脐血单个核细胞与骨髓间充质干细胞滋养层的共培养

背景:骨髓间充质干细胞具有维持骨髓正常造血功能,在造血调控中发挥重要的作用。目的:观察骨髓间充质干细胞的生物学性状和多向分化能力,并检测其在体外支持造血的能力。方法:利用密度梯度培养法分离骨髓单个核细胞进行培养,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表型;接种脐血单个核细胞于骨髓间充质干细胞滋养层培养板上共培养,观察粒-单系祖细胞集落变化。结果与结论:骨髓间充质干细胞呈典型的成纤维样细胞形态,强表达CD44,CD29,不表达CD34和CD106。可促进脐血单个核细胞扩增并形成造血祖细胞集落。提示骨髓间充质干细具有造血支持作用。     

人羊膜间充质干细胞支持造血的体外实验

背景:骨髓是目前间充质干细胞的主要来源,但由于取材不便、细胞数量受年龄限制等原因,其应用具有一定局限性.近年来,羊膜作为间充质干细胞的新来源受到越来越广泛的关注.目的:探讨人羊膜来源间充质干细胞在体外对造血干细胞的扩增是否有支持作用,以及怎样提高羊膜间充质干细胞和造血干细胞共移植成功率.方法:利用组织块培养法,从足月分娩的人羊膜中分离培养羊膜间充质干细胞.密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,采用免疫磁珠分选技术分选其中 CD34+细胞.分别用脐血单个核细胞和 CD34+细胞与羊膜间充质干细胞共培养,连续 4 周,每周计悬浮细胞浓度,并以骨髓间充质干细胞组及无滋养层组作为对照.采用集落形成实验,把扩增的脐血单个核细胞和CD34+细胞分别接种至甲基纤维素半固体培养基中,14 d 后根据典型形态特征计数造血集落数.结果与结论:羊膜间充质干细胞可促进人脐血单个核细胞和 CD34+细胞扩增,扩增后两者在甲基纤维素半固体培养基中能够形成造血祖细胞集落,其造血支持作用与骨髓间充质干细胞相似,两者对比无明显统计学差异.提示,羊膜间充质干细胞体外具有与骨髓间充质干细胞相似的造血支持作用,有可能为造血干细胞体外扩增及临床间充质干细胞与造血干细胞联合移植、提高造血干细胞移植成功率提供一种更加理想的间充质干细胞新来源.     

红细胞生成素基因修饰的间充质干细胞条件培养基促进人胚胎干细胞向造血细胞分化

本研究探讨EPO基因修饰的间充质干细胞条件培养液对人胚胎干细胞向造血细胞诱导分化的影响。通过重组慢病毒系统感染人间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）,建立能够稳定高效表达红细胞生成素（erythropoietin,EPO）的细胞株EPO／MSC。用EB培养液诱导人胚胎干细胞形成拟胚体,然后用EPO／MSC条件培养液处理拟胚体细胞;通过免疫荧光、集落形成实验和RT—PCR检测等方法对诱导的细胞进行了相关鉴定。结果表明：EPO／MSC体外能够稳定表达EPO。条件培养液诱导生成的细胞表达造血干／祖细胞抗原CD34和相关造血基因,可产生不同的造血集落,且明显高于对照组。结论：EPO基因修饰的间充质干细胞条件培养液能显著促进人胚胎干细胞向造血细胞分化。     

含人AGM区、胎肝及骨髓基质细胞培养体系程序化诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的分化

背景：前期已分别制备人主动脉-性腺-中肾区基质细胞系及胎肝基质细胞系,发现前者可促进小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干细胞。目的：模拟胚胎发育过程中永久造血发育的时空顺序,探讨人主动脉-性腺-中肾（AGM）区、胎肝（FL）及骨髓（BM）基质细胞对小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为造血干细胞的支持作用,以寻求更佳的诱导条件。方法：将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体（EB）,并利用Transwell非接触共培养体系依次在人主动脉-性腺-中肾区、胎肝及骨髓基质细胞饲养层上进一步诱导分化,按不同诱导阶段分为拟胚体对照、EB/AGM、EB/AGM＋FL和EB/AGM＋FL＋BM共4组。共培养6d后分别收获各组拟胚体来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1＋c-Kit＋细胞含量,进行各系造血细胞集落形成单位分析并观察细胞形态。结果与结论：①EB/AGM＋FL组和EB/AGM＋FL＋BM组收获细胞涂片均发现原始造血细胞。②拟胚体来源细胞经AGM区基质细胞诱导后Sca-1＋c-Kit＋细胞明显升高（P〈0.05）。③拟胚体对照组造血细胞集落形成单位低于其他各组（P〈0.05）,而EB/AGM＋FL、EB/AGM＋FL＋BM组造血细胞集落形成单位计数亦较EB/AGM组明显增高。提示AGM＋FL和AGM＋FL＋骨髓基质细胞微环境对原始造血干细胞的扩增效应均明显高于单纯主动脉-性腺-中肾饲养层。     

含人AGM区、胎肝及骨髓基质细胞培养体系程序化诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的分化

背景:前期已分别制备人主动脉-性腺-中肾区基质细胞系及胎肝基质细胞系,发现前者可促进小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干细胞.目的:模拟胚胎发育过程中永久造血发育的时空顺序,探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞对小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为造血干细胞的支持作用,以寻求更佳的诱导条件.方法:将小鼠E14 胚胎干细胞诱导为拟胚体(EB),并利用Transwell 非接触共培养体系依次在人主动脉-性腺-中肾区、胎肝及骨髓基质细胞饲养层上进一步诱导分化,按不同诱导阶段分为拟胚体对照、EB/AGM、EB/AGM+FL 和EB/AGM+FL+BM共4 组.共培养6 d 后分别收获各组拟胚体来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,进行各系造血细胞集落形成单位分析并观察细胞形态.结果与结论:①EB/AGM+FL 组和EB/AGM+FL+BM 组收获细胞涂片均发现原始造血细胞.②拟胚体来源细胞经AGM 区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+ 细胞明显升高(P < 0.05).③拟胚体对照组造血细胞集落形成单位低于其他各组(P < 0.05),而EB/AGM+FL、EB/AGM+FL+BM组造血细胞集落形成单位计数亦较EB/AGM组明显增高.提示AGM+FL 和AGM+FL+骨髓基质细胞微环境对原始造血干细胞的扩增效应均明显高于单纯主动脉-性腺-中肾饲养层.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向造血细胞分化的研究

目的探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞（hMSC）向造血细胞分化的可行性及分化条件。方法首先建立hMSC的分离培养扩增体系，制备小鼠胎肝基质细胞条件培养液（FLSC-CM），将hMSC接种在分别含FLSC-CM和IL-6、SCF组合的培养体系中，通过形态学、直接免疫荧光染色检测法、粒-单／巨噬系集落形成细胞培养（CFU-GM）对分化细胞进行鉴定。结果hMSC经FISC—CM诱导培养9天后，产生较多的悬浮细胞，悬浮细胞瑞士染色后形态类似于单核或小淋巴细胞，表达人CD34和人CD45表面抗原。且能够形成造血祖细胞集落（CFU-GM）。结论FLSC-CM可诱导hMSC分化为具有造血干／祖细胞特性的前体细胞。     

胚胎骨髓来源间充质干细胞对人Th17细胞的免疫调节

背景：众多研究表明间充质干细胞能发挥免疫调节功能,抑制T细胞增殖。目的：观察胚胎骨髓来源间充质干细胞对人Th17细胞的调节作用。方法：将人胚胎骨髓间充质干细胞与正常人外周血单个核细胞或CD4＋T细胞以1∶10比例共培养4d,以单个核细胞或CD4＋T细胞单独培养为对照。应用实时定量PCR检测细胞白细胞介素17mRNA表达,酶联免疫吸附试验检测细胞上清中白细胞介素17蛋白水平,流式细胞术检测Th17细胞数量。结果与结论：胚胎骨髓来源间充质干细胞与单个核细胞共培养组白细胞介素17mRNA表达水平明显高于单个核细胞组（P〈0.01）。与此一致的是,胚胎骨髓来源间充质干细胞与单个核细胞或CD4＋T细胞共培养组细胞上清中白细胞介素17蛋白水平明显高于单个核细胞组、CD4＋T细胞组（P〈0.05,P〈0.01）。胚胎骨髓来源间充质干细胞与CD4＋T细胞共培养组Th17细胞数量明显高于CD4＋T细胞组（P〈0.01）,但胚胎骨髓来源间充质干细胞本身并不表达白细胞介素17。表明胚胎骨髓来源间充质干细胞可促进人Th17细胞增殖。     

胚胎骨髓来源间充质干细胞对人Th17细胞的免疫调节

背景:众多研究表明间充质干细胞能发挥免疫调节功能,抑制T细胞增殖。目的:观察胚胎骨髓来源间充质干细胞对人Th17细胞的调节作用。方法:将人胚胎骨髓间充质干细胞与正常人外周血单个核细胞或CD4+T细胞以1∶10比例共培养4d,以单个核细胞或CD4+T细胞单独培养为对照。应用实时定量PCR检测细胞白细胞介素17mRNA表达,酶联免疫吸附试验检测细胞上清中白细胞介素17蛋白水平,流式细胞术检测Th17细胞数量。结果与结论:胚胎骨髓来源间充质干细胞与单个核细胞共培养组白细胞介素17mRNA表达水平明显高于单个核细胞组(P<0.01)。与此一致的是,胚胎骨髓来源间充质干细胞与单个核细胞或CD4+T细胞共培养组细胞上清中白细胞介素17蛋白水平明显高于单个核细胞组、CD4+T细胞组(P<0.05,P<0.01)。胚胎骨髓来源间充质干细胞与CD4+T细胞共培养组Th17细胞数量明显高于CD4+T细胞组(P<0.01),但胚胎骨髓来源间充质干细胞本身并不表达白细胞介素17。表明胚胎骨髓来源间充质干细胞可促进人Th17细胞增殖。     

人胚胎干细胞HuES17向造血干细胞的分化

背景:人类胚胎干细胞是来源于着床前囊胚的内细胞团,能在长期培养中无限增殖并保持未分化状态,且具有分化成人体组织各种细胞类型能力的细胞。目的:进一步验证人胚胎干细胞HuES17细胞株向造血干细胞分化的能力。方法:人胚胎干细胞HuES17采用与人包皮成纤维细胞二维共培养的方式培养,采用人胚胎干细胞与小鼠骨髓基质细胞(OP9)二维共培养的方法诱导胚胎干细胞向造血干细胞分化。结果与结论:人胚胎干细胞与小鼠骨髓基质细胞(OP9)二维共培养诱导造血分化的第四五天即开始出现OP9细胞逐渐老化,很快死亡;可以观察到人胚胎干细胞分化,然而,随着OP9细胞死亡,分化的人胚胎干细胞亦死亡,不能诱导人胚胎干细胞向造血干细胞分化。提示人胚胎干细胞HuES17细胞株可能不能向造血干细胞分化,或向造血干细胞分化的能力较低。     

人胚胎骨髓间充质干细胞的初步培养及鉴定

目的分离培养并鉴定人胚胎骨髓间充质干细胞。方法抽取流产胎儿股骨骨髓,梯度离心,取含有骨髓间充质干细胞的低密度血小板层进行培养;免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原;酶细胞化学法测定细胞碱性磷酸酶活性。结果培养的细胞呈现纺锤形外观;细胞膜抗原CD29、CD44有阳性表达,CD34、CD45呈阴性表达;碱性磷酸酶检测呈阴性反应。结论培养的细胞不是骨髓中的造血干细胞,是处于未分化阶段的骨髓间充质干细胞。     

骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养诱导分化为心肌样细胞

本研究探讨间充质干细胞（MSC）分化为心肌细胞（CM）的能力。对大鼠源MSC进行标记并将大鼠源MSC与初生大鼠CM直接接触共培养5—7天，诱导MSC向CM分化。用流式细胞仪检测细胞表面抗原，免疫荧光法检测标记细胞的心肌特异性标记物肌球蛋白和肌钙蛋白T表达。结果显示：体外培养的MSC表达CD90、CD44、CD105、CD54，不表达CD34、CD45、CD31等造血细胞、内皮细胞相关抗原。MSC与CM直接接触共培养后可分化为心肌样细胞，表达心肌特异蛋白肌钙蛋白T和肌球蛋白，CM与MSC比例为4：1时，MSC分化为心肌样细胞的比例最高。结论：MSC在与CM直接接触共培养条件下可被诱导分化为心肌样细胞，两种细胞按4：1比例混合培养后MSC分化为心肌细胞的效果最明显：     

胚胎干细胞的研究进展

胚胎干细胞（ESC）是来源于哺乳动物早期胚胎的内细胞团中的一种二倍体细胞,具有发育的全能性。ESC的体内和体外分化在分子水平有许多相似之处。在现有培养条件下。小鼠ESC体外分化的细胞类型或结构主要有4种：内皮细胞与血管,肌细胞和心肌、造血细胞和神经细胞,最近的研究提示;造血干细胞（HSC）来源于胚胎内的特定区域,HSC的产生可能受尚未发现的胚胎生长因子调节。ESC为从胚胎着手明确早期造血过程提供了方便有效的实验途径。人ESC的研究及应用尚面临一系列伦理问题,对ESC的研究具有广阔的应用前景。     

胚胎干细胞来源的BL-CFC可产生高增殖潜能造血祖细胞

小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES cell)体外分化2，5—3．5天形成的拟胚体(embryoid body，EB)中可产生原始细胞集落形成细胞(blast dtony—forming cell，BL—CFC)，后具有造血和内皮细胞双向分化潜能，是目前体外实验可检测到的最早期的定向造血分化的细胞。本研究建立BL—CFC培养体系，并通过造血祖细胞集落培养、免疫荧光标记以及巢式RT—PCR鉴定单个原始细胞集落来源的贴壁细胞和非贴壁细胞的分化特点。结果表明：部分贴壁细胞吞噬DiI—Ac—LDL。并表达CD31，UEA—I，VF—cadtherin等内皮细胞特异性的表面分子；非贴壁细胞具有原始造血(primitive hematopoiesis)和(或)永久造血(definitive hematopoiesis)活性，其中20％的原始细胞集落含有高增殖潜能集落形成细胞(high proliferative potential colony—forming cell，HPP—CFC)，后能形成次级造血集落。结论：胚胎干细胞来源的BL-CFC可产生高增殖潜能造血祖细胞，但原始细胞集落来源的HPP—CFC是否具有体内造血活性有待进一步的研究证实。     

人类胚胎干细胞向造血细胞和内皮细胞诱导分化的初步研究

胚胎干(ES)细胞是一种能够自我更新、长期增殖并且具有多向分化潜能的干细胞。近年来的研究表明，小鼠胚胎干细胞体外分化能够模拟体内造血发育的过程。为探讨诱导人类胚胎干细胞向造血细胞和内皮细胞的分化的方法．将人类胚胎干细胞去饲养层，形成拟胚体(EB)培养3天后消化；采用基质细胞条件培养基联合细胞因子的诱导体系。诱导8天后，种植到半固体培养基中培养7—14天。应用RT—PCR检测诱导细胞flk-1、BMI-1、scl、Zeta—globin造血相关基因的表达；流式细胞术检测KDR、CD34等造血细胞表面抗原的表达；免疫组织化学检测集落细胞的表面标记。结果表明：①半固体培养基中出现20—30个细胞组成的集落，集落细胞再种植仍然能够形成大小相似的细胞集落；另外一些较大的细胞集落中CIM5细胞呈阳性．．②部分细胞贴壁生长形成内皮细胞样集落，Ⅷ因子、KDR、UEA检测均为阳性．．③在ES细胞内有少量flk-1、BMI-1表达，而scl、Zeta—globin基因不表达；自发分化3天的EB可见flk-1、BMI-1表达上调；消化形成单细胞并诱导4天，检测到flk-1、BMI-1、scl、Zeta—globin基因的表达。第8天仍然检测到flk-1、BMI-1、scl基因的表达，Zeta—globin基因不表达。④诱导8天的细胞中表达flk-1阳性细胞的率为9．8％．CD34阳性细胞占总细胞量的16．8％，对照组ES细胞阳性率分别为0．04％和0．16％；EB自发分化阳性率分别为0．36％和1．16％。结论：采用基质细胞条件培养基联合细胞因子的培养体系，可诱导人类胚胎干细胞向造血细胞及内皮细胞分化。     

体外诱导人类诱导性多能干细胞分化为造血干 / 祖细胞的研究简

本研究探讨体外诱导人诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）分化为造血干/祖细胞的能力.在体外用小鼠骨髓基质细胞OP9与人类iPSC共培养的方法,将iPSC诱导分化为造血干/祖细胞;用流式细胞术检测造血干/祖细胞表面标志物的表达水平;用实时定量PCR检测分化过程中iPSC及造血干/祖细胞的相关基因mRNA表达水平的变化;用免疫磁珠法分离CD34＋造血干/祖细胞并进行半固体集落形成实验检测细胞的集落形成能力.结果表明,iPSC与OP9细胞共培养诱导造血分化的第4天即可观察到iPSC形态变化;流式细胞术检测显示,分化得到的细胞表达已知的造血干/祖细胞相关表面标志物CD34和CD43分子.在体外分化过程中多能性的标志基因Oct4的表达逐渐下降,造血相关转录因子Gata-2的表达逐渐升高,而Runx-1的表达量则呈波浪式变化,CD34表达量逐渐升高.集落培养14 d能够得到红系集落（CFU-E）,粒系集落（CFU-G）,巨核系集落（CFU-M）,粒-巨核系集落（CFU-GM）和混合系集落（CFU-GEMM）.结论：iPSC细胞能够在体外通过与OP9细胞共培养分化为造血干/祖细胞.     

C57BL/6小鼠来源的胚胎干细胞建系及体外定向造血分化的研究

哺乳动物的胚胎造血表现为时间和空间的连续变化。既往研究表明，129小鼠来源的胚胎干细胞系（em-bryonic stem cells，ES细胞）的体外分化能在一定程度上模拟胚胎造血。为研究C57BL/6小鼠来源的ES细胞系体外定向造血细胞分化的特点，分离C57BL/6小鼠3.5天囊胚的内细胞团建立ES细胞系并采用常规方法鉴定，应用体外二步分化法形成拟胚体并进行集落培养，细胞化学染色和RT-PCR鉴定造血前体细胞。结果表明：所建ES细胞系MES-1符合建系标准，其体外分化后可在不同阶段的拟胚体中发现多种造血前体细胞的有序出现，包括原始红系前体细胞，永久红系前体细胞，混合集落形成细胞和粒单系集落形成细胞。RT-PCR分析显示，拟胚体表达多种造血特异性的转录因子和造血标记。结论：自C57BL/6小鼠建立的ES细胞系MES-1体外定向造血细胞分化在一定程度上能模拟胚胎造血。     

人骨髓间充质干细胞体外扩增的生物学评估

本研究旨在对骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）进行移植前增殖分化能力测定，病毒学检查，核型分析，PCR-STR和甩A的检测，以便为临床应用提供安全、可靠的移植细胞。采用贴壁法分离骨髓MSC，在相同条件下分别考察各代细胞形态、生长、表面标记、成骨、成脂分化能力的变化情况，并进行不同生长时期的核型分析，利用札A—SBT技术检测4个不同供者来源的MSC的HLA-I和HLA—II位点的高分辨分型；应用PCR—STR技术检测4个不同供者来源的MSC基因遗传标记。并且利用ELISA方法检测HIV，HBV，HCV和TP，使用PCR方法检测支原体污染。结果表明：随着传代次数增加，MSC的增殖能力、成骨能力均有所下降。在扩增过程中，MSC始终保持较高的纯度，CD29、CD44、CD105、CD166、CD73均表达阳性，CD14、CD34、CD45、CD80和CD86均表达阴性。在8代以前未发现核型变异。4个不同供者来源的MSC的札A高分辨分型和STR基因分型结果为MSC3的TP表达阳性，MSC2在5代出现支原体污染。结论：在体外培养过程中MSC干细胞特性逐渐丢失，其中向成骨方向的分化潜能降低。MSC在8代以前可作为实验研究及临床应用的良好对象。     

骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖及凋亡的影响

本研究比较K562细胞与相同数量以及不同数量的人骨髓间充质干细胞（MSC）黏附培养前后K562细胞增殖、细胞周期和凋亡的变化,以探讨MSC对人白血病K562细胞生长的影响。通过建立正常人骨髓MSC的体外培养体系及其与K562细胞共培养的体系测定K562细胞的生长曲线;将不同数量的MSC与K562细胞共培养测定K562细胞的增殖率曲线;应用流式细胞术检测K562细胞周期以及凋亡的变化。结果显示：与单独K562细胞培养相比,K562细胞与相同数量MSC共培养后,生长受抑;K562细胞与不同数量MSC共培养后,MSC对K562细胞的抗增殖作用呈剂量依赖性;细胞周期分析发现,K562细胞与MSC共培养后,G0／G1期以及G2／M期的细胞增加,S期的细胞减少。共培养24、48、72小时后流式细胞仪检测发现,K562细胞的凋亡率下降。结论：正常人骨髓MSC能使导致K562细胞生长抑制,阻止K562细胞周期的运行,凋亡率下降,且在一定范围内,随着MSC数量的增加,对K562细胞的抗增殖作用增强。     

CD34^＋细胞来源的树突状细胞对骨髓间充质干细胞的生物学特性影响

本研究探讨间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）在抑制树突状细胞（dendritic cell,DC）发育过程中生物学特性的变化。将CD34^＋造血干细胞来源的树突状细胞与MSC共培养,用流式细胞术检测共培养后（DC／MSC）的表型变化;RT—PCR检测造血和免疫相关分子的表达;用诱导实验观察其分化潜能的改变。结果表明：DC／MSC不表达CD31、CD34、CD45、CD14、CD86。HLA—ABC、CD29、CD73的表达较对照组明显降低,即对照组与共培养组阳性率分别为93．1％vs13．44％,98．3％vs78．8％,95．3％vs 75．9％。另外,DC／MSC表达TGF—β,M—CSF等细胞因子均有所增加;进一步将DC／MSC向脂肪细胞诱导分化,诱导后细胞内不能形成脂滴,但其仍保持向成骨分化的特性。结论：DC发育对MSC的基本特性产生一定影响,导致MSC表面间质性标志表达减少,分化能力降低,而造血及免疫相关因子表达则增加。