研究

分离骨髓单核细胞,在一定的培养条件下将其诱导成树突状细胞,通过混合淋巴细胞反应检测这些树突状细胞的体外刺激T淋巴细胞增殖的能力.     

人树突状细胞体外诱导分化扩增方法

树突状细胞(DC)是目前已发现的抗原递呈功能最强的抗原递呈细胞。来源于人外周血单核细胞和骨髓/脐血CD34~ 造血干细胞在体外经不同培养体系诱导后,能得到具有一定数量的功能性DC,表现为典型的形态、表型和功能特征,为今后的临床应用提供基础。     

CMVpp65基因修饰的树突状细胞刺激自身T细胞活化

巨细胞病毒（CMV）感染易发生于慢性移植物抗宿主病（cGVHD）患者，其特异性免疫依赖于T细胞活性。本研究探讨CMVpp65基因修饰的树突状细胞（DC）对自身T细胞的活化作用。采用具有高效转染非分裂细胞的慢病毒系统将CMV全长pp65基因导入鼠源性DC；采用CpG—DNA诱导DC细胞成熟；采用流式细胞术及免疫荧光方法测定T淋巴细胞抗原及IFNγ表达。结果表明：慢病毒感染DC的感染复数（multiplicity of infection，MOI）为50，最佳感染效率可达30％-40％；表达pp65基因的成熟DC能刺激自身naiveT细胞表达CD69；表达PP65蛋白的成熟DC能够刺激自身CD4^＋或CD8^＋T细胞分泌IFNγ。结论：pp65基因修饰、CpG—DNA诱导成熟的DC能体外激活CMV特异性T淋巴细胞。     

慢性髓性白血病来源的树突状细胞的功能研究

为研究慢性髓性白血病（ＣＭＬ）来源的树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ,ＤＣ）的功能,将ＣＭＬ骨髓和外周血单个核细胞在含ＧＭ－ＣＳＦ,ＩＬ－４,ＴＮＦ－α的培养基中培养７－１４天。利用流式细胞术对培养细胞进行表型鉴定,通过ＦＩＴＣ－ＤＸ（ＦＩＴＣ标记的葡聚糖）摄入实验,＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入和ＭＴＴ实验,以及ＬＤＨ释放试验,分别检测不成熟ＤＣ对外源抗原的摄入能力,成熟ＤＣ对外源和内源抗原的呈递能     

慢性HBV感染者外周血树突状细胞和T细胞体外应答功能的检测和分析

目的探讨慢性HBV感染者外周血树突状细胞(DC)和T细胞对激活剂体外应答的功能.方法用三色荧光染色法,通过流式细胞仪检测静息期和经激活剂激活后CD11c+DC和CD3+/CD4+/CD69+T细胞的百分率.结果与接种过乙型肝炎疫苗、血中抗HBs阳性健康者相比,感染者组CD11c+型DC及其表达CD80和CD40共刺激分子的阳性细胞百分率,以及经CD2/CD2R强激活剂刺激后CD69+T细胞百分率等三项指标均呈明显低下的状态.结论慢性HBV感染者血中DC和T细胞对激活剂的体外刺激,均表现不同程度的应答功能低下或缺陷,本研究涉及的三项细胞免疫检测方法有利于深入了解机体对病原体应答的能力,其结果有助于阐明发病机理,可为临床拟定慢性HBV感染者免疫辩证治疗措施提供科学的有针对性的依据.     

慢性HBV感染者外周血树突状细胞和T细胞体外应答功能的检测和分析

目的　探讨慢性HBV感染者外周血树突状细胞 (DC)和T细胞对激活剂体外应答的功能。方法　用三色荧光染色法 ,通过流式细胞仪检测静息期和经激活剂激活后CD11c DC和CD3 /CD4 /CD69 T细胞的百分率。结果　与接种过乙型肝炎疫苗、血中抗HBs阳性健康者相比 ,感染者组CD11c 型DC及其表达CD80和CD40共刺激分子的阳性细胞百分率 ,以及经CD2 /CD2R强激活剂刺激后CD69 T细胞百分率等三项指标均呈明显低下的状态。结论　慢性HBV感染者血中DC和T细胞对激活剂的体外刺激 ,均表现不同程度的应答功能低下或缺陷 ,本研究涉及的三项细胞免疫检测方法有利于深入了解机体对病原体应答的能力 ,其结果有助于阐明发病机理 ,可为临床拟定慢性HBV感染者免疫辩证治疗措施提供科学的有针对性的依据     

EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞体外诱导培养及杀伤效果鉴定

本研究旨在探讨EB病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（EBV-CTL）体外诱导和扩增培养的方法,并检测其特异性杀伤的效果。采集EBV血清抗体阳性的6例正常供体的外周血单个核细胞（PBMNC）,用EBV转化的B淋巴细胞系（BLCL）作为抗原递呈细胞及抗原刺激剂,经辐照灭活后不断刺激培养自体PBMNC,诱导产生EBV-CTL,并将其扩增培养;采用流式细胞仪鉴定其免疫表型,然后检测不同效靶细胞比例条件下EBV-CTL对自体BLCL（autoBLCL）、自体植物血凝素培养的B淋巴母细胞（PHA-blast）、HLA不合供体的BLCL（alloBLCL）、飚62细胞株的杀伤效果。结果表明,6例EBV血清抗体阳性正常供体来源的PBMNC在体外成功筛选并扩增培养了EBV。CTL,扩增效率为PBMNC数的18．6-55．0倍。刺激10次培养后的EBV-CTL对autoBLCL在20：1、10：1、5：1三种效靶细胞比例条件下特异性杀伤效率的平均值分别为59．4％、43．2％、29．O％;对PHA-blast、alloBLCL、K562的非特异性杀伤率在上述三种效靶细胞比例下平均值依次为7．1％、9．4％、10．3％（P〈0．05）,6．6％、8．3％、8．1％（P〈0．05）,5．4％、7．3％、6．3％（P〈0．05）。结论：EBV-CTL能有效在体外筛选培养并扩增,并能有效杀伤HLA相合的BLCL。可望成为EBV相关性移植后淋巴细胞增殖性疾病的过继免疫治疗的有效方法。