卡介苗－抗原85－B基因的信号肽序列的克隆和鉴定

目的克隆和鉴定卡介苗－抗原８５－Ｂ（ＢＣＧ－Ａｇ８５－Ｂ）基因的信号肽序列。方法采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，对ＢＣＧ的主要分泌抗原Ａｇ８５－Ｂ基因的５′端第９４～２１１的核苷酸的信号肽序列进行扩增，再将１１７ｂｐ的扩增片段克隆到质粒ｐＢｌｕｅｃｒｉｐｔＳＫ的ＳａｃＩ和ＥｃｏＲＩ酶切位点，并对此片段进行定序。结果序列分析表明，扩增的信号肽序列无碱基错配，同时在信号肽３′端下游可提供携带外源基因的１２个多克隆位点。结论构建一含信号肽序列的重组质粒（ＢＣＧ－ＳＯ１），为在ＢＣＧ中表达的外源抗原能分泌到ＢＣＧ之外提供了一有效的信号肽     

卡介苗(BCG)D2株分泌型抗原85A基因的克隆与序列分析(英文)

目的　分离BCGD2株分泌型抗原 85A基因并测定DNA序列 ,为研制抗结核病新型疫苗奠定基础。方法　PCR法从BCGD2株基因组DNA中分离Ag85A基因 ,PCR产物连接入 pUCm -T载体 ,重组克隆用单菌落PCR法、BamHⅠ和SacⅠ双酶切以及DNA测序进行鉴定。结果　分泌型Ag85A基因经过分离和测序后发现 ,它有 10 4 1bp组成 ,与LukDeWit等人测定的来自于BCG1173P2株的同一基因的DNA序列是一致的 ,表明Ag85A基因在分枝杆菌中是高度保守的。 结论　BCGD2株分泌型抗原 85A基因的成功克隆与序列分析将会促进对Ag85A基因深入的研究 ,以及为研制抗结核病候选疫苗奠定基础     

卡介苗分泌型Ag85A基因fbpA转化番茄的检测与鉴定

目的了解卡介苗分泌型Ag85A基因fbpA在番茄中转化的情况。方法采用叶片煮沸快速PCR法检测fbpA基因；以番茄总DNA为模板，PCR法扩增目的基因fbpA；采用Southern blot检测目的基因fbpA在番茄染色体DNA中的整合情况，Western blot检测分泌型Ag85A在番茄果实中的表达情况。结果叶片煮沸快速PCR检出21株fbpA阳性转化不定芽，以番茄总DNA为模板的PCR法扩增出其中9株转化植株带有目的基因fbpA。Southern blot证实这9株番茄染色体DNA中整合了外源目的基因fbpA，Western blot检测到其中5株番茄果实中表达的卡介苗分泌型Ag85A与结核病人血清发生特异性免疫反应。结论番茄染色体DNA中整合了外源目的基因fbpA，果实中有该基因产物分泌型Ag85A表达。     

结核分支杆菌Ag85 B分泌蛋白基因疫苗的构建和免疫原性的研究

目的：构建编码结核分支杆菌（MTB）Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,并研究其免疫原性。方法：采用聚合酶链反应（PCR）方法从结构分支杆菌H37Ra基因组DNA中扩增出Ag85B分泌蛋白基因,用HindⅢ和EcoRⅠ消化后,与同样酶消化的pcDNA3连接,转化大肠杆菌JM109,阳性克隆用酶切鉴定;重组表达质粒肌注免疫小鼠4周后,分别用dot blotting和ELISA方法检测抗体的产生和滴度,结果：酶切监定重组表达质粒pTB30s构建成功,dot blotting检测免疫小鼠血清抗Ag85B特异性抗体阳性,ELISA检测抗体几何平均滴度为1：120。结论：应进一步研究pTB30s刺激机体的细胞免疫应答,以用于结核病（TB）的防治研究。     

细粒棘球蚴抗原B酵母表达载体的克隆与序列分析

目的 获得重组细粒棘球蚴抗原B（EgB)的真核表达蛋白，构建EgB酵母表达重组体，并对构建的重组体进行序列分析。方法以原核重组体JMl09-pMal2xEgB作为模板，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增EgB片断。目的基因EgB片断插入酵母表达载体pYES2／NTB，再将酵母表达重组体转化DH5a菌，并对转化筛选的重组体进行序列分析。结果 共筛选得到16个重组克隆，其中7个克隆证实为EgB正确序列，并与酵母表达载体的开放阅读框(0RF)相一致。结论 成功地将细粒棘球蚴抗原B基因构建入酵母表达载体pYES2／NTB的开放阅读框。此重组体可在酵母中进一步表达特异性蛋白。     

日本血吸虫14—3—3抗原编码基因的克隆及序列测定

为了寻找日本吸虫病新的诊断和候选疫苗分子,设计合成引物,以日本血吸虫成虫cDNA第一链为模板,用PCR法扩增出日本血吸虫14－3－3抗原（Sj14-3-3）基因编码序列,其大小约784bp,将其克隆入pGEM-T载体,重组质粒pGEM-T-Sj14-3-3经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明具有一个长度为765bp的完整开放阅读框,与曼氏血吸虫14－3－3核苷酸序列有高度同源性。本实验克隆了日本血吸虫14－3－3抗原的编码基因,并进行了序列测定,为进一步研究提供了条件。     

结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B基因真核共表达载体的构建与表达

目的 Ag85A和Ag85B是结核分枝杆菌的主要优势保护抗原,为提高编码Ag85A和Ag85B DNA疫苗的免疫原性和免疫效果,特构建真核共表达Ag85A和Ag85B抗原的真核表达载体pcDNA-Ag85A IRES-Ag85B,并利用293T细胞对其表达进行检测.方法 PCR扩增Ag85A和Ag85B基因,逐步将Ag85A和Ag85B基因定向插入至质粒pcDNA3.1(+)多克隆位点CMV启动子与加A信号BGH poly(A)之间,并将Ag85A和Ag85B基因以内部核糖体进入位点(internal ribo some entry site,IRES)序列连接,酶切和测序验证后将重组质粒转染至293T细胞中进行真核表达,48 h后提取细胞总蛋白,表达产物经SDS-PAGE分离和Western blot分析.结果 限制性内切酶酶切及测序结果表明,重组质粒pcDNA-Ag85AIRES-Ag85B基因序列和阅读框架正确.将重组质粒转入293T细胞后,利用Ag85A和Ag85B特异性抗体Western blot检测证实两种抗原可在同一载体中各自独立表达.结论 成功构建了能够同时独立表达结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B抗原基因的真核表达载体pcDNA-Ag85A IRES-Ag85B,为下一步研究它们的免疫原性和免疫效果奠定了基础.     

重组超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B基因的克隆和序列分析

目的　采用基因工程技术制备金黄色葡萄球菌B型肠毒素 (SEB)。方法　根据SEB已知序列 ,设计一对引物 ,用PCR方法从金黄色葡萄球菌染色体DNA上扩增出基因片段 ,克隆到原核表达质粒 pET32a上 ,转化大肠埃希菌JM10 9感受态细胞 ,经酶切和PCR鉴定 ,然后进行测序。结果　PCR扩增产物大小为 74 0bp ,重组质粒经双酶切PCR鉴定表明已正确重组 ,测序结果与已知序列基本吻合。结论　成功地克隆了金黄色葡萄球菌B型肠毒素 ,为下一步研究发病机制奠定基础。     

大肠杆菌O85 O-抗原基因簇序列破译和特异分子标识的筛选

目的测定大测肝菌O85的O-抗原基因簇的序列,对其基因进行功能和进化的分析,筛选并鉴定可用于快速分子分型的特异分子标识。方法利用鸟枪法对大肠杆菌O85的O-抗原基因簇进行测序,生物信息学方法进行序列拼接与分析,确定针对大肠杆菌O85的特异基因并设计引物,PCR方法进行模拟环境样品的检测。结果大肠杆菌O85的O-抗原基因簇序列全长为11 203 bp。发现8个开放阅读框架(orf)并确定功能,分别为:UDP-N-乙酰葡萄糖-2-异构酶基因(orf1),吡喃型UDP-半乳糖变位酶基因(glf),糖基转移酶基因(orf3、orf5、orf6和orf8),O-抗原转运酶基因(wzx)和O-抗原聚合酶基因(wzy)。鉴定出针对大肠杆菌O85的特异基因2个和引物4对。结论本文筛选的特异分子标识和PCR检测方法可用于对环境样品中的大肠杆菌O85进行快速、灵敏的检测。     

犬钩虫特异性抗原基因的克隆与表达

目的　寻找可诱发宿主保护性免疫力的犬钩虫特异性抗原。　方法　用犬钩蚴免疫获得保护性免疫力的家犬血清,免疫筛选犬钩虫期幼虫λZAPcDNA文库,阳性克隆基因经测序,在质粒PUC18、PET28中进行一系列亚克隆,重组pET28C质粒诱导表达并对表达产物进行SDS-PAGE和Westernblotting分析。　结果　从cDNA文库中筛获5个相同的阳性克隆,携带的犬钩虫抗原(AcAg)外源基因片段在原核体系(pET28C)中表达分子量为43kDa的融合蛋白。Westernblotting分析该重组蛋白可与筛库的犬血清反应。　结论　AcAg为新的犬钩虫特异性抗原,其基因与美丽纤杆线虫(Caenorhabditiselegans)基因unc-89同源性为35%。该抗原诱发宿主保护性免疫力及作为疫苗的潜力值得进一步研究。     

旋毛虫ES抗原基因的克隆和序列分析

目的　完成旋毛虫ES抗原 (Excretory -secretoryAntigen)中 4 3kDa分泌性糖蛋白基因和 5 3kDa分泌性抗原基因的克隆和测序 ,并与已发表的该两种基因的相关序列比较、分析。方法　通过RT -PCR ,从旋毛虫幼虫总RNA中扩增得到特异性片段 ,利用TA克隆将PCR产物克隆入 pUC -T载体中并进行测序及同源性比较。 结果　RT -PCR扩增得到 4 3kDa分泌性糖蛋白基因和 5 3kDa分泌性抗原基因 ,序列分析表明 ,其核苷酸序列与已发表的 4 3kDa分泌性糖蛋白基因和 5 3kDa分泌性抗原的同源性均为 99%。结论　成功提取了旋毛虫幼虫的总RNA ,并用PT -PCR方法克隆了 4 3kDa分泌性糖蛋白基因和 5 3kDa分泌性抗原基因 ,这为两基因的表达及在医学、兽医学中应用研究奠定了基础。     

弓形虫GRA6抗原基因的克隆与表达

目的在大肠杆菌中高效表达弓形虫抗原GRA6。方法采用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫昆山分离株和RH株总DNA中分别扩增到编码GRA6的基因，经DNA序列分析后导入表达载体。PGEX-5X-3。然后在大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RP中进行表达，以SDS-PAGE和Westen blotting进行鉴定，用GST亲和层析柱纯化表达产物。结果1．在我们所比较的336个碱基中，弓形虫昆山分离株与RH株之间碱基基本一致。2．得到一分子量为49kDa的融合蛋白。占大肠杆菌总蛋白的25．55％，通过Westen blotting证实，该重组抗原能被弓形虫感染的人特异性IgM和IgG血清所识别。结论1．弓形虫昆山分离株和RH株的GRA6基因片段几乎完全一致；2．在大肠杆菌中得到了高效表达的融合蛋白；3．该重组抗原能被弓形虫感染的人特异性IgM和IgG血清所别．可用于构建具有高度敏感性和特异性的弓形虫病检测试剂盒．     

牛乳腺炎金黄葡萄球菌肠毒素B基因的克隆及序列分析

目的克隆牛乳腺炎金黄葡萄球菌B(SEB)基因,并进行序列分析。方法根据GenBank公布的金黄葡萄球菌基因的全序列,利用生物学软件Primer5.0和Oligo 6.0设计1对特异性引物,扩增临床分离菌株的SEB基因片段。结果扩增的基因片序列长度为466bp,与标准菌株(CMCC26074)的SEB基因片段序列相似性为100%,与GenBank公布的金黄葡萄球菌菌株(AB479118.1)SEB基因序列相似性为99.93%。结论成功克隆出牛乳腺炎金黄葡萄球菌SEB基因,为建立相应的PCR快速检测牛乳SEB基因方法奠定了基础。     

表达Ag85B-ESAT6的重组卡介苗在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力

超表达分泌蛋白Ag85B的重组卡介苗免疫豚鼠获得的保护效力超过卡介苗，这为研究新型结核病疫苗提供了思路。为了全面评估我们构建的融合表达Ag85B与ESAT6的重组卡介苗免疫学特性，我们进一步研究了该菌株在小鼠体内诱发的免疫应答水平及其对结核分枝杆菌毒株感染的保护力。     

Ag85B核酸疫苗的免疫原性和保护性研究

扩增结核分枝杆菌的Ag85B基因并克隆于真核表达载体 pJW4 30 4 ,转染COS - 7细胞后 ,Westernblot检测表明该基因在细胞内得到了正确表达。用该质粒免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,免疫三次后 ,用纯化的重组蛋白Ag85B检测小鼠血清中的抗体 ,抗体滴度达到 1:10 2 4 0 0 ,(γ -干扰素测定表明 ,免疫动物的干扰素含量达到 116 0 3± 10 4 pg /ml。实验结果说明Ag85B核酸疫苗在实验动物体内引起了较强的免疫应答。三次免疫后经静脉强毒攻击 ,免疫组小鼠肺脏和脾脏的细菌数比对照空载体组分别减少了 1 5和 15倍以上。本研究表明 ,该核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞和体液免疫应答并获得较高的保护效率。     

Ag85b-卡介苗重组疫苗的构建及鉴定

目的构建结核分枝杆菌Ag85b-卡介苗重组疫苗,研究其免疫原性及抗结核作用,以期获得结核病预防性和治疗性疫苗。方法通过基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原Ag85b的编码基因与穿梭质粒载体pYUB295重组,通过电穿孔技术导入卡介苗中,应用PCR扩增、PAGE电泳鉴定重组卡介苗。结果通过PCR扩增获得Ag85b基因,与穿梭表达载体pYUB295重组后,通过PCR扩增、限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定表明成功地构建了Ag85b基因pYU295重组质粒。将重组质粒通过电穿孔导入卡介苗,重组卡介苗在抗性培养基上生长良好。pYUB295-Ag85b重组卡介苗基因组DNA的PCR扩增以及培养上清液的PAGE电泳表明：Ag85b-卡介苗重组疫苗构建正确,Ag85b蛋白在卡介苗中分泌表达。结论成功构建了Ag85b-卡介苗重组疫苗。     

上海市、江苏省丙型肝炎病毒MS3区C33c抗原基因cDNA的克隆及序列分析

本文作者旨在运用分子克隆技术阐明上海市及江苏省丙型肝炎患者血清中两株丙型肝炎病毒（HCV）C33c抗原基因的序列及变异特征，为临床检测提供理论依据，并为进一步表达C33c抗原作好准备，结果表明：上海株及江苏株C33c抗原基因同源性大于99%，推测属同一基因型。此两株与其它分离株相比较，氨基酸水平的同源性（93.08%-97.69%)明显高于核苷酸水平的同源性（81.36%-94.45%)，说明C33c抗原特别适于作诊断抗原。     

恙虫病立克次体Sta58主要抗原基因片段的克隆

作者利用其采用ＰＣＲ技术从恙虫病立克次体基因组中扩增出Ｓｔａ５８主要抗原基因的部分片段，约１ｋｂ，克隆入质粒ｐＳＰ７２的ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ位点，建重组质粒ｐＳＰＲＫ９，又将ｐＳＰＲＫ９中的ＡｃｃＩ小片段约５００ｂｐ亚克隆至ｐＳＰ７２构建重组质粒ｐＳＰＲＫ７。以上无性繁殖系的建可为我国开展恙虫病立克次体核酸杂交研究提供特异核酸探针。