大鼠脑基底动脉平滑肌细胞培养及功能鉴定

目的探讨大鼠脑基底动脉平滑肌细胞的培养方法,了解生长特性。方法用组织贴块法培养大鼠脑基底动脉平滑肌,用免疫细胞化学法鉴定细胞,用RF-5000荧光分光光度计观察细胞内Ca2+浓度的动态变化来检测其活性。结果培养5d后可见组织块周围有平滑肌细胞长出,2wk后可融合传代,经平滑肌特异性肌动蛋白α-actin鉴定,确定为平滑肌细胞。钙离子通道激动剂可诱导细胞Fura-2荧光比值(F340/F380)上升,细胞活性良好。结论组织贴块法是大鼠脑基底动脉平滑肌细胞培养简单、高效、经济的实验方法,为脑血管疾病发病机制的研究提供了理想的细胞模型。     

Cl~-通道阻断剂对5-HT和CPA引起的兔脑椎基底动脉平滑肌细胞Ca~(2+)内流的影响

目的　在培养的兔脑椎基底动脉平滑肌细胞上观察5 HT和CPA诱导的Ca2 + 内流的特性 ,电压依赖性Ca2 + 通道 (VDC)抑制药尼莫地平 ,非电压依赖性Ca2 + 通道抑制药SK&F963 65及Cl-通道阻断剂DIDS、NPPB对两种激动剂引起 [Ca2 + ]i 反应的影响 ,以探讨脑血管平滑肌细胞中 5 HT引起Ca2 + 内流的特性、Cl-通道与Ca2 + 内流的关系。方法　采用生物荧光双波长影像分析系统瞬即测定单细胞胞质[Ca2 + ]i 技术。结果　① 5 HT和CPA均能诱导平滑肌细胞[Ca2 + ]i 呈双相升高 ,并且 5 HT诱导的Ca2 + 释放是环匹阿尼酸 (CPA)敏感Ca2 + 池的一部分 ;②尼莫地平对 5 HT和CPA触发的Ca2 + 内流无明显影响 ,而SK&F963 65可阻止二者触发的Ca2 + 内流 ;③Cl-通道阻断剂DIDS、NPPB呈浓度依赖性抑制Ca2 + 内流 ,在SK&F963 65最大限度抑制Ca2 + 内流后 ,DIDS、NPPB可进一步抑制Ca2 + 内流 ;而Ca2 +内流被DIDS、NPPB分别最大抑制后 ,SK&F963 65也可进一步抑制Ca2 + 内流。结论　 5 HT引起的Ca2 + 内流是经SK&F963 65敏感的非VDC ,其中包含Ca2 + 释放引起的Ca2 + 内流 (CRAC)成分与非CRAC成分 ,并且这两部分Ca2 +内流均与DIDS、NPPB敏感的Cl-通道开放有关     

蛋白酪氨酸磷酸化参与调控主动脉平滑肌细胞容积调节性氯通道电流

目的　探讨蛋白酪氨酸磷酸化在胚胎鼠主动脉平滑肌细胞系A10细胞容积调节性氯通道电流中的调控作用。方法　膜片钳全细胞记录技术。结果　①在A10细胞 ,低渗溶液激活一外向整流电流 ,该电流在正电位 (≥ 6 0mV)时缓慢失活。其反转电位为 (- 1 5± 3 4 )mV ,接近Cl-平衡电位 (Ecl=0mV)。降低胞外Cl-浓度其反转电位随之变化。高渗溶液可抑制该电流。②DIDS(10 0 μmol·L-1)电压依赖性抑制容积调节性氯通道电流 ,在 +80mV和 - 80mV的抑制率分别为 5 3 7%± 6 2 %和 2 9 8%± 4 9%。③酪氨酸激酶抑制剂genistein (30 μmol·L-1)抑制该电流 ,在 +80mV和 - 80mV对其抑制率分别为6 2 3%± 11 3%和 6 6 9%± 10 5 % ,其抑制作用无电压依赖性。④酪氨酸磷酸酶抑制剂sodiumorthovanadate(Na3 VO4,5 0 0 μmol·L-1)增强该电流 ,其作用无电压依赖性 ,在 +80mV和 - 80mV电流幅度分别增加了 4 4 8%±14 5 %和 4 7 1%± 13 6 %。结论　A10细胞上存在有容积调节性氯通道。蛋白酪氨酸磷酸化参与调节A10细胞容积调节性氯电流的激活     

平滑肌细胞膜的钙激活Cl~-通道

在多种平滑肌上都已发现Ｃａ２＋激活Ｃｌ－通道。胞内游离钙升高是钙激活氯通道的必要条件。多种刺激剂诱导胞内钙库释放钙而同时激活钾通道［ＩＫ（Ｃａ）］和氯通道［ＩＣｌ（Ｃａ）］。平滑肌细胞上激活ＩＣｌ（Ｃａ）的［Ｃａ２＋］ｉ阈值因动物种属和组织差异而不同。用荧光指示剂直接测定大鼠门静脉平滑肌细胞上的［Ｃａ２＋］ｉ得出激活ＩＫ（Ｃａ）的最小［Ｃａ２＋］ｉ应大于７０～８０μｍｏｌ·Ｌ－１,比激活ＩＣｌ（Ｃａ）的最低浓度１８０μｍｏｌ·Ｌ－１要小,因此认为ＩＫ（Ｃａ）要比ＩＣｌ（Ｃａ）对［Ｃａ２＋］ｉ更敏感。胞外钙通过电压依赖性钙通道进入胞内,［Ｃａ２＋］ｉ升高也能激活氯通道。Ｇ蛋白与某些受体偶联激活胞内第二信使ＩＰ３而激活氯通道。钙激活氯通道的电导很小,从全细胞电流分析应小于１０ｐＳ。平滑肌细胞上的氯平衡电位（ＥＣｌ）正于静息膜电位,因此Ｃｌ－通道开放Ｃｌ－外流驱动膜电位向ＥＣｌ方向靠近,形成膜的去极化。Ｃａ２＋激活Ｃｌ－通道开放使细胞膜去极化并引起细胞的兴奋,这种通道在由激素或神经递质引起平滑肌细胞的兴奋过程中起重要作用。     

硝苯地平对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的研究钙拮抗剂硝苯地平对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响 ;探讨钙离子拮抗剂对肺血管构型重建的抑制作用。方法分离培养大鼠肺动脉平滑肌细胞 ;用MTT法检测细胞增殖 ;用流式细胞仪分析细胞周期。结果硝苯地平能剂量依赖地抑制血清诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖 ,对照组的增殖指数和S期细胞分数为 36 0 2 %和 15 88% ;硝苯地平 1× 10 -8mol·L-1、1× 10 -7mol·L-1、1× 10 -6mol·L-1组的PI和SPF分别为 31 16 %、2 6 94 %、2 4 95 %和 13 10 %、11 4 7%、9 6 0 %。结论肺动脉平滑肌细胞增殖中有钙离子信号的参与 ;硝苯地平能够抑制血清诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖 ;硝苯地平对肺血管构型重建可能有一定的抑制作用     

重组人白介素-10对大鼠血管平滑肌细胞增殖和细胞周期的影响

目的　观察重组人白介素 10 (rhIL 10 )分别对肿瘤坏死因子 (TNF α)和血小板源性生长因子 (PDGF BB)刺激下离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖和细胞周期的影响。方法　体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞 ,采用MTS/PES法确定血管平滑肌细胞的增殖状态 ,应用流式细胞术测定细胞周期。结果　与对照组相比 ,肿瘤坏死因子和血小板源性生长因子均对血管平滑肌细胞增殖具有明显的刺激作用 (P <0 0 5 )。rhIL 10单独应用对血管平滑肌细胞生长没有影响 (P >0 0 5 )。在TNF α和血小板源性生长因子分别刺激下 ,rhIL 10均可抑制血管平滑肌细胞的生长(P <0 0 5 )。流式细胞术测定的结果显示rhIL 10分别可以使TNF α和PDGF BB作用下的VSMCs大部分处于G0 /G1期 ,与对照组相比差异有显著性 (P <0 0 1)。结论　重组人白介素 10可抑制细胞因子和生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖     

亚硝基乙酰青霉胺抑制人血管平滑肌细胞增殖的实验研究

目的探讨亚硝基乙酰青霉胺对人血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的抑制作用。方法将不同浓度的亚硝基乙酰青霉胺300、500、800、1000μmol/L作用于体外培养的血管平滑肌细胞(VSMC),采用氚-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入的方法检测细胞的增殖。结果在500、800、1000μmol/L的亚硝基乙酰青霉胺作用下,VSMC的3H-TdR掺入量cpm分别为1096.33±85.60、852.00±57.80、693.00±49.60,均与对照组的1270.00±96.50有显著性差异(P<0.01),并表现为剂量依赖性(P<0.01)。结论亚硝基乙酰青霉胺能够抑制人VSMC的增殖,可能有防治经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄的作用。     

消化法培养大鼠脑血管平滑肌细胞

目的建立大鼠基底动脉平滑肌细胞培养的方法。方法取大鼠基底动脉,剪成约0.2mm的小段,用含胶原酶Ⅱ型(0.5g.L-1)、弹性酶(0.15g.L-1)、透明质酸酶Ⅳ-S型(0.5g.L-1)及脱氧核糖核酸酶Ⅰ型(0.1g.L-1)的消化液在37℃消化1h。而后用含20%FCS的DMEM/F12进行培养。结果原代培养3d后细胞可少量贴壁,1wk左右可传代,细胞传代成活率达97%。光镜和免疫细胞化学染色检测第4代细胞纯度为98%。结论与目前国内培养脑血管平滑肌细胞的方法相比,本方法操作简单,培养周期短,细胞纯度高。     

几种药物对肺主动脉平滑肌细胞增殖作用影响的比较研究

目的研究钙拮抗剂硝苯地平(Nif)、地尔硫(Dil)、ACEI类卡托普利(Cap)、依那普利(Ena)抑制肺主动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖的作用,比较两类药物对抑制肺主动脉平滑肌细胞增殖作用的影响。方法培养大鼠肺主动脉血管平滑肌细胞并观察钙拮抗剂、ACEI类及药物合用对细胞增殖作用的影响。结果Nif,Dil,Cap,Ena在10-4,10-5,10-6,10-7mol/L浓度下,对15%胎牛血清(FBS)所致的PASMC增殖均有明显抑制,且呈剂量依赖性的关系(P<0.05,与对照组相比);Nif+Cap及Dil+Ena合用,在10-10mol/L药物浓度下,能明显抑制15%FBS所致的PASMC增殖(P<0.05,与对照组相比);Dil与Nif,Cap,Ena相比较,对15%FBS所致的PASMC增殖作用的影响更明显(P<0.01,与对照组相比);结论钙拮抗剂Nif,Dil,ACEI类Cap,Ena能够浓度依赖性地抑制PASMC的增殖且作用显著。与其他药物相比,Dil抑制PASMC增殖的作用非常显著。Nif+Cap,Dil+Ena合用,在较低药物浓度下具有抑制PASMC增殖的协同作用。     

原花青素对人冠状动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究原花青素对人冠状动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。方法采用MTT实验检测原花青素对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞增殖的影响,运用流式细胞术、基因组DNA电泳观察凋亡特征性＂梯状＂条带检测细胞凋亡,采用Caspase活性定量检测试剂盒分析Caspase-9、Caspase-3的活性。结果原花青素对人冠状动脉平滑肌细胞具有明显的抑制作用,且其作用有剂量依赖性。流式细胞仪检测显示原花青素可以显著诱导人冠状动脉平滑肌细胞凋亡,DNA电泳显示原花青素作用于人冠状动脉平滑肌细胞后出现凋亡细胞特有的DNA阶梯状条带。原花青素作用后人冠状动脉平滑肌细胞Caspase-9、Caspase-3活性明显升高。结论原花青素可能通过线粒体信号通路抑制人冠状动脉平滑肌细胞的生长并诱导其凋亡。     

牛磺酸对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

观察了牛磺酸对自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）和Ｗｉｓｔａｒ－Ｋｙｏｔｏ大鼠（ＷＫＹ）动脉血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖的影响．结果显示牛磺酸（１．０ｍｍｏｌＬ－１）虽然抑制ＷＫＹ的ＶＳＭＣ的增殖，对ＳＨＲ的ＶＳＭＣ的生长却无影响，同时发现牛磺酸（１０ｍｍｏｌＬ－１）也不能减低小牛血清所致的ＳＨＲ的ＶＳＭＣ内肌醇磷脂量的异常增加．提示牛磺酸虽然可以通过抑制ＷＫＹ的ＶＳＭＣ增殖进而在防治某些血管性病变中发挥作用，但是对于ＳＨＲ这一遗传性高血压大鼠，牛磺酸既不能抑制ＶＳＭＣ的异常增殖也未能阻止肌醇磷脂量的增加．     

丹皮酚对动脉粥样硬化家兔血管平滑肌细胞增殖的影响

目的研究丹皮酚对动脉粥样硬化家兔血管平滑肌细胞增殖的影响。方法高脂饮食法复制家兔动脉粥样硬化病理模型;HE染色并光镜观察主动脉病理学改变;MTT法分析体外培养的兔血管平滑肌细胞增殖水平;全自动生化分析仪测定主动脉组织中脂质含量;酶法测定SOD、MDA含量;放射免疫分析法测定IL-1β、TNF-α的含量;免疫组织化学法检测主动脉组织中PCNA的蛋白表达。结果丹皮酚(75、150 mg.kg-1)治疗给药(ig,6 wk)能减轻模型动物主动脉内膜增厚及泡沫细胞数量;使主动脉组织中脂质、脂质过氧化反应以及炎性细胞因子含量等方面得到显著改善;并能显著抑制主动脉组织中PCNA蛋白的表达强度;丹皮酚(100~300 mg.L-1)可明显抑制体外培养的血管平滑肌细胞增殖反应。结论丹皮酚对血管平滑肌细胞增殖有明显抑制作用,可能是其降脂、减轻脂质过氧化反应以及炎性细胞因子含量等协同作用结果,并可能通过抑制PCNA的表达而调控动脉粥样硬化病变中的血管平滑肌细胞增殖周期。     

钾通道阻滞剂对大鼠支气管平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨电压依赖性延迟整流钾通道(K_V)、Ca²⁺激活钾通道(K_Ca)和ATP敏感性钾通道(K_ATP)对大鼠支气管平滑肌细胞(BSMC)增殖的影响。 方法应用免疫细胞化学、MTT微量比色分析法及流式细胞术,观察K_V,K_Ca和K_ATP对培养中大鼠BSMC增殖的影响。结果K_V阻断剂4-氨基吡啶(4-AP)显著促进大鼠BSMC增殖细胞核抗原的表达,提高BSMC吸光度值,使S+G₂M期细胞数显著增多,并显著提高基础状态下BSMC内Ca²⁺浓度,而K_Ca阻断剂四乙铵(TEA)和K_ATP阻断剂格列本脲(Glib)均无此效应。 结论大鼠BSMC K_V活性的抑制,可提高细胞内Ca²⁺浓度,促进细胞的增殖,而K_Ca和K_ATP对BSMC的增殖均无明显影响。     

普伐他汀对溶血磷脂酰胆碱促血管平滑肌细胞增殖及细胞粘附的影响

目的　探讨羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂普伐他汀对溶血磷脂酰胆碱 (LPC)促血管平滑肌细胞增殖及白细胞与内皮细胞粘附的影响。方法　用MTT法检测LPC对平滑肌细胞增殖的量效和时效关系及普伐他汀对LPC促平滑肌细胞增殖的影响 ;用直接记数法检测LPC诱导中性粒细胞系K5 6 2细胞与人脐静脉内皮细胞系ECV30 4细胞的粘附和普伐他汀对LPC所致白细胞与内皮细胞粘附的影响。结果　用 1～ 10 μmol·L-1LPC孵育血管平滑肌细胞 2 4～ 4 8h后 ,呈时间和剂量依赖性地诱导细胞增殖 ,而用 0 3～ 1mmol·L-1普伐他汀预孵育平滑肌细胞 1h ,再与 3μmol·L-1LPC共孵育 2 4～ 4 8h ,明显地抑制LPC所诱导的细胞增殖 ;用 3μmol·L-1LPC孵育ECV30 4细胞 12h显著增加K5 6 2细胞与ECV30 4细胞的粘附 ,而将ECV30 4细胞用 1mmol·L-1普伐他汀预处理后 ,明显减少白细胞与内皮细胞的粘附。结论　普伐他汀可抑制LPC促血管平滑肌细胞增殖及白细胞与内皮细胞粘附的作用。     

龙胆苦苷对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响

目的 观察龙胆苦苷对血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMC）增殖、迁移能力的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 体外分离培养大鼠血管平滑肌细胞,将血管平滑肌细胞随机分为分为control组、GPS处理组、PF-3758309+GPS组。采用噻唑蓝(MTT)法观察各组细胞增殖能力,计算细胞增殖抑制率;采用细胞划痕实验观察各组细胞迁移能力,计算细胞迁移率。采用Western blotting法检测各组细胞Pak4及MMP-2表达情况。结果 与对照组相比,龙胆苦苷处理组细胞增殖率及迁移率明显降低（P<0.01）,GPS组细胞内Pak4、MMP-2 表达水平明显降低（P<0.01）;而与GPS组相比,PF-3758309+GPS组可明显增加细胞增殖率及迁移率（P<0.05）,血管平滑肌细胞内 MMP-2 表达水平明显上调（P<0.05）。 结论 龙胆苦苷具有抑制血管平滑肌细胞增殖及迁移,其机制可能与抑制Pak4相关。     

氯通道阻断剂对KCl、5-HT引起的兔脑椎基底动脉血管环收缩效应的影响

目的　探讨不同种类氯通道阻断剂在不同激动剂引起的脑血管平滑肌收缩反应中的作用。方法　记录离体兔脑椎基底动脉环收缩反应。结果　①氯通道阻断剂DIDS、Furosemide及NPPB均浓度依赖性抑制高K+ 及 5 HT引起血管环收缩反应 ,DIDS、Furosemide及NPPB对 5 HT引起收缩的抑制作用明显强于对KCl的作用 ;②在 5 HT引起血管收缩反应中 ,给予SK&F96 36 5引起血管最大舒张的基础上 ,DIDS、Furosemide及NPPB均可引起血管进一步舒张。结论　氯通道可能参与了由高K+ 去极化和 5 HT引起的兔脑椎基底动脉环收缩反应     

内皮素-1对牛脑血管平滑肌细胞ClC-3通道表达的影响

目的　研究内皮素 1(ET 1)对牛脑血管平滑肌细胞(CSMC)内源性ClC 3表达的影响。方法　采用培养的CSMC ,用免疫印迹 (westernblot)方法分析CSMCClC 3通道表达。结果　①牛脑基底动脉、大脑中动脉、微动脉均有ClC 3蛋白表达 ,分子量约 10 5ku ,以微动脉表达最丰富 ,基底动脉表达最少 ;②培养的CSMC有内源性ClC 3蛋白表达 ,分子量约 95ku ;③ET 1能增加CSMCClC 3蛋白表达 ;④nifedipine、SK&F96 36 5能减少ET 1作用 ,环匹阿尼酸(cyclopiazonicacid ,CPA)浓度依赖性促进ClC 3蛋白表达 ,并能增强ET 1作用。结论　脑血管平滑肌细胞存在内源性ClC 3,ET 1可增强ClC 3表达 ,减少或增加胞浆内Ca2 + 浓度均可影响ET 1的作用     

Rho激酶在高血压中的作用及其与容积调节性氯通道的关系

高血压血管平滑肌重构伴随Rho/Rho激酶通路的激活,抑制Rho激酶可逆转血管平滑肌增生以及血压升高。同时,在高血压中有容积调节性氯通道开放,这与Rho激酶通路激活有关。该文就高血压过程中Rho激酶与容积调节性氯通道的关系做一综述。     

氟西汀对大鼠肺动脉平滑肌细胞体外增殖的影响

目的观察氟西汀对大鼠肺动脉平滑肌细胞体外增殖的影响并探讨其可能的机制。方法采用肺动脉平滑肌细胞(PASMC)体外培养的方法,观察氟西汀对PASMC增殖及细胞周期的影响。实验细胞分为4组:①正常对照组(Control):培养液含10%胎牛血清的高糖DMEM;②5-HT组:培养液含10%胎牛血清的高糖DMEM,其中加入终浓度为5μg/mL的5-HT的培养液100μL;③Flu组:培养液含10%胎牛血清的高糖DMEM,其中加入终浓度为10μg/mL的Flu的培养液100μL;④5-HT+Flu组:培养液含10%胎牛血清的高糖DMEM,其中加入培养液100μL(其中5-HT终浓度为5μg/mL,Flu终浓度为10μg/mL)。4组细胞均在常规条件下培养,分别于实验第24、48及72小时采用MTT法测定各组细胞的吸光度值(A490),并采用流式细胞周期分析方法测定各组细胞不同时间点细胞周期分布的特点。结果 PASMC离体干预实验结果表明,5-HT+Flu组细胞随着氟西汀浓度增高或时间延长,A490较对照组逐渐降低。细胞周期分析显示,氟西汀作用于PASMC 72 h后,细胞周期分布表现为S期细胞比例下降,G0/G1期细胞比例上升。结论氟西汀可有效拮抗5-HT刺激所致的PASMC增殖,且这一作用可能与氟西汀阻碍PASMC向DNA合成期转化有关。     

叶酸抑制同型半胱氨酸诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖的研究

目的探讨叶酸抑制同型半胱氨酸致大鼠血管平滑肌细胞增殖的研究。方法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC),流式细胞仪检测VSMC周期,[3H]TdR参入测定VSMC的DNA合成。结果同型半胱氨酸以剂量依赖关系使VSMC周期中的G0/G1期细胞比例明显减少,S期细胞比例显著增多,增加VSMC的[3H]TdR参入。叶酸可明显抑制同型半胱氨酸诱导的作用。结论同型半胱氨酸能诱导VSMC增殖,叶酸能抑制同型半胱氨酸诱导的VSMC增殖。