SCI大鼠脊髓前角细胞自噬相关蛋白Beclin-1表达的变化

目的：：观察脊髓全横断损伤对脊髓前角细胞Beclin-1表达的影响。方法：雄性Wistar大鼠随机分为模型组和假手术组,建立大鼠第2腰髓全横断损伤模型,分别于损伤后6h、1d、3d、7d、14d、21d取3-4腰髓,采用免疫荧光染色法观察大鼠脊髓前角细胞自噬相关蛋白Beclin-1的表达情况。结果：与假手术组相比,模型组损伤后各时间点大鼠脊髓前角Beclin-1免疫阳性细胞数明显升高(P＜0.01,P＜0.05）。脊髓损伤后3d脊髓前角细胞Beclin-1免疫阳性细胞数达到高峰,21d最低。结论：Beclin-1可能参与了神经元自噬状态的改变。     

自噬相关基因在慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型中的表达及意义

目的 检测慢性非细菌性前列腺炎(CNP)大鼠模型中自噬相关基因表达的水平及时序变化,探讨自噬在CNP病程中的可能作用.方法 取3月龄雄性SD大鼠40只,随机分为正常对照组和2、4、6周CNP模型组,每组10只.HE染色观察各组前列腺组织炎性细胞浸润情况,采用Western blot、免疫组化SABC法检测各组前列腺组织中自噬微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin-1的表达.结果 HE染色结果提示成功构建大鼠CNP模型,Western blot法、免疫组化法检测显示各实验组LC3、Beclin-1蛋白的表达均高于正常对照组,并随时间的推移表达量逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 自噬相关基因可能在CNP的发病过程中发挥重要作用.     

脓毒症患者外周血淋巴细胞自噬相关基因 Beclin-1和LC3的变化研究

目的 观察脓毒症患者外周血淋巴细胞自噬的变化,并探讨其临床意义。 方法 选取10例健康人、20例普通感染患者和20例脓毒症患者,分别设为H组、I组和S组,根据预后再将S组亚组分析分为存活组(14例)和死亡组(6例),收集年龄、性别、感染部位、原发病、白细胞(WBC)、血小板(PLT)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(Cr)、白蛋白、血糖和APACHEⅡ评分等资料,同时抽取外周血分离淋巴细胞,检测Beclin-1和LC3 mRNA相对表达量。 结果 3组年龄、性别、原发病和感染部位比较差异无统计学意义(均P>0.05),3组WBC、PLT、ALT、Cr、白蛋白和血糖比较差异有统计学意义(均P<0.01);I组和S组APACHEⅡ评分比较差异有统计学意义(P<0.01);3组外周血淋巴细胞中Beclin-1和LC3 mRNA的相对表达量比较差异有统计学意义(均P<0.01),存活组和死亡组之间Beclin-1和LC3 mRNA的相对表达量比较差异有统计学意义(均P<0.01);APACHEⅡ评分与Beclin-1具有线性负相关(r=-0.452,P<0.001),APACHEⅡ评分与Beclin-1之间的线性模型方程式:Y=-20.83+41.67X;APACHEⅡ评分与LC3具有线性负相关(r=-0.641,P<0.001),APACHEⅡ评分与LC3之间的线性模型方程式:Y=-6.25+62.5X。在诊断脓毒症方面,Beclin-1:ROC曲线下面积为0.791,标准误为0.070,P<0.001,LC3:ROC曲线下面积为0.851,标准误为0.066,P<0.001。 结论 脓毒症外周血淋巴细胞自噬水平明显降低,可以反映脓毒症的免疫状态,并且在临床上可以作为普通感染和脓毒症的判断指标,为脓毒症诊断提供新思路。      

饥饿诱导胶质瘤细胞自噬发生及Beclin-1表达的变化

目的 探讨饥饿诱导大鼠胶质瘤细胞C6自噬的发生及自噬相关蛋白Beclin-1的变化。方法 在培养大鼠胶质瘤细胞C6至对数生长期后,以无氨基酸培养液EBSS(Earle’s balanced salt)代替DMEM培养液培养细胞,培养1、3、6、12、18 h后收集细胞,采用蛋白质印迹分析和免疫荧光检测特异性标记自噬的微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC-3)以及自噬相关蛋白Beclin-1,采用透射电镜观察自噬体。结果 饥饿处理1 h后胶质瘤细胞C6中LC-3表达开始增加,并随着饥饿时间延长而逐渐增加,12 h达到高峰后开始下降;免疫荧光下可见点状自噬体;透射电镜下观察到自噬体的形成。饥饿处理1 h后胶质瘤细胞C6中Beclin-1表达开始升高,3 h达到高峰后逐渐下降;免疫荧光下观察到Beclin-1表达增高。结论 饥饿可以诱导胶质瘤细胞C6发生自噬,Beclin-1与饥饿诱导的胶质瘤细胞C6的自噬相关,为进一步研究Beclin-1在胶质瘤细胞自噬中的作用机制打下基础。     

缺血预处理通过增强自噬水平及抑制自噬性细胞死亡保护脊髓神经

目的:探讨缺血预处理保护脊髓神经的具体机制?方法:50只成年SD大鼠随机分为假手术组(A组5只)?缺血再灌注组(B组20只)?缺血预处理组(C组5只)?缺血预处理+缺血再灌注组(D组20只)?A组动物麻醉后仅切开腹腔后关腹;B组和D组采用左肾下方0.5 cm处腹主动脉夹闭法夹闭0.5 h后松开,再灌注3?6?12?24 h,其中D组在缺血再灌注损伤前行缺血5 min?再灌注5 min缺血预处理,共3次;C组仅行3次缺血预处理?造模成功后,利用HE染色和免疫组化评估各组神经元的存活率,透射电镜观察自噬活性,免疫组化和蛋白印迹分析自噬标志物LC3-Ⅱ和自噬相关蛋白Beclin-1的表达情况?结果:缺血再灌注组中,LC3-Ⅱ蛋白在再灌注3 h后显著升高达到峰值后明显下降,24 h后几乎无表达;Beclin-1蛋白于再灌注后3 h开始升高且在24 h达到峰值;再灌注24 h后实验动物表现出明显的脊髓损伤症状,脊髓神经细胞存活率明显降低?缺血预处理+缺血再灌注组中,LC3-Ⅱ蛋白表达从再灌注3 h开始升高并持续至再灌注24 h;Beclin-1蛋白在再灌注24 h后才开始升高;与缺血再灌注组相比,缺血预处理+缺血再灌注组脊髓神经元死亡率明显降低?结论:缺血预处理通过维持缺血再灌注后神经细胞自噬水平并抑制自噬性细胞死亡从而保护脊髓神经细胞?     

自噬相关基因Beclin-1和MAP1LC3表达与口腔癌生物学特征的关系

目的:研究自噬相关基因Beclin-1和MAP1LC3表达与口腔癌生物学特征的关系。方法:取口腔癌组织和癌旁组织,检测Beclin-1和MAP1LC3的mRNA表达量;培养舌癌细胞株CTST-2和正常颊粘膜的原代上皮细胞,检测自噬标志分子(Beclin-1、MAP1LC3)以及促凋亡基因(P53、Caspase-3)、抗凋亡基因(生存素、Bcl-2、Bmi-1)的mRNA表达量。结果:舌癌、颊粘膜癌、牙龈癌、口底癌组织中Beclin-1、MAP1LC3的mRNA含量显著低于相应的癌旁组织;舌癌细胞CTST-2中Beclin-1、MAP1LC3的mRNA含量均低于正常粘膜细胞;舌癌细胞CTST-2中P53、Caspase-3的mRNA含量均低于正常粘膜细胞,与Beclin-1、MAP1LC3的mRNA含量呈正相关;CTST-2中生存素、Bcl-2、Bmi-1的mRNA含量均高于正常粘膜细胞,与Beclin-1、MAP1LC3的mRNA含量呈负相关。结论:口腔癌中自噬相关基因Beclin-1和MAP1LC3的表达量异常降低且与癌细胞的促凋亡基因、抗凋亡基因的表达具有显著相关性。     

体外探究脱落酸对肺腺癌细胞系Spc-A1自噬的影响

目的观察脱落酸(ABA)作用于肺腺癌细胞株Spc-A1引起自噬方面的变化,研究ABA对Spc-A1细胞自噬的影响。方法以人肺腺癌细胞系Spc-A1为研究对象,ABA给药浓度分别为0.8、20、100μmol/L,采用MTT法检测ABA作用后Spc-A1细胞的活力;激光共聚焦显微镜观察ABA作用于Spc-A1细胞后自噬现象;提取培养细胞mRNA及蛋白质,分别采用荧光实时定量PCR、蛋白印迹法检测自噬相关基因Beclin-1及LC3-Ⅱ的表达。结果 ABA作用后,肺腺癌细胞Spc-A1活力随着ABA浓度的增高而下降,各处理组之间差异具有统计学意义(P<0.001);ABA可诱导Spc-A1细胞自噬,自噬现象随药物浓度增高而增加;ABA处理后Bec-lin-1及LC3-Ⅱ的mRNA表达量随着ABA浓度的增加而增高,各处理组表达量差异具有统计学意义(P<0.05);蛋白表达结果显示ABA 100μmol/L处理组与对照组Beclin-1表达量差异具有显著性(P=0.04);ABA 100μmol/L处理组与对照组LC3-Ⅱ表达量差异具有显著性(P=0.005),ABA 0.8μmol/L组与ABA 100μmol/L组之间LC3-Ⅱ表达量差异具有显著性(P=0.039),余处理组表达量两两之间未见显著性差异。结论 ABA可通过调节自噬信号转导通路中相关基因的表达诱导肺腺癌细胞Spc-A1自噬,随着自噬的增加,可能抑制肿瘤的生长。     

鞘内注射新斯的明和吗啡对大鼠脊髓背角c-fos表达的影响

目的 研究鞘内注射新斯的明和吗啡对大鼠脊髓背角c-fos表达的影响。方法 在大鼠切口疼痛模型上结合鞘内置管技术,采用累积疼痛评分法评定大鼠疼痛行为,运用免疫组织化学法观察术前或术后鞘内注射新斯的明和吗啡对脊髓背角c-fos表达的影响。结果 手术组大鼠累积疼痛评分明显高于假手术组,术前或术后鞘内注射新斯的明及吗啡均可明显降低手术切口引起的累积疼痛评分升高,各用药组间无明显差别。手术组大鼠脊髓背角Fos-LI神经元明显多于假手术组(P<0.01)。术前或术后鞘内注射吗啡、新斯的明和吗啡分别可使切口疼痛引起的Fos-LI减少69％和48％,76％和55％,术前和术后两用药组间比较差异亦有统计学意义。新斯的明两用药组的Fos-LI表达均未见明显减少(P>0.05)。结论 鞘内注射新斯的明和吗啡可减少术后疼痛大鼠脊髓背角c-fos的表达,尤以术前用药为甚。     

大鼠脊髓损伤后自噬相关蛋白LC3和BNIP3的表达

目的检测大鼠脊髓损伤后神经元自噬以及相关蛋白的表达。方法 24只雄性SD大鼠,按随机数字表法分为假手术组,损伤后6、12、24、48、72 h组,每组4只。假手术组仅作T10椎板切除,Allen’s法建立损伤模型。透射电镜观测损伤组织的超微结构,Western blot检测LC3、BNIP3的表达变化,免疫荧光检测LC3、BNIP3的表达及定位。结果透射电镜下脊髓损伤48 h后观测到自噬小体;Western blot检测显示LC3-Ⅱ表达量48 h后明显升高(P<0.01),BNIP3损伤后12 h明显升高(P<0.05);免疫荧光显示LC3、BNIP3在损伤区域的神经元中高表达。结论大鼠脊髓损伤后激活神经元自噬以及相关蛋白表达。     

关节炎慢性吗啡耐受大鼠脊髓背角EAAC1的表达

目的 在佐剂性关节炎大鼠模型基础上建立关节炎大鼠慢性吗啡耐受模型,观察兴奋性氨基酸载体1(EAAC1)在关节炎慢性吗啡耐受大鼠的脊髓背角表达的变化,探讨EAAC1在吗啡耐受形成机制中的作用.方法 将36只健康雄性SD大鼠随机分为6组(n=6),行鞘内置管.其中4组制成佐剂性关节炎模型,分别经鞘内给予生理盐水(A组)、吗啡10μg(B组)、吗啡20μg(C组)、吗啡10μg加纳洛酮10μg(D组),另外两组非致炎大鼠分别经鞘内给予生理盐水(E组)、吗啡20μg(F组).各组给药均为1日2次,连续7d.用Von Frey丝动态检测大鼠50%机械缩爪阈值,分别以免疫组化和Western blot方法检测各组大鼠给予吗啡后脊髓背角EAAC1表达.结果 B、C两组关节炎大鼠在鞘内给予吗啡后第7天形成较稳定的机械痛敏,标志关节炎大鼠慢性吗啡耐受模型建立成功,其脊髓背角EAAC1的表达下调.结论 脊髓EAAC1可能参与炎性痛大鼠慢性吗啡耐受的形成机制.     

地塞米松对慢性吗啡耐受大鼠脊髓背角神经元凋亡的影响

目的 探讨糖皮质激素受体参与慢性吗啡耐受的机制,以及地塞米松对慢性吗啡耐受大鼠脊髓神经元凋亡的影响.方法 20只健康雄性SD大鼠随机分为4组,分别为经鞘内给予生理盐水(C组)、吗啡(M组)、吗啡+糖皮质激素受体拮抗剂RU38486(M/R.组)和吗啡+糖皮质激素受体激动剂地塞米松(M/D组),1d 2次,连续6 d.采用甩尾实验评价大鼠热痛敏,给药后第7天取L3～L5脊髓进行TUNEL染色.结果 M组大鼠在鞘内给予吗啡后形成较稳定的吗啡耐受,地塞米松对吗啡耐受的形成有促进作用.M组脊髓背角凋亡细胞数较C组增加(P<0.05).与M组比较,M/D组脊髓背角凋亡细胞数显著增加(P<0.05).结论 脊髓神经元凋亡可能是慢性阿片耐受的神经基础,糖皮质激素受体可能在阿片耐受脊髓神经细胞凋亡过程中发挥作用.     

骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制剂调节自噬抑制谷氨酸诱导的大鼠脊髓背角神经组织细胞凋亡

目的 探讨过表达骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制剂(BMP and activin membrane-boundinhibitor,BAMBI)对谷氨酸诱导的大鼠脊髓背角神经元和星形胶质细胞凋亡的影响.方法 原代培养新生Wistar大鼠脊髓背角神经元和星形胶质细胞,将细胞分为6组:正常对照组,谷氨酸组,空载组,BAMBI过表达组,siRNA对照组和BAMBI沉默组.Western blot检测各组细胞中BAMBI的表达,流式检测细胞凋亡,Western blot检测自噬标志分子微管相关蛋白轻链3(microtubule associated protein lightchain 3,LC3),Beclin1和p62的表达,荧光显微镜检测GFP-LC3的含量,最后Western blot检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白介素-1β(IL-1 β),裂解后的半胱天冬酶(cleaved-Caspase3)的表达.结果 与对照组相比,谷氨酸诱导的细胞凋亡增加,LC3-Ⅰ的表达降低,LC3-Ⅱ,Beclin1和p62的表达增加,GFP-LC3的含量增加,TNF-α、IL-1 β和cleaved-Caspase3的表达增加(P＜0.05);与谷氨酸组相比,转染pcDNA-BAMBI的细胞凋亡减少,LC3和Beclin1的表达显著增加,LC3-Ⅰ和p62的表达降低,细胞内可见大量的GFP-LC3堆积,TNF-α、IL-1β和cleaved-Caspase3的表达显著下降(P＜0.05).BAMBI沉默组的结果与过表达组相反.结论 过表达BAMBI可增强自噬,抑制谷氨酸诱导的大鼠脊髓背角神经元和星形胶质细胞凋亡.     

高剂量葡萄糖对小鼠肌管细胞自噬表达的影响

目的：探讨高剂量葡萄糖对肌管细胞自噬表达的影响。方法：使用分化培养基诱导小鼠成肌细胞分化成肌管细胞,分正常剂量（5.5 mmol/L）和高剂量（17 mmol/L和30 mmol/L）葡萄糖浓度的3组培养基培养肌管细胞,于6、12、24、36、48、60、72 h后分别收集细胞,检测自噬相关蛋白和mRNA表达量,并用串联荧光标记LC3（mRFP-GFP-LC3）慢病毒转染小鼠成肌细胞,动态监测自噬流。结果：高剂量葡萄糖条件下肌管细胞自噬表达存在2个阶段,30 mmol/L组培养24 h自噬表达下降,LC3和Beclin-1蛋白表达水平比5.5 mmol/L组低（P＜0.05）;而在30 mmol/L葡萄糖条件下培养48、60和72 h后自噬水平增强,LC3和Beclin-1的基因表达均明显升高（P＜0.05）。肌管细胞GFP和RFP荧光斑点的定位与数量分析也证明30 mmol/L葡萄糖浓度的培养基培养48、60和72 h后可显著增加自噬体和自噬溶酶体的合成。结论：高剂量葡萄糖对肌管细胞自噬表达有重要影响,不同时间自噬表达存在差异,长期高血糖状态可诱导自噬过度活化。     

鞘内注射吗啡对切口痛大鼠脊髓Fos表达的影响

目的: 动态观察鞘内注射(intrathecal,IT)吗啡对大鼠切口疼痛及脊髓Fos蛋白表达的影响。方法: 雄性SD大鼠96只,分成4组,以累积疼痛评分观察大鼠行为学,以免疫组织化学法测定大鼠脊髓Fos蛋白表达。结果: 在术后2 h、24 h、48 h时点,对照组大鼠的累积疼痛评分明显高于假手术组,术前和术后给药组评分较对照组均明显降低(P<0.01),但两组间差异均无统计学意义(P>0.05);术后第72 h,各手术组之间差异均无统计学意义(P>0.05);术后96 h和120 h,各组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。在术后2 h,对照组大鼠Fos蛋白表达明显增多(P<0.01),而IT吗啡可明显抑制脊髓背角Fos蛋白表达,尤以术前给药为甚;术后24~120 h,各手术组间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论: 术前或术后单次IT吗啡,仅在术后早期有镇痛作用并能抑制Fos蛋白表达的增加。     

神经病理性疼痛大鼠脊髓背角Sirt1与miR-34b表达的变化

目的研究Sirt1与miR-34b在神经病理性疼痛大鼠脊髓背角中表达变化的临床意义。方法将14只雄性SD大鼠随机分为假手术组（Sham组）和坐骨神经慢性压迫性损伤组（CCI组）,每组7只。于模型建立前1d及术后第7、14天,测定大鼠机械缩足反射阈值（MWT）和热缩足反射潜伏期（TWL）。术后第14天取大鼠L4~5节段脊髓进行病理学检查,HE染色后观察脊髓背角运动神经元的数量变化。real-timePCR检测脊髓背角内Sirt1与miR-34b的表达,Westernblot测定大鼠脊髓背角内Sirt1、脑源性神经营养因子（BDNF）和环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）的表达。结果经MWT和TWL验证,大鼠CCI神经病理性疼痛模型建立成功。HE染色显示,与Sham组比较,CCI组大鼠在手术后7、14d脊髓背角神经元数量显著减少（均P＜0.05）。real-timePCR结果显示,与Sham组相比,CCI组Sirt1表达降低,miR-34b表达升高（均P＜0.05）。Westernblot显示Sirt1与CREB表达降低,pCREB与BDNF表达增加。结论Sirt1与miR-34b的表达变化可能参与坐骨神经慢性压迫性损伤导致的神经病理性疼痛的形成和维持。     

P物质对慢痛引起的脊髓背角神经元电活动的影响

目的：观察Ｐ物质（ＳＰ）及其受体阻断剂Ｓｐａｎｔｉｄｅ对Ｗｉｓｔａｒ大鼠脊髓背角神经元自发放电和伤害性慢痛放电的影响。方法：采用多管微电极细胞外记录和离子微电泳方法。结果：①电泳ＳＰ可使脊髓背角神经元单位放电增多，其效应可被Ｓｐａｎｔｉｄｅ阻断。②电泳ＳＰ又可抑制福尔马林引起的神经元伤害性痛放电，此效应可被纳洛酮和Ｓｐａｎｔｉｄｅ翻转。结论：在痛觉调制过程中，脊髓内ＳＰ起着传递痛觉信息和镇痛的双重作用。