环孢霉素A合成抗原的单抗制备技术探讨

目的：研究利用自制的合成抗原制备环孢霉素A单克隆抗体的方法。方法：利用光化学反应将环孢霉素A与聚-L-赖氨酸偶联为合成抗原,免疫BALB／e小鼠,将免疫后小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0进行细胞融合,经反复筛选亚克隆获得抗CsA抗体的杂交瘤细胞株,以间接ELISA法进行抗体鉴定。结果：获得4株分泌抗CsA抗体的杂交瘤细胞株,其中2株分泌的抗体效价高,有一定特异性。结论：该抗原合成和免疫的方法切实可行,但单克隆抗体制备及保存方法有待进一步改进。     

人转铁蛋白受体特异性单克隆抗体的研制及其初步鉴定

目的 建立能分泌人转铁蛋白受体(TfR)特异性抗体的杂交瘤细胞株,并对其分泌的抗体进行初步鉴定. 方法 将人肝癌细胞株HepG2分离纯化的TfR蛋白,采用常规法免疫BALB/C小鼠;采用间接ELISA法测定免疫血清抗体效价;采用常规聚乙二醇(PEG)介导法,将免疫小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0融合,用含HAT培养基筛选杂交瘤细胞;采用间接ELISA和Cell-ELISA法筛选TfR抗体阳性的杂交瘤细胞;采用有限稀释法进行克隆和多次亚克隆以建立稳定分泌TfR抗体的杂交瘤细胞株;将杂交瘤细胞注射经石蜡油致敏的小鼠腹腔以产腹水抗体,采用硫酸-辛酸法纯化腹水抗体;采用秋水仙素处理,计数细胞染色体数以进行杂交瘤细胞鉴定;采用免疫荧光染色法和Western blot法初步鉴定抗体与细胞表面或细胞总蛋白中TfR的结合. 结果 提取纯化的人TfR蛋白免疫小鼠获得成功,其1∶5 000稀释的血清抗体光吸收值(A490)是对照小鼠血清(1∶200稀释)的16倍以上;细胞融合率为42.22%,其中TfR抗体阳性孔20个,抗体阳性率为13.16%;抗体阳性孔B6和孔E8中杂交瘤细胞经克隆和亚克隆后建立起稳定分泌抗体的细胞株;B6杂交瘤细胞染色体数量位于56~60条之间,应为B细胞和SP2/0细胞融合而来;腹水抗体染色使HepG2细胞表面出现明亮荧光,并且能使HepG2细胞提取的总蛋白电泳图谱在95 000处出现清晰条带,表明该杂交瘤细胞分泌的抗体能特异性结合TfR蛋白.结论 分泌抗人TfR抗体的小鼠杂交瘤细胞株已被筛选和建立;其分泌的抗体能与HepG2细胞的TfR特异性结合.     

高效价抗人血红蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高效价抗人血红蛋白(Hb)单克隆抗体并对其进行鉴定。方法用纯化人血红蛋白免疫Balb/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌抗人Hb单克隆抗体的细胞株,将阳性细胞株接种于小鼠腹腔制备单克隆抗体并对腹水抗体进行纯化,测定抗体亚类,分析其敏感性、特异性及纯化抗体的相对亲和力。结果共获得3株单克隆抗体杂交瘤细胞株,均与人Hb有较高的亲和力,其敏感性可达0.5μg/ml,而且与人肌红蛋白(Mb)及各种动物血红蛋白、肌红蛋白均无交叉反应。结论3株单克隆抗体杂交瘤细胞株有较好的特异性,与人Hb有较高的亲和力。     

抗食管癌单克隆抗体及食管癌细胞膜抗原的初步研究

以食管癌“109”细胞株免疫 BALB/C 小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0 融合,经三次克隆化,获得稳定分泌抗食管癌“109”细胞株单克隆抗体的杂交瘤细胞系2GF3。其分泌的单克隆2GF3抗体与外周血淋巴组胞、ABO 型红细胞、癌胚抗原以及3/5胃癌细胞株无反应,与2/5胃癌细胞株有弱(+)反应。与2GF3抗体对应的抗原为2GF3抗原,荧光标记检测表明后者主要表达在细胞膜上。用去污剂提取膜抗原进行电泳后转移至硝酸纤维素膜上进行酶标分析,2GF3抗原是分子量53KD 的糖蛋白,在还原及非还原条件下均显示相同的区带。它与抗癌胚抗原抗体及抗甲胎蛋白抗体均无反应,表明它不同于癌胚抗原和甲胎蛋白。     

抗人A型红细胞单克隆抗体的研究及其初步应用

在用人A型红细胞悬液免疫的Balb/c小鼠脾细胞与同系小鼠的骨髓瘤细胞进行融合屡遭失败的情况下,改用实体瘤分离出的骨髓瘤细胞进行融合,终获成功。融合后筛选出分泌盐水凝集抗体的杂交瘤细胞株,即为:3B_2、3H_2、8C_3细胞株。3株抗人A型红细胞单克隆抗体3B_2、3H_2、8C_3血清学检验和应用结果表明:3株单抗均可作为血型诊断试剂,可用以取代人源标准血清。     

乙酰胆碱受体单克隆抗体A49的序列分析

[ 目的 ]探讨重症肌无力自身抗体分子结构及其在发病机理中的作用 .[方法 ]利用聚合酶链反应从分泌乙酰胆碱受体单克隆抗体A49的杂交瘤细胞株扩增抗体的可变区基因 ,经转化受体菌大肠杆菌DH 5α克隆后 ,进行核苷酸序列分析 .[结果 ]A49的重链可变区基因由小鼠VHNP族基因编码 ,轻链可变区基因由小鼠Vk2组基因编码 ,与致病性乙酰胆碱受体抗体可变区核苷酸序列比较 ,其同源性均在 70 %以下 .[结论 ]A49分子结构与致病性乙酰胆碱受体抗体不同 ,A49诱导大鼠实验性自身免疫性重症肌无力的测定将有助于揭示抗体分子结构与致病性的关系     

分泌抗兔ⅧR:Ag单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

先从兔血浆中纯化ⅧR:Ag,然后用纯化的抗原免疫BALB/C小鼠。用免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP_2/O融合。采用ELISA法检测上清液中抗体滴度,得到了一株稳定分泌抗兔ⅧR:Ag单克隆抗体的杂交瘤细胞株。     

分泌抗体的杂交瘤细胞株的制备

目的应用杂交瘤技术制备出分泌抗肺癌抗体杂交瘤细胞株,为肺癌的早期诊断和免疫治疗提供可能靶点．方法用肺癌细胞株作免疫原免疫健康BALB／C小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得分泌高滴度抗肺癌抗体的杂交瘤细胞株,用间接ELISA和检测单抗体的特异性,双抗体夹心法测定免疫球蛋白同种型．结果通过细胞融合,筛选出2株持续分泌抗肺癌抗体的杂交瘤细胞株C5、B8,其分泌的抗体为IgM亚类,κ亚型,并和肺癌细胞发生特异性反应．结论成功完成细胞融合,制备了分泌抗体的杂交瘤细胞株．     

抗人肺腺癌杂交瘤细胞株的建立及初步鉴定

用人肺腺癌细胞株AGZ—83a常规免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合,获得一稳定分泌抗人肺腺癌单克隆抗体（McAb）的杂交癌细胞林──—QMC－WL99。制备并纯化了小鼠腹水抗体,腹水效价为5.5X106,亚型鉴定为IgG1。免疫组化结果显示QMC－WL99单抗的特异性较高,与肺腺癌有较好选择反应性,与正常组织无交及反应。该单克隆抗体的亲和常数为7.25×1010M－1,液氮冻再后复苏,杂交瘤细胞株QMC－WL99分泌抗体的能力不受影响。     

鼠源性抗人IgM μ链单克隆抗体的制备和鉴定

目的:建立能稳定分泌高效价抗人IgM μ链单克隆抗体的细胞株,收获并纯化抗体用于进一步研究.方法:小鼠免疫脾细胞与骨髓瘤细胞用PEG融合,小鼠体内诱生腹水的方法收获大量单克隆抗体,辛酸硫酸铵提纯,并鉴定其纯度.结果:获得3个稳定分泌抗体的细胞株M1、M2、M3,鉴定其亚类分别为IgG3、IgG2a、IgG1;腹水抗体纯化后获得纯化抗体含量分别为0.36 mg/ml、0.28 mg/ml、3.71 mg/ml.结论:用PEG进行细胞融合,辛酸硫酸铵盐析法纯化能够获得较高效价和纯度的抗体.     

鼠源性抗人IgMμ链单克隆抗体的制备和鉴定

目的 :建立能稳定分泌高效价抗人 Ig Mμ链单克隆抗体的细胞株 ,收获并纯化抗体用于进一步研究。方法 :小鼠免疫脾细胞与骨髓瘤细胞用 PEG融合 ,小鼠体内诱生腹水的方法收获大量单克隆抗体 ,辛酸硫酸铵提纯 ,并鉴定其纯度。结果 :获得 3个稳定分泌抗体的细胞株 M1、M2、M3,鉴定其亚类分别为 Ig G3、Ig G2 a、Ig G1;腹水抗体纯化后获得纯化抗体含量分别为 0 .36 mg/ ml、0 .2 8mg/ ml、3.71mg/ ml。结论 :用 PEG进行细胞融合 ,辛酸硫酸铵盐析法纯化能够获得较高效价和纯度的抗体     

人OX40单克隆抗体的制备、纯化及初步鉴定

目的 应用杂交瘤技术,制备鼠抗人OX40单克隆抗体.方法 以本室纯化的OX40胞外段融合蛋白免疫6～8周龄的雌性BalB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞阳性克隆.用杂交瘤细胞接种小鼠腹腔诱生腹水,腹水经饱和硫酸铵纯化沉淀后用间接ELISA法测定抗体的Ig类别.SDS-PAGE分析抗体的纯化程度,用免疫组化技术鉴定单克隆抗体与表达有OX40分子的组织及细胞特异性结合的情况.结果 获得1株能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞,细胞株诱生的小鼠腹水纯化后抗体纯度较高,Ig类别为IgG,蛋白浓度为6.129g/L.制备的单抗经淋巴细胞免疫组化及炎性淋巴组织免疫组化技术初步鉴定结果表明,该抗体与OX40单克隆抗体标准品制剂相比具有类同的特异性.结论 成功获得能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体具有较高的纯度和活性.     

抗人B型红细胞单克隆杂交瘤细胞株建立

将正常人B型红细胞悬液免疫BALB/C小鼠,取其脾脏细胞与FO骨髓瘤细胞融合,获得能分泌抗B型红细胞的单克隆杂交瘤细胞株。该株能分泌抗B抗体,与B型红细胞发生凝集,对鉴定ABO血型有一定价值。     

抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备及其ELISA检测方法的建立

目的制备抗赭曲霉毒素A（OA）的单克隆抗体（McAb）并对其进行初步鉴定,在此基础上建立竞争抑制酶联免疫吸附试验（ELISA）用于OA的检测。方法采用小剂量长周期的免疫方案,以OA 牛血清白蛋白（BSA）偶联物免疫雌性BALB/c小鼠,采用细胞融合法获得分泌抗OA的McAb的杂交瘤细胞株,用竞争抑制ELISA法进一步检测McAb的特异性,腹水诱生法大量制备McAb,以OA为竞争抗原,建立检测OA的竞争抑制ELISA。结果OA BSA免疫的BALB/c小鼠血清效价为1:512?000,与BSA有强烈的交叉反应。细胞融合后,ELISA筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞株,抗OA BSA的McAb与BSA的交叉反应率仅为3.5%,对分泌抗OA BSA特异的McAb的细胞株经3轮克隆化,抗体分泌阳性率达到100%,建立了1株能稳定分泌抗OA BSA McAb的杂交瘤细胞株,竞争抑制法进一步证明了该抗体是特异针对OA的,腹水诱生法制备了大量的McAb。竞争抑制ELISA线性范围为0.24～125?ng/mL,线性方程y=-0.113?2logx+0.901?6,相关系数r=0.98,最低检出浓度为0.24?ng/mL。样品的加标回收率为97.07%～107.83%。结论获得了分泌抗OA的McAb的杂交瘤细胞株,建立了OA检测的简单、灵敏、高效的ELISA检测方法。     

猪链球菌反应调节因子CovR单克隆抗体的制备与鉴定

目的CovR是一个全局性反应调控因子,对猪链球菌的致病性具有重要调控作用。文中制备抗2型猪链球菌（Streptococcus suis serotype2,S.suis2）反应调节因子CovR蛋白单克隆抗体（mAb）,以便对CovR的调控机制进行系统研究。方法以基因工程重组CovR蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选可稳定分泌抗CovR mAb的杂交瘤细胞株。通过间接ELISA法和Western blot鉴定抗CovR mAb的特异性后,制备小鼠腹水并测定单抗腹水的抗体效价。单抗分型ELISA鉴定抗CovR单克隆抗体IgG亚类。结果获得2株能稳定分泌抗CovR mAb的的杂交瘤细胞株1A4和4D7,其培养上清抗体效价分别为1∶800、1∶1600,其相应单抗腹水的抗体效价分别为1∶819200、1∶1638400。mAb 1A4和4D7IgG亚类分别为IgG2b、IgGl。结论成功制备了抗CovR mAb,为进一步研究CovR的调控机制奠定了基础。     

抗人A型红细胞单克隆抗体的研究及其初步应用

在用人A型红细胞悬液免疫的Balb／c小鼠脾细胞与同系小鼠的骨髓瘤细胞进行融合屡遭失败的情况下，改用实体瘤分离出的骨髓瘤细胞进行融合，终获成功。融合后筛选出分泌盐水凝集抗体的杂交瘤细胞株，即为：3B2、3H2，8C3细胞株。3株抗人A型红细胞单克隆抗体3B2、3H2，8C3血清学检验和应用结果表明；3株单抗均可作为血型诊断试剂，可用以取代人源标准血清。     

抗人胰腺癌单克隆抗体杂交瘤的建立

用小鼠骨髓瘤细胞系SP 2/0与新鲜癌组织匀浆免疫的Balb/C小鼠脾细胞融合制备抗人胰腺癌单克隆抗体。经间接荧光抗体法和免疫组织化学法筛选及有限稀释法克隆化后,获得一株产生与正常人体组织不反应,与人胰腺癌反应率高的抗人胰腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。     

annexin A2体外胚胎着床的功能阻滞研究

目的 将通过已有的小鼠体外胚胎着床模型对annexin A2在胚胎着床中的功能进行相应的研究。方法 将孕第4天ICR小鼠囊胚与ICR小鼠的内膜组织进行体外共培养。比较子宫内膜经annexin A2抗体预处理以及未经处理之间,各组胚胎黏着率的差异,并在共培养后进行组织学研究。结果 小鼠子宫内膜经浓度为1.0μg/ml及0.1μg/ml的annexin A2抗体预处理后小鼠囊胚在其上的黏着率分别为45.6%及53.6%;而抗体浓度为1.0μg/ml的正常IgG对照及未经抗体处理的空白对照组的黏着率分别为55.4%及59.0%。经过1.0μg/ml的annexin A2抗体预处理组与两组对照组之间的黏着率比较,差异无统计学意义。免疫组化实验发现,经过annexin A2抗体预处理后,未见到annexin A2表达明显降低。结论 annexin A2在第4天的子宫内膜组织表达明显高于第1天的子宫内膜组织。运用抗体进行阻滞实验时并不能显著降低体外胚胎在子宫内膜组织的黏着率。     

胃癌单克隆抗体的生物学特性

目的 探索胃癌单克隆抗体的生物学特性。方法 用国内胃癌细胞株免疫小鼠,通过杂交瘤技术,获得一系列单克隆抗体。结果 经免疫荧光染色,按抗原分布特性可分为三种不同类型;①1D1-1：只与胃癌细胞株反应,不与其它组织细胞反应。②1A2、5B10、4D6：不但与胃癌细胞株反应,也与所有正常、异常组织反应。③1D1-2：与胃癌细胞株反应,还与某些癌瘤等组织细胞反应,但是不与绝大多数正常组织细胞反应。结论 1D1-2是一种有研究价值和肿瘤相关抗体。     

抗伏马菌素B1单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立抗伏马菌素B1(FB1)的单克隆杂交瘤细胞株,制备抗FB1的单克隆抗体(McAb)。方法采用FB1-KLH偶联物小剂量长周期免疫BALB/c小鼠后,采用细胞融合方法获得分泌抗FB1的杂交瘤细胞株,采用多次亚克隆的方法建立了4株稳定分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株。腹水诱生法获得大量McAb,采用抗体亚类测定试剂盒鉴定抗体的亚类,SDS-PAGE测定抗体分子量,McAb的特异性和灵敏度用间接竞争抑制ELISA。结果免疫小鼠血清检测结果显示经过5次免疫后血清的效价稳定在1×10-6,经过4次亚克隆后建立4株稳定分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株,获得腹水,纯化抗体,抗体亚类属于IgG2a类,轻链为κ,轻链和重链的相对分子质量分别是55000和32000,ELISA检测抗体特异性显示可与FB1发生特异性反应,采用此抗体建立间接竞争抑制ELISA方法的线性范围在2～500ng/ml。结论制备了特异性和灵敏度较高的抗FB1单克隆抗体,为建立伏马菌素免疫学检测方法打下良好基础。