用PCR扩增的人抗体重链Fd基因构建抗体重链基因库

用ＰＣＲ扩增的人抗体重链Ｆｄ基因构建抗体重链基因库万泽生，姜绍谆，马文煜（第四军医大学微生物学教研室，酉安７１００３２）王海涛（军事医学科学院微生物流行病研究所，北京１０００７１）我们以往报道了以人外周血Ｂ淋巴细胞的ＣＤＮＡ为模板，扩增出抗体重链可变...     

人免疫球蛋白重链基因的染色体定位

用次黄嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型P3x63Ag8小鼠骨髓瘤细胞与人周围淋巴细胞或GM607,或GM1056人淋巴母细胞样细胞或GM1500人骨髓瘤细胞以聚乙烯二醇1000进行融合。将融合培养物接种于含选择培养基(HAT)的24孔Linbro盘内,把孔内长成单个集落(克隆)的细胞挑出来,使其在非选择培养基中继续生长,把产生人抗体链的杂交克隆在96孔Linbro盘的孔内作成单个细胞的继代克隆与亚继代克隆(subsubcl-oned)。     

以反向 PCR 扩增抗人宫颈癌单克隆抗体重链可变区基因

单克隆抗体 (ｍＡｂ)Ｖ区ｃＤＮＡ序列的克隆是构建单链抗体 (ＳｃＦｖ)的关键一步[1 ] 。通常是在抗体Ｖ区序列两头 5′和 3′端设计带简并碱基的引物 ,用普通ＰＣＲ法进行扩增[2 ] 。该法虽看似简单 ,但局限性很大 ,若遇到同源性差且复杂的序列 ,则难以获得。同时 ,因带有简并碱基 ,可使ＰＣＲ产物不纯 ,而影响蛋白的表达及其功能。我们在构建抗人宫颈癌ＳｃＦｖ过程中 ,用常规ＰＣＲ法扩增出ＶＬｃＤＮＡ序列 ,经多种方法尝试 ,均未获得ＶＨ ｃＤＮＡ序列。随后 ,采用反向ＰＣＲ技术扩增并经测序证明 ,确为ＶＨ ｃＤＮＡ序列 ,为重组制…     

鼻咽癌单克隆抗体重链可变区基因的扩增

鼻咽癌单克隆抗体重链可变区基因的扩增张秋萍，林学颜（中山医科大学免疫学教研室，广州５１００８９）由于小鼠单克隆抗体ＭＣＡｂ对人体具有免疫原性，不适用于人体的常规治疗［１］，为克服这种困难，人们将杂交瘤技术和遗传工程技术结合起来制备人源化的嵌合抗体。其...     

免疫球蛋白可变区基因的体外扩增、序列分析及人-鼠嵌合重链抗体的表达

本文用聚合酶链反应法(PCR)扩增了抗人小细胞肺癌单克隆抗体的轻、重链可变区基因(V_k、V_H基因)。逐步克隆将V_H基因与表达质粒重组,最终与载有人恒定区基因的载体拼接,得嵌合质粒的在哺乳类细胞中表达了人-鼠嵌合重链抗体。 1 免疫球蛋白可变区基因的体外扩增用酸性异硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提抗人小细胞肺癌单克隆抗体的细胞,得较高质量的总RNA,用oligo(dT)为引物合成第一链     

用PCR技术扩增抗人小细胞肺癌单克隆抗体的重链变区基因并进行克隆和序列分析

本文从抗人小细胞肺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞中抽提总RNA,应用酸酚法抽提得到的总RNA,其质量较好,28S RNA:18S RNA约为2:1,基本上无细胞DNA     

从人外周血B淋巴细胞中应用PCR扩增人抗体基因

本文用常规ＰＣＲ法和半套式ＰＣＲ法，以一组人抗体重链和轻链引物，直接从人外周血淋巴细胞中扩增出抗体重链Ｆｄ基因和轻链基因。一些常规ＰＣＲ法不能直接扩增的人抗体基因，用半套式ＰＣＲ法扩增却得到了阳性结果。扩增的抗体基因的分子量与国内外同类报道一致。本文结果提示，在建立抗体基因文库时，半套式ＰＣＲ法能进一步丰富扩增的抗体基因的多样性     

用Mega-primer PCR方法获得抗HBsAg dsFv抗体重链可变区基因

目前已发展的定点突变方法主要有盒式突变、寡核苷酸引物突变及ＰＣＲ突变等[1]。常用的ＰＣＲ定点突变法,需要四种扩增引物,共进行三轮ＰＣＲ反应,操作步骤繁琐。近来出现的ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒＰＣＲ方法[2]克服了这一缺点。我们设计了三条引物,建立了ｍｅｇａｐｒｉｖ...     

新生儿免疫球蛋白重链可变区基因多样性分析

目的　构建不同胎龄新生儿IgH基因指纹图谱 ,探讨新生儿成熟度对IgH基因谱型多样性的影响 .方法提取 2 7～ 42周新生儿RNA、进行RT -PCR反应、6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色 ,获得不同胎龄新生儿IgH基因指纹图谱 ,用Tiger凝胶图像分析仪进行曲线转化和分析 .结果　各家族指纹图谱转化后的曲线下面积积分值 ,在 2 8～ 3 2周、3 3～ 3 6周和 3 7～ 42周新生儿之间无差异 ;但胎龄 2 7周新生儿曲线下面积小于胎龄 2 8～ 42周新生儿 .结论　 2 8周可能是人类IgH基因谱型发育由不完善到趋于完善的一个转折点 ,2 8周到足月的新生儿IgH基因谱型发育趋于稳定     

新生儿免疫球蛋白重链可变区基因多样性分析

目的构建不同胎龄新生儿IgH基因指纹图谱,探讨新生儿成熟度对IgH基因谱型多样性的影响.方法提取27～42周新生儿RNA、进行RT-PCR反应、6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色,获得不同胎龄新生儿IgH基因指纹图谱,用Tiger凝胶图像分析仪进行曲线转化和分析.结果各家族指纹图谱转化后的曲线下面积积分值,在28～32周、33～36周和37～42周新生儿之间无差异;但胎龄27周新生儿曲线下面积小于胎龄28～42周新生儿.结论 28周可能是人类IgH基因谱型发育由不完善到趋于完善的一个转折点,28周到足月的新生儿IgH基因谱型发育趋于稳定.     

免疫球蛋白重链可变区基因的结构及表达

在阐明真核基因组结构及功能的研究进程中,免疫球蛋白(Ig)基因十分引人注目,这不仅是由于它的结构比较复杂,而且由于它的表达牵涉体细胞分化过程中特有的DNA重组排列,突出反映了真核基因组织和表达的精巧。对Ig基因已有过不少综述,本文着重归纳重链(H)可变区(V)基因的结构和表达方面研究的进展。胚原型重链可变区基因的结构概貌重链V区(V_H)基因群与其3＇侧下游的恒定区(C_H)基因群相连成重链基因族(gene family),位于小鼠第12号染色体,     

骨髓瘤细胞免疫球蛋白重链基因可变区的研究

为分析多发性骨髓瘤 (multiplemyeloma,MM )细胞对免疫球蛋白重链基因可变区 (VH)基因家族的取用 ;根据VH 基因突变特点 ,揭示MM细胞的起源。以重链基因可变区 (VH1 VH6 )基因家族特异性引物 ,用PCR法扩增骨髓瘤细胞系CZ 1细胞和 98例MM患者外周血单个核细胞VH 基因片段 ,纯化后的PCR产物和pMD18 T载体连接并转化JM10 9细菌 ,经克隆鉴定后 ,目的DNA片段用末端双脱氧法测定DNA序列 ,和其对应的胚系基因序列比较。结果表明MM细胞对各VH 基因家族的取用顺序为VH3>VH1>VH4 >VH2 >VH5 >VH6 ;MM细胞VH 基因互补决定区 (CDR )氨基酸替换性突变 (R突变 ) /氨基酸静寂性突变 (S突变 )等于 9 6 7,而骨架区 (FR )R/S等于 0 87,而且随着疾病的进展 ,IgVH 基因并不发生进一步的突变。结论是MM前体细胞在进行VDJ基因重排时 ,对VH 基因家族的取用和基因家族相对大小有关 ;MM细胞可能起源于已经发生抗原选择和体细胞突变的B记忆细胞或前浆细胞。     

免疫球蛋白重链基因的结构、重组和表达

免疫球蛋白是由重链和轻链多肽组成的一类十分复杂的抗体蛋白质.以IgG为例,是由两条相同的轻链和两条相同的重链多肽通过链间和链内的双硫键连接构成.重链多肽和轻链多肽分别是由重链基因和轻链基因编码.我们已阐述了免疫球蛋白轻链基因的结构、功能、重组和表达等问题.免疫球蛋白重链基因较之轻链基因要复杂得多.     

长链PCR扩增低密度脂蛋白受体基因大片段的研究

为探讨扩增大片段ＤＮＡ的方法，应用长链聚合酶链反应（长链ＰＣＲ）法从外周血细胞基因组中扩增获得低密度脂蛋白（ＬＤＬ）受体基因６个片段，它们的长度分别为：５．５、５．０、７．０、６．８、３．５和８．３ｋｂ。各扩增产物都经Ｄｙｎａｌｂｅａｄｓ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ双脱氧固相测序法测定证实。讨论了长链ＰＣＲ技术中影响效率和特异性的关键参数，以及此项新技术在ＬＤＬ受体基因突变检测和家族性高胆固醇血症等基因诊断中的应用前景。为基因大片段的扩增提供了有效方法。     

半巢式 PCR 联合 Southern 杂交检测白血病免疫球蛋白重链(IgH)基因重排

应用ＰＣＲ方法检测免疫球蛋白重链（ＩｇＨ）基因重排可进行白血病微小残留病（ＭＲＤ）研究，应用半巢式ＰＣＲ法检测白血病患者ＩｇＨＣＤＲ－Ⅲ片段，７３．５％（２５／３４）急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ，简称急淋），７５％（３／４）慢性淋巴细胞白血病（ＣＬＬ，简称慢淋），１５．２％（５／３３）急性非淋巴细胞白血病（ＡＮＬＬ，简称急非淋）和０％（０／１９）慢性粒细胞白血病（简称慢粒）存在ＩｇＨ基因重排，所有阳性病例都通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交加以证实，结果显示①半巢式ＰＣＲ较一次ＰＣＲ不仅灵敏度提高，而且在一定程度上能降低假阴性率。②ＩｇＨ重排并不只局限于Ｂ淋巴细胞白血病，还可出现于部分急非淋病例，其机理有待于进一步探讨。     

基因扩增:PCR及其它类似技术

1985年Cetus公司的科学家首次报道了PCR技术,可以快速扩增微量DNA。随着PCR技术的发展又出现了一些类似的新技术。如:连接酶链反应(ligase chain reaction,LCR),基于核酸序列的扩增(Nucleic Acid Sequence based Ampli-fication,NASBA)和Qβ复制酶(Qβ replicase).聚合酶链反应(PCR)PCR是应用一对寡核苷酸引物结合到正负链上的靶序列两侧,从而酶促合成多个拷贝的靶序列     

正常人体免疫球蛋白重链恒定区基因的遗传性缺失

人类基因的特异性探针可以从基因组的水平上研究遗传性或获得性基因的异常。人类抗体基因的研究更使人感兴趣,因为很多白血病及免疫缺失性疾病中有多种基因关系的表达。正常成年人有五类Ig,即IgM、IgG、IgD、IgE及IgA,亚类为IgG1～IgG4及IgA1～IgA2。这些免疫球蛋白含γ1、γ2、γ3、γ4及α1、α2重链恒定区(C_H)。     

应用巢式PCR扩增人B7cDNA

应用巢式ＰＣＲ扩增人Ｂ７ｃＤＮＡ王顺友，黄秋花，陈竺，马宝骊上海市免疫学研究所上海２０００２５自１９８２年Ｙｏｋｏｃｈｉ等发现特异性表达于激活Ｂ细胞表面的Ｂ细胞激活抗原Ｂ７后［１］，随着对其性质及功能研究的深入，使Ｂ７分子成为当今肿瘤治疗方面最引人注...     

不同胎龄新生儿免疫球蛋白重链基因CDR3序列特征

目的分析和比较不同胎龄新生儿免疫球蛋白重链（IgH）基因CDR3序列特征,探讨新生儿成熟度对CDR3序列多样性的影响。方法从10例胎龄25～30周的极不成熟儿、12例胎龄31～36周的不成熟儿和11例胎龄37～41周的成熟儿脐血B细胞中抽提模板DNA,使用巢式PCR技术扩增IgH基因、然后对扩增物进行克隆和CDR3序列测定。结果①在极不成熟儿、不成熟儿和成熟儿,CDR3长度分别为29.4±7.8、32.4±9.2和40.8±10.7bp,其中的N区-D基因片段-N区（NDN）长度分别为13.5±5.6、16.1±7.8和22.0±8.5bp。②极不成熟儿和不成熟儿优先使用DP73和DP75,成熟儿优先使用V