PDGFRα的高表达在人脊柱裂胚胎中的研究

目的 探究血小板源性生长因子受体α(PDGFRα)在人脊柱裂胚胎中的表达情况.方法 应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PDGFRα基因在人脊柱裂胚胎中的表达,以GAP-DH作为内参照,并同时检测PDGFRα的上游调控因子PAX1的表达,免疫组织化学法检测PDGFRα蛋白在人脊柱裂胚胎中的表达.应用统计学软件(ID-advanced)分析图像结果.结果 人脊柱裂胚胎中的PDGFRα基因及蛋白的表达高于正常对照组(P<0.01).结论 PDGFRα的高表达在人脊柱裂发病中起重要作用.     

PDGFRα 高表达在人脊柱裂胚胎中的研究

目的 探究血小板源性生长因子受体α（PDGFRα）在人脊柱裂胚胎中的表达情况。方法 应用半定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测PDGFRα基因在人脊柱裂胚胎中的表达，以GAPDH作为内参照，并同时检测PDGFRα的上游调控因子PAX1的表达，免疫组织化学法检测PDGFRα蛋白在人脊柱裂胚胎中的表达。应用统计学软件（ID-advanced）分析图像结果。结果 人脊柱裂胚胎中的PDGFRα基因及蛋白的表达高于正常对照组（P<0.01）。结论 PDGFRα的高表达在人脊柱裂发病中起重要作用。     

养精种玉汤对小鼠卵母细胞体外成熟及PDGFA和PDGFRα表达的影响

目的:探讨养精种玉汤对小鼠卵母细胞体外成熟及血小板源性生长因子A亚基(platelet-derived growth factor subunit A,PDGFA)和血小板源性生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptorα,PDGFRα)表达的影响。方法:SPF级雌性KM小鼠灌胃养精种玉汤后取血制备血清,养精种玉汤血清用于未成熟卵母细胞-颗粒细胞复合体培养。体外培养后,观察并计算小鼠卵母细胞成熟率、受精率和卵裂率,采用Western blot和real-time PCR分别检测卵母细胞PDGFA和PDGFRα的蛋白及mRNA表达情况。结果:养精种玉汤能明显提高卵母细胞体外成熟率和受精率(P<0.05或P<0.01),下调PDGFA和PDGFRα的蛋白和mRNA表达(P<0.01)。结论:养精种玉汤可能通过下调PDGFA和PDGFRα的表达促进小鼠卵母细胞体外成熟。     

NKT细胞通过下调PDGFRβ抑制Ang Ⅱ诱导的小鼠血管平滑肌细胞表型转换

目的:探讨自然杀伤T细胞(NKT细胞)在高血压引起的小鼠血管平滑肌细胞表型转换中的作用及机制。方法:在野生型小鼠及CD1d基因敲除小鼠中,通过缓释泵持续灌注剂量为490 ng·kg^-1·min^-1的血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)14 d建立小鼠高血压模型,并在野生型小鼠中给予剂量为100μg/kg的NKT细胞特异性激动剂α-半乳糖神经酰胺(α-GC)。无创尾套法监测小鼠血压;HE染色观察小鼠主动脉壁厚度变化;Masson染色观察小鼠主动脉纤维化的程度;Western blot检测主动脉组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、骨桥蛋白(OPN)及血小板源性生长因子受体β(PDGFRβ)的表达。结果:与对照组相比,灌注Ang Ⅱ 14 d后,小鼠血压、主动脉壁厚度、主动脉纤维化程度、分泌型标志蛋白OPN表达及PDGFRβ蛋白表达均显著升高(P<0.05),收缩型标志蛋白α-SMA的表达降低(P<0.05)。CD1d基因敲除加重以上变化(P<0.05),而α-GC则减轻上述改变(P<0.05)。结论:NKT细胞通过降低PDGFR...     

H5N1-NP蛋白的原核表达及与宿主蛋白相互作用的初步研究

目的 原核表达并纯化禽流感病毒A/Anhui/1/2005（H5N1）的NP蛋白,并筛选人支气管上皮BEAS-2B细胞总蛋白中能够与纯化的NP蛋白相互作用的蛋白.方法 一方面,构建了含有NP基因的原核表达质粒pET30a-NP,并在大肠埃希菌中获得了可溶性表达.亲和层析和离子交换层析两步对NP蛋白进行纯化.另一方面,制备了BEAS-2B细胞总蛋白.在此基础上,联合应用Pull-down与LC-MS/MS技术来筛选并确认细胞中与纯化的NP蛋白相互作用的成分.结果 构建的pET30a-NP质粒在IPTG诱导下在原核细胞中实现了可溶表达,经过两步纯化后,得到可溶的NP蛋白纯品.Pull-down与LC-MS/MS技术初步筛选到BEAS-2B细胞中20个可能与NP蛋白相互作用的细胞蛋白.还需要进一步的实验来验证他们和NP蛋白之间的相互作用.结论 获得了高纯度的可溶NP蛋白及筛选到20个可能与其相互作用的BEAS-2B细胞候选蛋白.     

TGF-βRI与Fascin1的相互作用

目的探讨TGF-βRI和Fascin1的相互作用。方法用免疫荧光证实TGF-βRI和Fascin1的共定位。用GST pull-down和Co-IP的方法验证TGF-βRI和Fascin1的相互作用及其相互作用的位点。结果 TGF-βRI和Fascin1能共定位。Fascin1与TGF-βRI相互作用,相互作用位点是Fascin1的氨基端和TGF-βRI的膜内区。结论 TGF-βRI与Fascin1存在相互作用,相互作用位点是Fascin1的氨基端和TGF-βRI膜内区。     

PML-C与GINS2蛋白相互作用的胞内验证

目的 通过胞内实验验证PML-C与GINS2蛋白之间的相互作用.方法 将诱饵蛋白质粒pGBKT7-PML-C和文库蛋白质粒pACT2-GINS2共转化AH109酵母菌,通过一对一的酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2真核表达载体并共转染人胚肾293细胞...     

血小板源生长因子及其受体的研究进展

血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）是一种重要的促间质细胞分裂增殖的肽类调节因子。ＰＤＧＦ普遍存在于许多正常细胞和各种转化细胞中，它通过作用于靶细胞上的特异性受体而起作用。炎症、动脉粥样硬化、胚胎发生和发展等与ＰＤＧＦ有一定关系。     

PLC-β3与syntrophin蛋白的相互作用

 目的 探索并鉴定PLC-β3与PDZ蛋白syntrophin的相互作用,为进一步研究PLC-β3在神经系统信号转导通路中所扮演的角色提供线索。方法 制备GST-PLC-β3-CT融合蛋白,利用GST pull down的方法,检测PLC-β3-CT与β2-syntrophin和γ2-syntrophin的PDZ结构域的相互作用。结果 构建重组质粒pGEX-PLC-β3-CT,在大肠杆菌BL21中成功表达融合蛋白后,利用GST pull down的方法证实了PLC-β3-CT可以与β2-syntrophin而不是γ2-syntrophin的PDZ结构域相互作用。结论 PLC-β3与β2-syntrophin的相互作用的研究结果,为研究完整的PLC-β3与β2-syntrophin的相互作用以及这种相互作用在神经系统信号网络中的功能提供了线索。     

甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与宿主蛋白的相互作用的初步研究

目的利用酵母双杂交技术研究甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与人类宿主蛋白的相互作用,为该病毒蛋白的功能研究和致病机制提供理论依据。方法以本实验室分离和鉴定的甲型H3N2流感病毒A／Guangdong／7028／2010为模版,构建pGBKT7-PB1-F2重组载体,利用Y2HGold酵母双杂交系统,从人类通用cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白。结果成功构建含诱饵蛋白基因的pGBKT7-PB1-F2重组载体,转化酵母自激活和毒性实验显示为阴性：酵母双杂交实验显示Y2HGold和Y187酵母的结合率为5．22％,符合实验要求;经筛选和验证后,得到3个与截短型PB1-F2蛋白有相互作用的阳性克隆,分别为钾／钠ATP酶B1亚基、热休克蛋白40和白介素-2受体1亚基。结论初步推断截短型H3N2流感病毒PB1-F2蛋白可能影响流感病毒在宿主细胞中的复制功能和凋亡调控。     

PDGFR-β基因敲除小鼠上丘内Otx2和PV免疫反应阳性神经元的分布

目的:探讨血小板源性生长因子受体β(platelet-derived growth factor receptor-β,PDGFR-β)在上丘神经元的作用。方法:采用免疫细胞化学法和图像分析技术观察正常成年小鼠和PDGFR-β基因敲除小鼠上丘内Otx2和小白蛋白(parvalbumin,PV)免疫反应阳性神经元的形态、数目、大小及分布。结果:PDGFR-β基因敲除小鼠上丘内Otx2和PV免疫反应阳性神经元的基本形态及分布特征与正常小鼠无明显差别,即Otx2免疫反应阳性神经元密集地分布于上丘的浅层,而PV免疫反应阳性神经元则分布于上丘的各层。但这两种神经元的数目在PDGFR-β基因敲除小鼠却明显减少,其平均直径也较正常小鼠者明显为小。结论:PDGFR-β可能通过Otx2和PV等神经化学物质,参与上丘的功能形成与发育。     

转化生长因子β1及其受体和Smad2、Smad4蛋白在横纹肌肉瘤中的表达

转化生长因子—β1(transforming growth factor—β1，YGFβ1)是一种对各种细胞具有刺激或抑制作用的多功能细胞生长因子，其信号通路中某一成分缺失，抗增殖作用丧失而可诱发上皮性肿瘤。而在横纹肌肉瘤中，TGFβ1及其受体(TGFBR)的过表达或异常表达可能促进肿瘤的发展和演进。尚不清TGFβ1受体的下游分子Smads在横纹肌肉     

人类ZAKβ与YWHAZ蛋白相互作用的初步研究

目的研究ZAKβ与YWHAZ蛋白之间的相互作用。方法以ZAKβ为诱饵蛋白,利用酵母双杂交筛选人类肝脏cDNA文库,经GST Pull-down、免疫共沉淀和细胞共定位实验分别验证ZAKβ与猎物蛋白在体外和细胞内的相互作用,构建ZAKβ的截短体以确定相互作用的区域,用磷酸化抗体检测ZAKβ在相互作用中的磷酸化作用,并通过流式细胞仪检测这对蛋白相互作用对细胞周期的影响。结果利用酵母双杂交筛选到一个能与ZAKβ相互作用的蛋白YWHAZ,并在体外和细胞内都验证了这二者的相互作用,发现这两个蛋白都能共定位于293T细胞的胞质中,确定了ZAKβ的N端1~250氨基酸为与YWHAZ蛋白相互作用的区域。体外实验发现了这二者的相互作用涉及到磷酸化反应,发现这对蛋白的相互作用能提高293T细胞的G2期水平。结论首次发现并证实了ZAKβ和YWHAZ之间的相互作用,发现该相互作用涉及到磷酸化过程并能够对细胞周期产生影响。     

石蜡包埋人胰腺癌组织中Smad4蛋白和转化生长因子β_1及其Ⅱ型受体的表达

目的　探讨转化生长因子 (TGF) β通路中Smad4蛋白、TGFβ1和转化生长因子 βⅡ型受体 (TβRⅡ )的关系及它们在胰腺癌中的可能作用机制。 方法　用EnVision免疫组织化学技术检测5 6份石蜡包埋人胰腺癌标本Smad4蛋白、TGFβ1和TβRⅡ蛋白表达的情况。 结果　 5 6份胰腺癌组织Smad4、TGFβ1和TβRⅡ阳性率分别为 5 8 93%(33)、6 6 0 7%(37)和 6 0 71%(34 ) ,对应正常胰腺组织阳性率分别为 89 2 9%(5 0 )、2 5 0 0 %(14)和 2 5 0 0 %(14)。TGFβ1的表达与临床分期、肿瘤的有无转移相关 (P <0 0 5 )。TGFβ1与TβRⅡ之间也有相关关系 (P <0 0 5 )。 结论　胰腺癌组织中Smad4表达降低 ,TGFβ1与TβRⅡ则呈过表达。TGFβ1与TβRⅡ对胰腺癌的发生可能有协同作用。Smad4在TGF β诱导基因表达调控和随后的生长抑制中是关键的转录因子 ,但TGFβ有时也可能以与Smad4无关的形式起作用。     

胶质瘤细胞血小板源生长因子B链的纯合二聚体与其受体基因表达和受体活化水平的研究

目的探讨胶质瘤细胞血小板源生长因子Ｂ链的纯合二聚体（ＰＤＧＦＢＢ）及其受体（ＰＤＧＦＲ）基因表达和ＰＤＧＦＲ活化水平在胶质瘤发生、发展中的作用。方法用原位杂交和免疫组化染色观察了７３例不同级别的人胶质瘤组织标本。结果６２例（８４９％）的肿瘤细胞表达ＰＤＧＦＢｍＲＮＡ，其阳性率和阳性肿瘤细胞含量均随肿瘤恶性程度升高而递增。ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ和这两种受体及其信号传递通路活化标记物酪氨酸磷酸化蛋白（ＰＴｙｒ）的阳性率均为１００％。这３种阳性肿瘤细胞密度（个／００５ｍｍ２）彼此间均呈正相关（ｒ＝０８３８～０８９７，Ｐ＜００１），并均随肿瘤恶性程度及肿瘤细胞ＰＤＧＦＢｍＲＮＡ表达水平升高而同步增加，差异均有显著性（Ｐ＜００５～００１）。但各肿瘤组内两种受体阳性肿瘤细胞密度间无显著性差异（Ｐ＞００５）。结论胶质瘤细胞普遍存在ＰＤＧＦＢＢ自分泌环，ＰＤＧＦＲα和ＰＤＧＦＲβ在该自分泌环中均起重要作用，该自分泌环活性异常增加可能对ＰＤＧＦＢＢ及其受体表达有正反馈诱导作用，并可能在胶质瘤发生及恶性进展过程中发挥重要作用。     

IL-4下调COPD肺泡Ⅱ型上皮细胞中COX-2和PDGF的表达

目的：探讨COPD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATⅡ）中环氧合酶-2（COX-2）及血小板源性生长因子（PDGF）的表达及IL-4对其表达的影响。方法：用雄性Wistar大鼠建立吸烟大鼠COPD模型后取整肺做原代培养，培养出肺泡Ⅱ型上皮细胞。随机分为对照组和模型组，并用IL-4干预模型组的肺泡Ⅱ型上皮细胞。用免疫组化法检测细胞爬片COX-2、PDGF-A及PDGF-B的表达。结果：模型组COX-2和PDGF-A、PDGF-B表达明显增高；IL-4干预组表达显著降低。结论：COPD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞中COX-2和PDGF的表达显著增高，IL-4可降低其表达。     

肝纤维化大鼠转化生长因子β1/Smad蛋白的动态表达及意义

目的 探讨转化生长因子TGF-β1/Smad信号通路在实验性肝纤维化发生中的作用.方法 50只健康雄性SD大鼠分为2组:正常组和模型组,模型组大鼠利用40％ CCl4油剂诱导形成肝纤维化模型,于6周及9周观测肝标本的病理,免疫组化法检测肝组织TGF-β1/Smad蛋白表达.结果 ①肝组织病理:与正常组比较,模型组大鼠肝组织都有不同程度的炎症和纤维化产生.模型组纤维化程度较正常对照组明显,差异有统计学意义(P＜0.05);②TGF-β1/Smad基因蛋白:免疫组织化学检测显示,与正常对照组相比,模型组大鼠肝脏中TGF-β1、转化生长因子βⅠ型受体(TβR-Ⅰ)、Smad2/3、Smad7蛋白表达均显著增强(P＜0.01),模型组大鼠肝脏TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3和Smad7之间存在正相关关系(P ＜0.05或0.01);模型组大鼠肝脏纤维化分级与TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3和Smad7之间存在正相关关系(P＜0.05或0.01).结论 肝组织TGF-β1/Smad蛋白表达水平与肝纤维化程度相关,TGF-β1/Smad信号的增强可能促进了肝纤维化的进展.     

肝纤维化大鼠转化生长因子β1／Smad蛋白的动态表达及意义

目的探讨转化生长因子TGF—β1／Smad信号通路在实验性肝纤维化发生中的作用。方法50只健康雄性SD大鼠分为2组：正常组和模型组,模型组大鼠利用40％CCl4油剂诱导形成肝纤维化模型,于6周及9周观测肝标本的病理,免疫组化法检测肝组织TGF—β1／Smad蛋白表达。结果①肝组织病理：与正常组比较,模型组大鼠肝组织都有不同程度的炎症和纤维化产生。模型组纤维化程度较正常对照组明显,差异有统计学意义（P〈0．05）;②TGF—β1／Smad基因蛋白：免疫组织化学检测显示,与正常对照组相比,模型组大鼠肝脏中TGF—β1、转化生长因子βI型受体（TβR—I）、Smad2、3、Smad,蛋白表达均显著增强（P〈0．01）,模型组大鼠肝脏TGF—β1、TβR-I、Smad。和Smad,之间存在正相关关系（P〈0．05或0．01）;模型组大鼠肝脏纤维化分级与TGF—β1、TβR—I、Smad2/3和Smad,之间存在正相关关系（P〈0．05或0．01）。结论肝组织TGF—β1／Smad蛋白表达水平与肝纤维化程度相关,TGF-β1／Smad信号的增强可能促进了肝纤维化的进展。     

转化生长因子β1与成纤维细胞的相互作用影响食管癌细胞环氧合酶2表达

目的：探讨转化生长因子β1(TGF-β1)可否通过与成纤维细胞的相互作用调节食管癌细胞环氧合酶2(COX-2)表达。 方法： 以FS液、FSTB液(分别为10%FCS和加入5 μg/L TGF-β1培养24 h后的成纤维细胞培养上清)及含5 μg/L TGF-β1的完全培养基分别为食管癌细胞ECa-109、EC-18培养体系完全换液，24 h后逆转录-PCR及Western blotting分别检测各组COX-2 mRNA和COX-2、TGF-β受体Ⅰ、Ⅱ(RI、Ⅱ)蛋白表达。 结果： EC-18表达TGF-β RI、Ⅱ，ECa-109有RI而无RII表达。TGF-β1组、FS组及FSTB组COX-2蛋白与mRNA表达在EC-18细胞中分别为原来的0.103、2.368、2.793倍和0.368、1.895和4倍(均P<0.05)；在ECa-109细胞中为0.978、1.011(均P>0.05)、2.292倍(P<0.05)和0.980(P>0.05)、1.959、2.531倍(均P<0.05)。 结论： TGF-β1可能通过刺激成纤维细胞转而上调COX-2表达。     

通过配体文库研究GIPC2 PDZ配体结合特点及其相互作用蛋白

目的通过验证性筛选配体文库,获得GIPC2 PDZ结构域的配体结合特点,进而找到GIPC2的相互作用蛋白。方法 1)利用酵母双杂交的方法从已有的PDZ配体库中寻找与GIPC2的PDZ结构域配体结合特性;2)根据GIPC2的亚细胞定位和肿瘤相关功能再结合PDZ结构域结合序列的共同特征在蛋白质数据库中预测GIPC2的天然潜在配体;3)将天然潜在配体的C末端序列依次与GIPC2 PDZ结构域或GIPC2全长进行验证反应,从而得到阳性蛋白。结果 1)GIPC2 PDZ结构域的配体结合特性是C末端最后4个氨基酸为-X-S/T-X-V/L/I,是Ⅰ类PDZ配体;2)综合GIPC2的生物学特征和GIPC2 PDZ结构域的配体结合特点,在蛋白质数据库中预测得到47个天然潜在配体;3)将天然潜在配体的C末端序列克隆至酵母双杂交系统进行验证,最后得到10个确定的阳性蛋白。结论获得10个GIPC2相互作用蛋白。