豚鼠全耳蜗外淋巴灌注

介绍全耳蜗外淋巴灌注的方法。讨论了影响灌注的因素有微量灌注泵的稳定可靠性,人工外淋巴的配制和操作技术。探讨了其在基础研究和临床应用方面的前景。     

豚鼠耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的同时分离法

目的：探讨豚鼠耳蜗外毛细胞（OHC）和Deiters细胞（DC）同时分离的方法。方法：选健康杂色豚鼠，解剖出耳蜗基底膜，采用酶消化后机械分离。结果：可以同时获得一定数量，活性良好，长短不一的OHC和DC。结论：熟悉耳蜗的解剖特性，保持Corti器的完整及掌握机械吹打的力度是同时获取活性良好的OHC和DC的关键。     

豚鼠听毛细胞耳蜗灌注分离法初步探讨

Katsuki和 Covell( 1 953)首次用机械分离法从豚鼠耳蜗中分离出有活性的外毛细胞。 Zenner等和 Brownell等 ( 1 985)完善和发展了毛细胞分离技术 ,并被广泛采用。Brewnell等先用木瓜蛋白酶加机械分离 ,后来仅用钝性分离和单纯吹打法。Zenner等用尖端直径为 4～ 40μm的玻璃毛细管通过显微操纵器 ,插入 Corti隧道直接分离毛细胞。现将我们用的一种新的毛细胞分离方法——耳蜗灌注法 ,介绍如下。1　材料和方法选用耳廓反射正常的白化豚鼠 7只 ,体重 2 0 0～ 30 0 g,雌雄兼用。培养液为平衡盐溶液 ,配方如下 :Na Cl 1 40 mmol/L,KCl 5.4mm…     

豚鼠耳蜗毛细胞钙调蛋白的表达

目的：研究正常生理状态下钙调(calmodulin)的结构特征和分布规律。方法：本研究应用免疫细胞化学方法，采用单克隆抗体及免疫荧光标记技术，借助于荧光显微镜和激光扫描共聚集显微镜，逐层观察耳蜗钙调蛋白的分布特点。结果：豚鼠耳蜗外毛细胞（OHCs)和内毛细胞（IHCs)各转之间calmodulin分布无变化，OHCs内calmodulin含量多于IHCs。OHCs表皮板和静纤毛出现calmodulin特异性着色，表明哺乳动物耳蜗OHCs的静纤毛含有calmodulin。支持细胞内无calmodulin的分布。结论：豚鼠耳蜗OHCs,IHCs和支持细胞中calmodulin的3结构和分布有显著差异。     

豚鼠冲击波负压暴露后耳蜗毛细胞损害定量观察

目的 探讨冲击波负压（blast underpressure,BUP）暴露后豚鼠耳蜗毛细胞损害特点.方法将豚鼠暴露实验性BUP 14天后处死,硝酸银染色硬铺片法计数观察耳蜗基底膜毛细胞损伤情况.结果压力峰值介于-22.4kPa和-63.3kPa之间的实验性BUP暴露后,豚鼠耳蜗外毛细胞出现了明显的病理性改变,损伤的程度以第二转最重,第二排和第三排的病变比第一排更为严重.BUP强度越高,毛细胞损害越重.各实验组动物的外毛细胞总缺失率明显高于正常对照组（P＜0.01）;重复暴露3次的动物外毛细胞缺失率明显高于暴露1次的动物（P＜0.01）.结论BUP暴露可引起明显的豚鼠耳蜗外毛细胞缺失等损害,其损害程度与负压峰值及暴露次数密切相关;毛细胞损害越重,ABR阈移也就越明显.     

豚鼠耳蜗螺旋器细胞微管蛋白的表达

目的研究正常生理状态下微管蛋白(tubulin)的结构特征和分布规律。方法采用免疫荧光标记技术,借助激光扫描共聚焦显微镜,逐层观察耳蜗毛细胞中微管蛋白的分布特点。结果豚鼠耳蜗内毛细胞、外毛细胞和支持细胞内都有微管蛋白的特异性染色,支持细胞内微管蛋白的分布自基底转到顶转逐渐减弱(纵向梯度),豚鼠耳蜗感觉细胞的微管蛋白表达则无此特征,外毛细胞静纤毛中微管蛋白着色明亮,三排"V"形清晰可见,这与以往结果不同。结论豚鼠耳蜗外毛细胞中微管蛋白的结构和分布无差异,支持细胞内的分布存在差异。表明局部结构的梯度决定局部功能的差异。     

水杨酸钠豚鼠耳蜗单离外毛细胸游离钙浓度影？…

目的 观察水杨酸钠对豚鼠耳蜗外毛细胞（ｏｕｔｅｒ ｈａｉｒ ｃｅｌｌｓ,ＯＨＣ）内游离钙浓度「Ｃａ＾２＋」ｉ的影响,并对钙通道调控药物的拮抗作用进行观察,以深入探讨水杨酸钠耳毒性的分子生物学机制。方法 豚鼠全身麻醉后断头活杀,酶－机械法分离获得耳蜗单离ＯＨＣ。１０ｕｍｏｌ／Ｌ的Ｅｌｕｏ－３／ＡＭ负载３０ｍｉｎ后用ＡＣＡＳＵｌｔｉｍａ型激光扫描共聚焦显微镜观察不同药物灌流下ＯＨＣ「Ｃａ＾２＋」ｉ的变     

豚鼠耳蜗各回外毛细胞的分离

目的 :探讨豚鼠耳蜗各回外毛细胞 (OHC)的分离方法。方法 :选豚鼠 8只 ,解剖耳蜗各回组织 ,获得Corti器并采用酶消化后机械分离。结果 :各回均可获得一定数量、活性良好的 OHC,第 1、2、3、4回单离 OHC的长度依次为 2 3.81、34.5 0、6 0 .48和 71.37μm。结论 :熟悉耳蜗各回解剖、组织特性并按操作要点进行是成功分离出各回 OHC的关键。     

豚鼠耳蜗基底膜硝酸银染色铺片法的改良与观察

目的 探讨改良硝酸银染色铺片法对豚鼠耳蜗基底膜的观察效果.方法 20只正常豚鼠分为对照组和改良组,每组10只.对照组采用传统的基底膜硝酸银染色铺片法,改良组采用直接曝光显色及逆向剥离的硝酸银染色铺片方法 (即改良法),观察基底膜毛细胞及听纤毛簇,比较两组的铺片效果.结果两组动物耳蜗基底膜均剥离完整,毛细胞和听纤毛簇显色清晰,但改良组较对照组制片所需时间明显缩短,且操作更为简便.结论 改良耳蜗基底膜硝酸银染色铺片法操作简便,效果满意.     

豚鼠耳蜗单离螺旋神经节细胞外毛细胞同时分离法

随着细胞生物学及分子生物学技术的进步 ,保持活性的单离螺旋神经节细胞 ( SGC)和 (或 )外毛细胞 ( OHC)已成为听觉生理、生化、病理及药理实验的重要模型。OHC为听觉的感受细胞 ,SGC为听觉初级神经元 ,观察同一因素对 OHC及 SGC的影响有重要意义 ,这就需要同时获得来源于同一耳蜗的单离的 SGC和 OHC。为此 ,我们尝试了在同一耳蜗同时分离单离的 SGC和 OHC的可能性 ,获得较好结果 ,报告如下。1　材料与方法1 .1 　 实验动物及溶液配制选用耳廓反射阳性、体重 2 0 0～ 30 0 g的花色豚鼠 6只 ,雌雄兼有。培养液为标准细胞外液 ,组…     

豚鼠耳蜗灌注的流速安全阈

行全耳蜗人工外淋巴灌注，观察不同灌注速度对蜗内电位的影响，并作耳蜗连续切片，观察内耳结构的形态变化。灌注速度分别为：５μｌ／ｍｉｎ，５０μｌ／ｍｉｎ，５０μｌ／ｍｉｎ，１００μｌ／ｍｉｎ，２５０μｌ／ｍｉｎ，５００μｌ／ｍｉｎ。当灌注速度为１００μｌ／ｍｉｎ时可使蜗内电位下降，但停灌后可恢复。而灌注速度进一步提高为２５０μｌ／ｍｉｎ以上后，蜗内电位即出现不可逆的下降。在灌注速度分别为５μｌ／ｍｉｎ     

纯中药制剂复聪汤对庆大霉素致聋豚鼠耳蜗毛细胞修复再生的实验研究

目的观察纯中药制剂对庆大霉素致聋动物和耳蜗毛细胞的修复再生作用。方法选用73只健康青年豚鼠,行听力学检查后,53只动物连续肌肉注射庆大霉素(80mg.kg-1.d-1)24～30天致聋(GM组),其间死亡8只,剩余45只随机分成中药治疗组(25只)和致聋后对照组(20只),中药治疗组给予纯中药制剂"复聪汤Ⅰ号"口服液和"复聪汤Ⅱ号"滴耳液治疗,致聋后对照组同法给予生理盐水。另外20只豚鼠作为正常对照组,每天肌肉注射等量生理盐水。在治疗30、60和90天后对GM组两组动物分别行ABR、DPOAE检测,同时,每一时间点处死6只动物,左侧耳蜗行扫描电镜观察,右侧耳蜗铺片行光镜观察和毛细胞计数。结果实验前所有豚鼠的听功能正常;连续注射庆大霉素30天后,GM组豚鼠ABR反应阈值上升到50～80dB SPL,DPOAE幅值降低,光镜和电镜下表现为耳蜗毛细胞纤毛断碎、倒伏、融合和消失,多处毛细胞表皮板肿胀、突起和疱疹样变性,或毛细胞被完全挤出网状板,基底回和第三回耳蜗毛细胞严重消失;中药治疗30天后,80%的耳聋豚鼠的ABR反应阈恢复到30～50dB SPL,DPOAE幅值明显提高;耳蜗铺片和电镜观察显示耳蜗毛细胞数目有一定恢复,组织结构有修复现象,扫描电镜可见再生毛细胞仅出现少量纤毛,而致聋后对照组未发现此种现象;治疗60天后,耳蜗毛细胞数目明显增多,Corti器的毛细胞区有大量的增殖细胞出现,扫描电镜可见成小束的新生纤毛出现在毛细胞缺失部位,同时支持细胞大量增殖;治疗90天后,再生的静纤毛束已基本形成,尤其是耳蜗基底部位的毛细胞明显增多,听功能基本正常。结论纯中药制剂复聪汤对庆大霉素致聋豚鼠耳蜗毛细胞有一定的修复和再生作用。     

豚鼠耳蜗外毛细胞的快速分离及活力观察

目的 探讨豚鼠耳蜗外毛细胞(Outer Hair Cells,OHCs)的快速分离方法 及其活力观察.方法 采用机械与胰蛋白酶消化相结合的方法 快速分离耳蜗OHCs,并在倒置显微镜下观察其活力.结果 可快速分离出一定数量活性良好的耳蜗OHCs,其贴壁所需的时间较短,分离后静置7分钟即观察到贴壁.不同形态的OHCs在正常细胞外液中的存活时间不同,胞体较短的能存活3小时左右,胞体较长的能存活6～7小时.同时可观察到基底膜上其它几种细胞的形态.结论 使用此方法 可快速分离出单离的活性良好的耳蜗OHCs,这有助于我们深入研究其正常生理功能及某些病理状态下的功能及形态变化.     

豚鼠耳蜗微血管铸型的扫描电镜观察

应用血管铸型技术和扫描电镜观察了豚鼠耳蜗的微血管，结果见耳蜗血管均被铸型物完全充填，耳蜗血管的总体三维空间图像得以清晰地显示。作者对外放射状动脉及其分支，以及耳蜗侧壁回流静脉的解剖进行了仔细观察。     

条件声暴露后豚鼠耳蜗外毛细胞丝束肌动蛋白表达的改变

目的：观察豚鼠耳蜗丝束肌动蛋白的表达及分布情况以及条件声暴露后耳蜗毛细胞丝束肌动蛋白的表达有无改变,初步探讨耳蜗“坚韧化”现象的发生机制。方法：实验用豚鼠分组后,采用中心频率为1kHz、强度为95dBSPL的倍频程噪声对动物进行条件声暴露。条件声暴露结束后按实验设计的时间处死动物并进行耳蜗铺片及免疫荧光染色。应用激光扫描共聚焦显微镜观察柯替器荧光染色情况并对1kHz频率感音区的第3回柯替器外毛细胞（OHC）的荧光强度进行定量分析。结果：豚鼠耳蜗柯替器丝束肌动蛋白主要分布在内外毛细胞的静纤毛、表皮板,OHC顶部细胞侧壁,柱细胞头板。在底回柯替器OHC基底部,Deiters细胞指突,外柱细胞的胞体亦含有丰富的丝束肌动蛋白。不同时期的条件声暴露后,除条件声暴露1d组加休息5d组外,其他2组动物OHC的荧光强度均有明显变化。结论：①一定剂量的条件声暴露可导致耳蜗柯替器丝束肌动蛋白表达的改变。②除内外毛细胞的静纤毛、表皮板,柱细胞头板等既往报道的部位外,豚鼠耳蜗柯替器的外柱细胞胞体中也含有丰富的丝束肌动蛋白。③条件声暴露后耳蜗OHC丝束肌动蛋白浓度的减低可能与耳蜗“坚韧化”现象的产生有关。     

豚鼠耳蜗单离外毛细胞钙波的观察

目的：观察豚鼠耳蜗单离外毛细胞（outer hair cell,OHC)内游离钙浓度（[Ca^2]i)是否存在波动，即有无钙波。方法：健康豚鼠10只断头处死，在无Ca^2的dHanks液和含Ca^2的Hanks液中酶－机械法分离获得单离活性OHC，钙荧光抗体Fluo-3孵育后，分别加入乙酰胆碱或空白对照，用MRC－1024型激光扫描共聚焦显微镜（Bio-Rad，英国）观察OHC约50min内[Ca^2]i的变化。结果：dHanks液中加ACh组的5个OHC，[Ca^2]i呈明显的规律性的波动，即产生了钙波，钙波的周期约600s;Hanks液中加ACh组的6个OHC的[Ca^2]i均迅速升高，无钙波出现，在dHanks液和Hanks液中不加ACh分别观察了3个OHC，[Ca^2]i呈平坦型，无钙波，结论：ACh能刺激诱发豚鼠耳蜗单离OHC产生钙波。