骨髓间充质干细胞体外分化过程中细胞周期蛋白的表达变化

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外定向分化为多巴胺(DA)能神经元过程中细胞周期相关蛋白的表达变化。方法:体外分离、扩增和鉴定大鼠骨髓MSCs。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24 h后,用1μmol/L全反式维甲酸(ATRA)和50 ng/ml GDNF联合诱导6 d,检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、酪氨酸羟化酶(TH)、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK2)、细胞周期蛋白(Cyclin)B1的表达。结果:诱导后大鼠骨髓MSCs能分化为具有典型神经元形态的细胞,大鼠MSCs经诱导后PCNA、CDK2、Cyclin B1的表达均较对照组明显减弱,Bcl-2表达与对照组无明显差别。结论:骨髓间充质干细胞体外开始分化后细胞增殖力下降。     

5-氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响

目的:探讨5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)对体外骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)细胞增殖与分化潜能的影响。方法:从Wistar大鼠骨髓中获得MSCs,培养传代,透射电镜下观察诱导前后细胞形态变化;MTT法检测5-aza对MSCs生长的影响;免疫细胞化学方法检测Actin(α-Sarcomeric)、Desmin、Myoglobin、NSE、GFAP的表达。结果:5-aza对MSCs有抑制作用,在透射电镜下观察可见有心肌样细胞和神经元样细胞的形态变化。免疫细胞化学检测结果表明,MSCs经5-aza诱导14dactin、desmin、myoglobin、NSE和GFAP的表达均较对照组显著增高,P0.01。结论:5-aza对MSCs细胞生长有抑制作用,MSCs被5-aza诱导分化成心肌样细胞和神经元样细胞。     

全反式视黄酸对新生鼠头盖骨成骨细胞的影响

目的 :　探讨全反式视黄酸 ( ATRA)对体外培养的新生大鼠成骨细胞增殖与分化的影响。方法 :　从新生大鼠颅骨分离出成骨细胞 ,细胞增殖实验采用噻唑盐 ( MTT)比色试验法 ;细胞分化实验采用氨基安替比林法 (金氏法 )测定碱性磷酸酶 ( ALP)的活性 ,并用免疫细胞化学法检测细胞周期调控蛋白 Cyclin D1表达的影响 ,研究 ATRA对成骨细胞代谢的影响及部分作用机制。结果 :　培养液中加入 1 0 -5、1 0 -6、1 0 -7、1 0 -8和 1 0 -9mol/L ATRA培养 72 h对成骨细胞有促细胞增殖作用 ,而 1 0 -5、1 0 -6、1 0 -7mol/L的 ATRA在 2 4、48、72 h均能显著促进成骨细胞分化 ,免疫细胞化学染色 Cyclin D1蛋白表达降低。结论 :　ATRA对成骨细胞具有促增殖和诱导分化作用 ,细胞周期调控蛋白可能在 ATRA诱导成骨细胞增殖和分化过程中发挥重要作用。     

体外诱导兔胚胎干细胞分化为神经细胞

目的:探讨体外诱导兔胚胎干细胞(ESCs)分化为神经细胞的方法。方法:应用多种诱导剂联合诱导兔ESCs,免疫荧光和流式细胞仪检测巢蛋白(Nestin)的表达。结果:诱导后兔ESCs能分化为具有典型神经元形态的细胞,Nestin阳性表达。结论:在体外采用定向分化诱导,兔ESCs可直接定向分化为神经干细胞。     

视黄酸对脐血树突状细胞的作用及其途径

目的:研究视黄酸(RA)对脐血树突状细胞(dendriticcell,DC)分化、成熟和功能的影响,探讨视黄酸受体(retinoicacidreceptorα,RARα)在RA对脐血DC调节中的作用。方法:收集脐血9份,分离单个核细胞后,均匀分为4组:对照组、RA组、RARα特异性拮抗剂组(RO组)、RA+RO组。在体外进行DC的诱导培养,流式细胞仪检测细胞表面标记及其荧光强度,观察RA及RARα对DC分化、成熟的影响;培养DC与T细胞进行混合淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction,MLR)后,观察RA及RARα对DC刺激异体T细胞增殖能力的作用;采用ELISA法和RT-PCR法研究RA和RARα在DC对Th细胞极向分化调节中的作用。结果:RA使DC的分化、成熟明显受抑,但当RO同时加入时,则可逆转该影响;MLR后发现RO可逆转RA对T细胞增殖的抑制作用;在DC对T细胞极向分化的研究中,无论在蛋白水平还是基因水平,RO均可明显阻止RA对Th1(IFN-γ)的下调和对Th2(IL-4、IL-10)的上调作用。结论:RA抑制体外培养的脐血单个核细胞向DC的分化和成熟,降低其MLR能力,使免疫反应向Th2方向偏移。RARα从多个环节上参与了RA对脐血DC的调节作用。     

视黄酸对人胸腺细胞成熟分化影响及其作用机制

目的:研究视黄酸调节胸腺细胞发育的作用及其机制。方法:采用体外胸腺组织培养体系,在培养体系中加入视黄酸或视黄酸受体拮抗剂。在培养的不同时间收集胸腺细胞,用荧光标记的抗CD3、CD4、CD8抗体染色,并进行流式细胞仪分析,观察胸腺细胞表面标志随成熟分化的变化。胸腺细胞抽提的RNA采用实时定量PCR法检测视黄酸受体α(RARα) mRNA的表达。结果:体外胸腺组织培养体系能支持胸腺细胞的发育成熟。在培养24 h促进未成熟的CD4+CD8+胸腺细胞向CD4+成熟细胞分化发育作用明显,并且该作用可被RARα特异性拮抗剂Ro41-5253所拮抗。视黄酸也能显著抑制CD4+CD8+胸腺细胞向CD8+细胞分化,该作用也在培养24 h出现。实时定量PCR显示,视黄酸能促进RARα mRNA表达,并且 RARαmRNA表达水平与CD4+CD8+胸腺细胞百分数之间存在正相关,与CD8+胸腺细胞百分数之间存在负相关。结论:视黄酸可能通过影响其受体RARα表达而影响胸腺细胞的成熟分化。     

全反式视黄酸调控乳腺癌细胞的增殖及机制研究

目的研究全反式视黄酸(ATRA)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及ATRA与X射线照射对视黄醇类X受体α(RXRα)表达水平的影响。方法 MTT法检测细胞增殖,Western blot检测RXRα表达水平。结果 ATRA浓度在100～1000 nmol/L,72 h可抑制细胞的增殖。观察不同时间100 nmol/L的ATRA作用,24 h内,促进MDA-MB-231细胞的增殖,而作用48 h后,可抑制细胞的增殖。ATRA在100～1000 nmol/L范围内可诱导RXRα的表达,且存在浓度依赖性。100 nmol/L的ATRA作用24 h即可诱导RXRα的表达,并且存在时间依赖性。X射线照射未能诱导RXRα的表达。结论 100～1000 nmol/L的ATRA作用48 h即可抑制MDA-MB-231细胞增殖,且其对MDA-MB-231细胞RXRα蛋白表达存在浓度和时间依赖性,为ATRA用于临床乳腺癌的治疗提供了理论基础,也提示RXRα可能是ATRA抑制乳腺癌细胞增殖的机制之一。     

大鼠脂肪间充质干细胞与壳聚糖支架体外联合培养

目的采用大鼠脂肪间充质干细胞与壳聚糖支架体外联合培养为颅脑损伤大鼠模型神经修复提供种子细胞。方法取SD大鼠附睾周围脂肪组织,分离培养脂肪间充质干细胞,传至第3代流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD90、CD44表达;冻干燥法制备壳聚糖支架材料,再取第5代细胞以2×106/m L的密度接种于壳聚糖三维支架上,促进其向神经元和胶质细胞方向分化;免疫荧光染色鉴定细胞分化结果。结果分离培养的脂肪间充质干细胞表面标记CD29、CD90、CD44阳性表达率分别为91.05%、92.76%、96.56%,达到理想的纯度;制备的壳聚糖三维支架具有合适的三维多孔结构;培养基诱导7 d左右可见检测神经细胞特异性标志(巢蛋白和β-tubulinⅢ)的表达,分化后的大部分细胞呈现典型的神经元样改变,细胞伸出细长突起或网状突起,可见较多的细胞形成网络连接。免疫荧光染色鉴定结果证实,神经球高表达巢蛋白(Nestin)阳性率(65.23±0.98)%,分化细胞β-tubulinⅢ阳性率(62.35±5.71)%,微管相关蛋白2(MAP2ab)阳性率(12.87±2.63)%。结论大鼠脂肪间充质干细胞联合壳聚糖支架培养可在体外培养得到较高比例神经细胞特异性标志的Nestin及β-tubulinⅢ阳性细胞,并有一定比例MAP2ab阳性细胞出现,该特异性标志表达的细胞用于大鼠颅脑外伤模型神经修复实验。     

人胚神经干细胞向神经元样细胞诱导分化的研究

目的探讨通过一定的培养条件,使神经干细胞在体外向神经元方向分化。方法在贴壁培养的情况下以含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肝素的培养基诱导神经干细胞分化,观察分化的细胞形态并用免疫细胞化学技术检测分化细胞的神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。结果诱导7d后免疫细胞化学检测显示NSE阳性细胞占细胞总数的(47.3±1.7)%,明显高于对照组(P<0.01)。分化后细胞的胞体直径、表面积和突起长度也明显高于对照组(P<0.01)。结论在体外应用bFGF和肝素诱导神经干细胞向神经元分化是可行的,bFGF和肝素既能促进神经干细胞分化成更多的神经元,也可促进分化后神经元的成熟。     

维甲酸受体β在宫颈癌中的表达及其意义

目的:检测维甲酸受体β(RARβ)基因在宫颈癌组织中的表达及其意义。方法:收集该院68例宫颈癌和28例宫颈炎患者的临床资料和组织标本,RT-PCR法检测宫颈癌和宫颈炎组织中RARβmRNA的表达水平。采用免疫组织化学法和酶联免疫吸附试验检测宫颈癌和宫颈炎组织中RARβ蛋白的表达情况。统计两组临床资料并对随访的患者资料进行对比。结果:宫颈癌组中的RARβmRNA相对表达量低于宫颈炎组,宫颈癌组中的RARβ蛋白表达阳性比例低于宫颈炎组,宫颈癌组中的RARβ蛋白含量平均值低于宫颈炎组平均值,差异均具有统计学意义(P<0.05)。RARβ蛋白在宫颈癌Ⅲ/Ⅳ期阳性表达比例低于Ⅰ/Ⅱ期,差异具有统计学意义(P<0.05)。有淋巴结转移患者中RARβ表达阳性比例低于无淋巴结转移,差异具有统计学意义(P<0.05)。RARβ表达阴性的宫颈癌患者中死亡率和复发率高于阳性表达患者,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:RARβ在宫颈癌的发生过程中发挥重要作用,故其可作为宫颈癌患者发生、发展和预后判断的重要参考指标。     

视黄酸受体基因在小儿淋巴结的表达与B细胞的发育

目的:研究视黄酸受体基因在小儿淋巴结的表达与B细胞发育的关系,阐明视黄酸促进抗体产生的途径与机制。方法:取5岁以下儿童正常淋巴结作冰冻切片,用地高辛素标记六种视黄酸受体基因(RARα、β、γ、RXRα、β、γ)反义RNA探针作原位杂交,及采用RT-荧光定量PCR,观察视黄酸受体基因在淋巴结的表达与分布,分析其与B细胞发育的关系。结果:原位杂交结果显示:六种视黄酸受体基因在淋巴结中的淋巴细胞和网状细胞中均有表达,分布广泛。RT-荧光定量PCR显示:在不同年龄儿童淋巴结六种视黄酸受体基因表达水平有所差异,1岁以下儿童受体基因表达水平普遍较低,此后随免疫发育而升高。结论:视黄酸受体基因的表达可能参与了B细胞的个体发育和免疫应答。这可能是维生素A增强儿童抗感染免疫力的重要环节和介导视黄酸作用的主要途径。     

The Short Chain Fatty Acid Butyrate Induces Promoter Demethylation and Reactivation of RARβ2 in Colon Cancer Cells

It has been proposed that cancer prevention results from multiple dietary agents acting together as “action packages.” Here we obtain evidence that butyrate, which is generated from dietary fiber, enhances the responsiveness of colon cancer cells to all-trans retinoic acid (ATRA). Evidence was obtained that this interaction depends on histone deactylase one (HDAC1) inhibition by butyrate and retinoic acid receptor alpha (RARα) activation by ATRA. The enhancement of RAR beta 2 (RARβ2) activation was accompanied by a rapid demethylation of the RARβ2 promoter. This demethylation could be achieved by butyrate alone, and it differed from that triggered by the DNA methyltransferase inhibitor 5-Aza-2′ deoxycytidine in that it was 1) sporadic on the RARβ2 promoter, 2) not genome wide, and 3) independent of extensive DNA replication. An analysis of inter-methylated sites assay indicated that only a few percent of loci analyzed showed reduced methylation. In colon cancer cells that were particularly resistant to RARβ2 reactivation, the actions of butyrate could be further enhanced by the soy isoflavone genistein, which has also been reported to work through an epigenetic mechanism. These data suggest that dietary compounds that modulate epigenetic programming are likely to function best in the presence of retinoids and other cancer-preventing compounds that are sensitive to a cell's epigenetic state.     

视黄酸受体在脐血淋巴细胞抗体生成中的作用

目的 :　研究视黄酸 (RA)促进脐血淋巴细胞 (CBL )抗体生成的作用机制。方法 :　对脐血标本进行血清维生素 A(VA)浓度测定 ,采用 RT- PCR法检测 CBL中视黄酸受体 -α(RAR-α)的基因表达水平 ,并采用 ELISA法检测细胞培养上清液中 Ig M含量。结果 :　脐血血清 VA水平与未培养 CBL中 RAR- α的基因表达水平之间存在正相关 :r=0 .50 (P<0 .0 1 ) ;RA增加金黄色葡萄球菌 Cowan 株 (SAC)活化 CBL的 Ig M生成能力 (P<0 .0 0 1 ) ;RA上调 SAC活化 CBL中RAR- α的基因表达水平 (P<0 .0 0 1 ) ;RA使 RAR- α基因表达的上调幅度与 RA使 Ig M生成的上调幅度之间存在正相关 :r=0 .40 (P<0 .0 5)。结论 :　 RA对 CBL抗体生成的促进作用可能通过RAR-α途径传递     

三氧化二砷联合全反式维甲酸对人卵巢癌细胞的抑制作用

目的:探讨三氧化二砷(AS2O3)联合全反式维甲酸(ATRA)对人浆液性卵巢癌细胞株SKOV3的抑制作用及其机制。方法;四甲基偶氮唑蓝光吸收法(MTT)、流式细胞术及免疫荧光法检测体外培养的SKOV3细胞在AS2O3单独作用及联合ATRA作用下对卵巢癌细胞生长的抑制及促凋亡作用。结果:单用ATRA对SKOV3细胞的生长无影响;单用AS2O3可以抑制SKOV3细胞的生长;联合使用AS2O3和ATRA较单用AS2O3对SKOV3细胞的抑制作用强(P<0.05);流式细胞术证实:5.0μmol/LAS2O3联合1.0μmol/LATRA作用48h时,SKOV3细胞出现G2/M期阻滞增强、S期减低(P<0.05);AnnffxinV染色检测到早期凋亡细胞增多,晚期凋亡及继发性坏死细胞减低(P<0.05)。结论:AS2O3能上调SKOV3细胞中细胞周期抑制蛋白P27的表达,ATRA联合AS2O3可以增强上述效应。故ATRA对诱导SKOV3细胞凋亡有增敏效应,该效应过程可能依赖于细胞周期负性调控因子P27蛋白的过度表达。     

维生素A缺乏对初生大鼠脑发育的影响

目的 :　探讨维生素 A缺乏 (VAD)对初生大鼠脑发育的影响及其分子生物学机制。方法 :　建立不同程度 VAD母鼠模型。仔鼠出生后测定其血清维生素 A(VA)水平、脑组织 VA含量、体重、脑重、脑组织蛋白质含量、脑细胞增殖周期和脑内视黄酸受体 α、β(RARα、RARβ)、视黄醇X受体 β(RXRβ)和多巴胺受体 - 2 (D2 R) m RNA表达。结果 :　 (1 )初生鼠血清 VA水平和脑组织VA含量三组间有显著性差异 (P<0 .0 1 ) ,重度维生素 A缺乏 (SVAD)组明显低于对照组和边缘型维生素 A缺乏 (MVAD)组 ,MVAD组也明显低于对照组。 (2 ) SVAD组初生鼠体重和脑重明显低于对照组和 MVAD组 (P<0 .0 1 ) ,MVAD组与对照组相比无显著性差异。 (3 )全脑蛋白质含量、每克脑组织蛋白质含量和脑细胞增殖指数 (PI) SVAD组均明显低于对照组 (P<0 .0 1 ) ,MVAD组仅全脑蛋白质含量明显低于对照组 (P<0 .0 1 ) ,其它指标与对照组相比也有降低但无统计学意义。(4)脑细胞 RARα、RARβ、RXRβ 和 D2 R m RNA表达 SVAD组仅 RARα和 D2 R有微弱表达 ,MVAD组与对照组相比除 RARβ外均有不同程度降低。结论 :　VAD会导致初生大鼠脑发育受损 ,其作用可能是通过降低脑细胞内视黄酸受体表达而产生的