EGF对人视网膜色素上皮细胞胞间通讯功能和Cx43表达的影响

目的探讨培养的人视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞中连接蛋白Cx43的表达,以及表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)对人视网膜色素上皮细胞间缝隙连接功能、细胞间通道蛋白Cx43表达的影响。方法免疫组化的方法观察Cx43在培养的人RPE细胞中的表达特点,用10mg·L-1、20mg·L-1、30mg·L-1不同浓度的EGF作用于培养的第4代人RPE细胞后,观察缝隙连接蛋白Cx43的表达强弱变化,用计算机灰度测量的方法评估表达的强度并作统计学分析。用LY染料传输方法测定细胞间隙连接功能,观察这3组不同浓度的EGF对人RPE细胞缝隙连接功能的影响。结果免疫组化染色显示体外培养的人RPE细胞表达缝隙连接蛋白Cx43,经计算机图像分析表明EGF使连接蛋白Cx43表达减弱,下调的程度与EGF的浓度呈正相关。LY染料传输试验显示在EGF作用下视网膜色素上皮细胞间通讯功能明显降低。结论体外培养的人RPE细胞表达Cx43,EGF可以减弱细胞间隙连接通讯功能、下调Cx43在人RPE细胞中的表达。     

维甲酸对人RPE细胞胞间通讯功能和Cx43表达的影响

目的观察培养的人视网膜色素上皮（RPE）细胞中连接蛋白Cx43的表达特点，以及维甲酸（RA）对人RPE细胞生长和细胞间缝隙连接功能、细胞间通道蛋白Cx43表达的影响及其相互关系。方法免疫组织化学方法观察缝隙连接蛋白（Cx43）在培养的人RPE细胞中的表达特点；不同浓度的RA作用于培养的第4代人的色素上皮细胞，用MTT方法观察RA对体外培养人RPE细胞生长的抑制；用LY染料传输方法测定细胞间隙连接功能，观察这三组不同浓度的RA对人RPE细胞缝隙连接功能的影响；免疫组织化学方法鉴别不同浓度RA影响后的缝隙连接蛋白Cx43的表达，用计算机灰度测量的方法评估表达的强度并作统计学分析。结果免疫组织化学染色显示体外培养的人RPE细胞表达缝隙连接蛋白Cx43，表达的部位主要在细胞浆和细胞膜上；RA对人RPE细胞的生长有明显的抑制作用，其抑制作用呈剂量依赖性；LY染料传输试验表明在RA的作用下RPE细胞间通讯功能明显增强；经计算机图像分析表明RA使连接蛋白Cx43表达增强，增强的程度与RA的浓度呈正相关。结论体外培养的人RPE细胞可以表达Cx43蛋白，RA抑制培养的色素上皮细胞的生长，提高细胞间隙连接通讯功能，上调Cx43蛋白在人RPE细胞中的表达。     

蓝光致人视网膜色素上皮细胞凋亡与线粒体膜电位和细胞色素C的关系

目的探讨蓝光光照对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡及对线粒体膜通透性转运功能的影响。方法用蓝光光照体外培养的人RPE细胞。实验分为三部分。第一部分:不同光照度,分为3组,第1组光照度(500±100)lx,第2组光照度(2000±500)lx,第3组光照度(3000±500)lx;光照RPE细胞时间6h,光照结束后24h终止培养。第二部分:同一光照度、不同光照时间,检测RPE细胞亚型时分为3组,第1组光照时间6h,第2组光照时间12h,第3组光照时间24h,光照度均为(2000±500)lx;检测线粒体膜电位时也分为3组,第1组光照时间3h,第2组光照时间6h,第3组光照时间12h,光照度均为(2000±500)lx。第三部分:同一光照度和光照时间,光照度(2000±500)lx,光照RPE细胞时间6h;不同细胞培养终止时间分为4组,第1组终止细胞培养时间为光照后6h,第2组为光照后12h,第3组为光照后24h,第4组为光照后36h。利用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)染色、荧光素标记的AnnexinV-FITC和PI双染流式细胞检测、透射电镜等手段观察RPE细胞凋亡情况。罗丹明123荧光染料孵育人RPE细胞,流式细胞仪检测线粒体膜电位,酶联免疫法测定细胞色素C活性,比色测定法测定Caspase-3的活性。结果第二部分第1组TUNEL染色阳性细胞的体积缩小变圆,胞核浓缩,边聚成新月形或帽状,细胞核碎裂成数个,细胞膜出胞。透射电镜观察发现细胞内线粒体肿胀,线粒体内膜嵴消失,粗面内质网扩张,溶酶体增加。第一部分(500±100)lx光照未引起明显的RPE细胞损伤,但线粒体膜电位明显下降;随着光照度增加,RPE细胞出现凋亡、凋亡继发性坏死及坏死,同时线粒体膜电位逐渐下降。第二部分光照6和12h,凋亡细胞百分比增加,荧光强度明显下降;光照24h凋亡继发性坏死细胞、坏死细胞百分比增加。第三部分光照后6和12h,RPE细胞凋亡百分比逐渐增加;光照后24、36h凋亡继发性坏死细胞和坏死细胞百分比明显增加,光照后各时间点RPE细胞荧光强度明显下降。以光照度(2000±500)lx照射6和12h,可见光照后24和36h两组的细胞色素C浓度明显升高,未检测到Caspase-3活性变化。结论蓝光照射可导致体外培养的人RPE细胞凋亡、凋亡继发性坏死及坏死,其损伤程度与光照度和时间相关;蓝光照射导致培养的人RPE细胞损伤过程与线粒体膜电位降低、细胞色素C释放有关;线粒体膜电位可作为检测蓝光致人RPE细胞凋亡的早期指标。     

体外光动力疗法致血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞凋亡的研究

目的 研究体外光动力疗法（PDT）诱导的血管内皮细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞凋亡情况。 方法 将体外培养的血管内皮细胞和人RPE细胞与血药浓度（1.0 μg/ml）相当的光敏剂verteporfin共同孵育，根据孵育时间的不同，每种细胞分成6组：0、5、15、30、60、120 min组。孵育至上述时间后，分别用光敏剂最大吸收波长光照（689 nm、功率密度为600 mW/cm2的二极管激光），能量密度为2.4 J/cm2，光照时间为83 s。用流式细胞仪检测3 h后各组细胞凋亡比例，实验重复进行3次。 结果 PDT后3 h，血管内皮细胞在6组的凋亡比例分别为：0.01±0.01、0.25±0.02、0.32±0.02、0.41±0.04、0.49±0.03和0.61±0.02；RPE细胞各组的凋亡比例分别为：0.02±0.01、0.22±0.01、0.31±0.02、0.38±0.03、0.47±0.05和0.58±0.03；两种细胞的凋亡比例均随细胞与光敏剂孵育时间的延长而增加；两种细胞在相同时间组的凋亡比例经t检验差异均无统计学意义(P>0.05)。 结论 PDT可致RPE细胞和血管内皮细胞快速凋亡，在相同的体外环境下，PDT对两种细胞所诱导的凋亡反应无明显选择性。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 253-255)     

体外培养的猪眼色素上皮细胞屏障功能的研究

目的 研究体外培养的猪眼视网膜色素上皮（RPE）细胞的血视网膜外屏障功能。 方法 对猪眼RPE细胞进行原代培养，第3代细胞接种于微孔滤器，微孔滤器的滤膜为无聚乙烯吡咯酮（PVP）聚碳酸脂膜（polycarbonate），分别于培养1、2、3、4周对滤膜表面行光学显微镜观察，于培养后2周对膜切面行光学显微镜和透射电子显微镜观察;行跨膜电阻测定并用荧光素钠和辣根过氧化物酶（HRP）进行通透性检测。 结果 成功原代培养了猪眼RPE细胞。光学显微镜观察结果显示，RPE细胞接种1周后，细胞基本汇合，接种后2、3周时RPE细胞密度无明显变化，接种后4周时细胞密度下降;滤膜及细胞标本切面观察结果显示，RPE细胞可在滤膜表面表现出单层有极性生长的特性;接种于微孔滤器2周后，RPE细胞跨上皮细胞电阻达（97.44±11.36） Ω/cm2，并至少持续到接种后3周;通透性检测结果显示，孵育30 min后只有0.27%的荧光素钠和0.17%的HRP从滤膜上方到达下方，分子量小的荧光素钠比分子量大的HRP通透率高。 结论 应用无PVP聚碳酸脂膜的微孔滤器可以建立体外RPE细胞有极性单层生长的模型，并用于屏障功能的研究。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 188-191)     

兔雪旺细胞对视网膜神经元突起生长的作用

目的 观察在体外兔雪旺细胞(Schwann cell,SC)对视网膜神经元突起生长的作用。 方法 乳兔视网膜细胞分别接种在培养2周的单层SC和多聚赖氨酸(poly L lysine)表面培养，相差显微镜下观察视网膜神经元的生长状态并在培养的24、48小时测量其突起的长度。 结果 视网膜细胞在ＳＣ表面生长活跃，体外培养24小时,神经元突起的平均长度达到(85±17)μm，48小时为(283±27)μm,与无SC共同培养的对照组相比有显著差异(P<0.01)。 结论体外SC对视网膜神经元突起的生长具有明显的支持、促进作用。 (中华眼底病杂志,1998,14:212-214)     

吲哚美辛诱导体外培养的视网膜色素上皮细胞凋亡

目的　探讨用吲哚美辛 ( indomethacin,IN)诱导体外培养的人胚胎视网膜色素上皮 ( retinal pigm entepithelium ,RPE)细胞的凋亡。方法　加入终浓度分别为 10 0、 2 0 0、40 0、 6 0 0μmol· L- 1 的 IN,作用 2 4h;6 0 0μm ol· L- 1 IN作用 6、 12、 2 4h后用透射电镜定性观察凋亡细胞 ,并用吖啶橙荧光染色进行定量和定性分析。结果　经 2 0 0、40 0、6 0 0 μm ol·L- 1 IN作用 2 4h后 RPE细胞凋亡指数分别为 ( 2 7.0 0 0 0± 1.3375 ) % ,( 5 1.0 0 0 0±1.370 3) % ,( 6 8.0 0 0 0± 1.6 86 5 ) %与对照组 ( 2 .0 0 0 0± 0 .42 16 ) %相比 ,差异有显著性( t=4.6 2 4,9.0 6 2 ,12 .2 0 6 ,P=0 .0 0 0 ,0 .0 0 0 ,0 .0 0 0 ) ,随着 IN浓度的增加 ,RPE细胞凋亡数逐渐增多 ;6 0 0μm ol· L- 1 IN作用 12、2 4h后 RPE细胞凋亡指数分别为 ( 44 .0 0 0 0±0 .843 3) % ,( 6 4.0 0 0 0± 1.2 6 49) %与对照组 ( 2 .0 0 0 0± 0 .42 16 ) %相比 ,差异有显著性( t=8.6 17,13.2 74,P=0 .0 0 0 ,0 .0 0 0 )。结论　 IN能诱导体外培养的人胚胎 RPE细胞的凋亡 ,并且 RPE细胞的凋亡呈现出随浓度增加和时间延长凋亡细胞数明显增多。     

胎儿晶状体上皮细胞胞间通讯的研究

目的　应用荧光淬灭后恢复 (FRAP)技术研究人类胎儿晶状体上皮细胞胞间通讯。方法　将体外培养的胎儿晶状体上皮细胞以羧基荧光素乙酰乙酸盐 (CFDA)负载 ,以激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM)进行光淬灭并测定荧光恢复速率。结果　应用FRAP技术证实人胎儿晶状体上皮细胞间存在胞间通讯 ,细胞内荧光淬灭后 ,平均荧光恢复速率为每分钟 2 0 4%± 0 2 1%。结论　在人类晶状体上皮细胞中有胞间通讯的发生 ,相邻细胞可通过间隙连接 ,以化学浓度差扩散形式交流物质完成信息传播 ,对细胞增殖的调控和代谢起作用     

体外培养兔晶状体上皮细胞胞间通讯的研究

目的　应用荧光淬灭后恢复 (fluorescenceredistributionafterphotobleaching,FRAP)技术研究兔晶状体上皮细胞胞间通讯 ,以及地塞米松和肝素对兔晶状体上皮细胞胞间通讯的影响。方法将体外培养兔晶状体上皮细胞接种于 96孔板 ,培养 2 4h后分别加入地塞米松 (浓度分别为 10、10 0、30 0mg/L)和肝素 (浓度分别为 1× 10 5、2× 10 5、4× 10 5U/L)。各组加入药物后 ,于 37℃继续培养 48h ,以羧基荧光素乙酰乙酸盐 ( 6 carboxyfluoresceindiacetate,CFDA)作荧光染色。以激光扫描仪 (ACASUltima)进行光淬灭并测定平均荧光恢复速率 (meanfluorescenceredistributionrate ,MFRR)。结果　地塞米松组 ,细胞内荧光淬灭后 ,平均荧光恢复速率 ( % /min)分别为 :对照组 0 375± 0 2 36 ,10mg/L组0 491± 0 2 39,10 0mg/L组 0 96 6± 0 44 7,30 0mg/L组 0 984± 0 379(F =2 6 0 7,P <0 0 5 ) ;肝素组 ,平均荧光恢复速率 ( % /min)分别为 :对照组 0 375± 0 2 36 ,1× 10 5U/L组 0 6 94± 0 491,2× 10 5U/L组1 0 97± 0 5 0 4,4× 10 5U/L组 1 0 82± 0 5 0 1(F =19 0 1,P <0 0 5 )。提示地塞米松和肝素可增强兔晶状体上皮细胞间的通讯 ,其作用与二者剂量有关。结论　应用FRAP技术证实兔晶状体上皮     

N-甲基-D-门冬氨酸诱导体外培养的视网膜色素上皮细胞凋亡

目的　探讨用N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)诱导体外目的　探讨用 N-甲基 -D-门冬氨酸 (N-methyl-D-aspartate,NMDA)诱导体外培养的人胚胎视网膜色素上皮 (retinal pigment epithelium,RPE)细胞的凋亡。方法　加入终浓度分别为 1 0、50、1 0 0、2 0 0、3 0 0 μmol· L-1的 NMDA作用 72 h;3 0 0 μmol· L-1NM-DA作用 1 2、2 4、3 6、48、72 h后用透射电镜定性观察凋亡细胞 ,并用吖啶橙荧光染色进行定量和定性分析。结果　经 2 0 0、3 0 0 μmol· L-1NMDA作用 72 h后 RPE细胞凋亡指数分别为 (51 .0 0 0± 1 .4491 ) %和 (74.0 0 0± 1 .71 2 7) %与对照组 (2 .0 0 0 0± 0 .42 1 6) %相比 ,差异有显著性 (t=1 0 .0 66、1 4.790 ,P=0 .0 0 0、0 .0 0 0 ) ,随着 NMDA浓度的增加 ,RPE细胞凋亡数逐渐增多 ;3 0 0 μmol·L-1NMDA作用 2 4、3 6、48、72 h后 RPE细胞凋亡指数分别为(9.0 0 0 0± 0 .73 79) %、 (1 3 .0 0 0 0± 1 .0 593 ) %、(2 5.0 0 0 0± 0 .70 71 ) %、(53 .0 0 0 0±0 .82 3 3 ) %与对照组 (2 .0 0 0 0± 0 .42 1 6) %相比差异有显著性 (t=2 .0 1 4、3 .1 65、6.61 8、1 4.676,P=0 .0 50、0 .0 0 3、0 .0 0 0、0 .0 0 0 )。结论　 NMDA能诱导体外培养的人胚胎 RPE细胞     

细胞因子对培养的人视网膜色素上皮细胞早期生长反应基因-1的影响

目的 检测细胞因子对人视网膜色素上皮（RPE）细胞早期生长反应基因-1（Egr-1）的影响。 方法 体外培养人RPE细胞，采用免疫荧光染色、Western blotting和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）定性定量观察不同刺激因素作用下Egr-1蛋白和mRNA的表达变化。刺激因素包括：20 μg/ml脂多糖（LPS）、40 ng/ml肿瘤坏死因子（TNF） α、10 U/ml 干扰素（IFN） γ、30%单核/巨噬细胞株（THP-1细胞）上清液和正常人玻璃体液分别刺激0(未受刺激)、10、20、30、40、60 min。结果 在未受刺激的RPE细胞中Egr-1呈弱阳性表达，细胞浆为浅黄绿色荧光，随着刺激因素的作用，Egr-1的表达明显增强，细胞浆和部分细胞核呈强绿色荧光。20 μg/ml LPS、40 ng/ml TNF α、10 U/ml IFN γ、30％THP-1细胞上清液和玻璃体液刺激RPE细胞后，与未受刺激的RPE细胞相比，Egr-1 mRNA的最大增强幅度分别为19、13、14、12、14倍，Egr-1蛋白的最大升高幅度分别为34、12、17、32、13倍。 结论 LPS、TNF α、IFN γ、THP 1细胞上清液和玻璃体液可上调体外培养的人RPE细胞Egr-1 mRNA和蛋白的表达，且出现核转位现象，说明这些刺激因素可引起Egr-1的活化。     

应用二维电泳法对视网膜色素上皮细胞光损伤后蛋白质组学的初步研究

目的 应用二维电泳法观察光损伤后视网膜色素上皮细胞蛋白质组的表达。 方法 运用冷白光以（2200±300）Lx光照人视网膜色素上皮细胞(ARPE 19)6 h，建立光损伤模型；提取细胞可溶性蛋白并通过二维电泳分离和凝胶图像分析，寻找光损伤细胞的蛋白质谱变化。 结果 软件分析显示全细胞可溶性蛋白在图谱上出现（390±10）个清晰斑点,11个蛋白斑点有明显表达差异。光损伤细胞内8种蛋白表达上调,1种下调，2种蛋白表达缺失。 讨论 二维电泳实验能够找出光损伤RPE细胞与正常细胞的蛋白表达差异，为进一步研究在此改变中发挥重要作用的蛋白质奠定基础。     

生长激素释放多肽对高糖诱导视网膜色素上皮细胞的保护作用

目的：探讨生长激素释放多肽(Ghrelin)对高糖环境下人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞氧化应激的影响。

方法：将体外培养的RPE细胞分为阴性对照组、高糖组、Ghrelin低浓度组、Ghrelin高浓度组。通过CCK-8法检测细胞存活率,氧敏感荧光探针H₂DCFDA染色法观察细胞氧化损伤程度,流式细胞技术检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的变化,分光光度计比色法检测细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。

结果：CCK-8结果显示,分别用10^-9mol/L、10^-6mol/L Ghrelin预处理后,RPE细胞存活率分别为54.79%±3.43%和79.16%±3.29%,与高糖组(41.65%±3.42%)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。H₂DCFDA荧光探针染色结果显示,Ghrelin预处理后RPE细胞内ROS生成量下降,氧化损伤细胞减少。分光光度计比色法结果显示,与高糖组相比,Ghrelin组细胞SOD活力增加,MDA含量下降。

结论：Ghrelin可以抑制高糖诱导的人RPE细胞氧化损伤,其在糖尿病视网膜病变的发生发展过程中可能具有一定的细胞保护作用。     

促红细胞生成素对人视网膜色素上皮细胞光化学损伤的保护作用

目的 观察重组人促红细胞生成素（EPO）在人视网膜色素上皮(RPE)细胞光化学损伤中的保护作用并探讨其作用机制。 方法 取成人RPE（ARPE）19细胞株传代培养的2～5代细胞建立光损伤模型，光照12 h后再培养24 h终止培养，采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）法和流式细胞双染色法检测不同浓度的EPO干预治疗前后RPE细胞活性的变化及细胞凋亡的变化，并添加酪氨酸激酶/信号转导和转录活化因子Jak/STAT的阻断剂（AG490）探讨人重组EPO对人RPE细胞光化学损伤的保护性作用及其保护性机制。 结果 EPO可明显增强 RPE细胞的细胞活性，各组中以40 IU/ml EPO组细胞活性的增强结果最明显；明显减少光化学损伤诱导的人RPE细胞的凋亡，以40 IU/ml EPO组结果最明显。在加入AG490（Jak2激酶抑制剂）组，EPO对细胞活性的增强作用和抑制凋亡作用均被阻止。 结论 EPO对人RPE细胞的光化学损伤有保护治疗作用，其保护作用机制主要通过EPO与其受体结合后保护作用机制起作用。     

Blue light-induced apoptosis in cultured retinal pigment epithelium cells of the rat

Background: We previously demonstrated that phagosome-free retinal pigment epithelium (RPE) cells in culture can be damaged directly by blue light (wavelength 440±10 nm) as observed by electron microscope. A low intensity (1.0 mW/cm²) of light induced only swelling of mitochondria, while a high intensity (4.0 mW/cm²) induced necrosis in the RPE. The aim of the present study was to investigate what intensity of blue light could induce apoptosis in cultured phagosome-free RPE. Methods: Primary cultured RPE cells, harvested from Long-Evans rats, that contained no phagosomes were exposed to a cool blue light (wavelength 440±10 nm). After exposure, transmission electron microscopy (TEM) and TdT-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) staining were used to detect apoptosis in the RPE cells. To assess the relationship of oxidation to apoptosis by blue light, we added N-acetyl-cysteine (NAC) as a free radical scavenger and investigated its inhibitory effect on apoptosis. Results: In RPE cells exposed to blue light of 2.7 mW/cm² for 24 h, apoptotic bodies were found by TEM. In RPE cells exposed to blue light of 2.0 mW/cm² for 60 h, apoptotic bodies, nuclear condensation and nuclear segmentation were observed by TEM and some RPE cells showed positive TUNEL staining. When 30 mM of NAC was added, TUNEL staining was negative. Conclusion: Our findings demonstrate that apoptotic cell death is induced by blue light exposure in cultured RPE cells in vitro. The findings of our previous experiments and those of the present study suggest that a higher intensity of blue light could induce necrosis, and moderately intense blue light could induce non-necrotic cell death or apoptosis, in RPE cells. Furthermore, it is suggested that blue light caused cell death by a free-radical-associated mechanism. Received: 10 April 2000 Revised: 30 June 2000 Accepted: 29 August 2000     

Effects of corticosteroid on porcine retinal pigment epithelial cells in culture--1. Inhibitory effect on cell proliferation]

PURPOSE: Proliferation is an important function of the retinal pigment epithelial (RPE) cells. The effect of a corticosteroid on the proliferation of cultured porcine RPE cells was investigated. METHODS: After administration of various concentrations (10-1,000 nM) of betamethasone sodium phosphate (betamethasone), we counted RPE cell numbers at 1, 3, 6, 9, and 14 days. RESULTS: Betamethasone administration resulted in a dose-dependent decrease in RPE cell proliferation. The proliferation of the cultured RPE cells was significantly inhibited by betamethasone, at a dose of 300 nM in 9 days. Ten-nM betamethasone neither inhibited nor promoted the RPE cell proliferation in culture. CONCLUSIONS: These results suggest that corticosteroids inhibit proliferation of cultured porcine RPE cells.     

Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie des retinalen Pigmentepithels mittels strukturierter Beleuchtung

Background

The accumulation of autofluorescent bodies in retinal pigment epithelium (RPE) cells has an impact on the pathogenesis of retinal diseases, including age-related macular degeneration. While current in vivo fluorescence microscopy allows a lateral resolution of fluorophores in a micrometer range, with ex vivo microscopy a lateral resolution down to 200 nm is possible. For the first time, we used structured illumination microscopy for ex vivo high-resolution fluorescence microscopy of RPE cells.

Methods

Histological sections were prepared from a 68-year-old patient. With epifluorescence microscopy, fluorescent RPE cells were detectable. Structured illumination uses inhomogeneous illumination for resolution of previously nonresolvable structures, similar to the Moiré effect. Images were taken from RPE cells at different excitation wavelengths (488, 568, and 647 nm) and were reconstructed with special software. The different excitation patterns of the fluorescent granules in the RPE cells were colour-coded and analysed.

Results

With structured illumination microscopy, autofluorescence signals of RPE cells were detectable, and a lateral resolution of 110 nm could be achieved. Using varying wavelengths, different pigments were excitable. Lipofuscin gave the highest signals, at 488 and 568 nm. The improved resolution showed inhomogeneous intragranular fluorophore patterns.

Conclusion

Structured illumination microscopy enabled us to generate images of fluorescent structures in RPE cells ex vivo with a lateral resolution of 110 nm. With the use of different excitation wavelengths, intracellular fluorescence patterns in single cell compartments are visible and allow further differentiation.     

金丝桃素对体外培养的人视网膜色素上皮细胞蛋白激酶C活性的影响

目的 研究金丝桃素(hypericin)对体外培养的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞的蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）活性的影响。 方法 用含0.5～5.0 μmol/L金丝桃素的10％血清培养液培养人RPE细胞,在有或没有PKC激活剂佛波醇-12-豆蔻酰-13乙酸 （phorbol 12-myristate 13-acetate，PM A）预处理RPE细胞的情况下，用PKC检测试剂盒测定金丝桃素对细胞液PKC（cytosolic PKC，c-PKC）和细胞膜PKC（membranous PKC，m-PKC）活性变化的影响。 结果 未经PMA处理的人RPE细胞的c-PKC和m-PKC的原始活性分别为(35.34±4.1) pmol·min^-1·mg^-1和(62.52±8.8) pmol·min^-1 ·mg^-1。PMA处理细胞后，c-PKC在5 min内就迅速下降，20 min后下降缓慢，60 min降至处理前的18％，以后一直处于很低的水平。m-PKC在5 min后逐渐升高，至40 min达到高峰以后下降，60 min后恢复至对照水平，10 h后降至对照组的30％以下。用PMA处理RPE细胞48 h后，c-PKC和m-PKC都降低至不能测出。但若将金丝桃素与PMA同时加入后，能抵消大部分PMA对PKC的下降调节。 结论 金丝桃素能阻止RPE细胞的PKC转位，使PKC的活性发生变化，有可能促进RPE细胞的凋亡，防止增生性玻璃体视网膜病变的发生。 （中华眼底病杂志，2003，19：55-58）     

Long-term real-time monitoring of adeno-associated virus-mediated gene expression in the rat retina

Purpose : Previous studies have demonstrated that adeno‐associated virus (AAV) efficiently transduced retinal pigmented epithelial (RPE) cells. The goal of this study was to further evaluate and characterize transgene expression within the RPE cells over time in vivo. Methods : Adeno‐associated virus‐mediated gene transfer was monitored and quantified by retinal photography following subretinal injection of a recombinant AAV encoding the green fluorescent protein gene (rAAVCMV‐gfp) into rat eyes. Retinal function of transduced rat eyes was measured by electroretinography. Results : The maximum level of transgene expression was reached at 8 weeks postinjection followed by a gradual decrease throughout the experimental period. Interestingly, it was observed that while gfp expression was stable in some RPE cells, gfp fluorescence completely disappeared in other cells over the duration of the experiment. The expression of AAV‐mediated gfp in RPE cells did not alter the retinal function for over 1 year. Conclusions : These results confirm the importance of this direct visualization system to study vector transgene expression in vivo and support the use of AAV for diseases treatable by targeting RPE cells. Key words : adeno‐associated virus, gene transfer, green fluorescent protein, retinal photography, retinal pigmented epithelium.