线粒体通透性转换孔与心肌细胞缺氧/复氧过程中炎症反应关系的实验研究

目的 探讨线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)功能状态与心肌细胞缺氧/复氧损伤过程中炎症反应的关系.方法 心肌细胞培养72 h后,采用随机数字表法将其随机分为4组:空白对照组(Sham 组)、缺氧/复氧损伤对照组(AR组)、mPTP开放抑制剂环孢素A(ciclosporin A,CSA)后处理组(CSA组)、mPTP开放剂苍术苷(atractyloside,ATR)后处理组(ATR组).实验结束后检测各组心肌细胞乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率、心肌细胞凋亡、线粒体膜电位的变化和心肌细胞核转录因子-κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)与磷酸化核转录因子-κBp65 Ser536(p-NF-κB p65 Ser536)蛋白的表达量,并检测心肌细胞培养上清液白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的浓度.结果 与AR组比较,CSA组LDH漏出率显著降低[(27.2±2.6)％,(19.0±2.3)％](P＜0.01),早期凋亡细胞百分比显著降低[(33.4±2.8)％,(15.4±2.3)％](P＜0.01),p-NF-κB p65 Ser536蛋白表达量显著降低(5.1±0.7,4.4±0.4)(P＜0.01),IL-6和TNF-α浓度均显著降低[IL-6 (190±10),(170±11) ng/L;TNF-α(129±9),(118±12) ng/L](P＜0.01).与AR组比较,ATR组LDH漏出率显著升高[(27.2±2.6)％,(32.1±3.6)％](P＜0.01),早期凋亡细胞百分比显著升高[(33.4±2.8)％,(43.0±3.3)％](P＜0.0l),p-NF-κB p65 Ser536蛋白表达量显著升高(5.1±0.7,5.8±0.6)(P＜0.01),IL-6和TNF-α浓度均显著升高[IL-6 (189±10),(205±9) ng/L;TNF-α(129±9),(144±10) ng/L] (P＜0.01).结论 mPTP开放状态能够通过调控心肌细胞缺氧/复氧过程中的炎症反应而显著影响缺氧/复氧心肌细胞损伤的程度.     

地氟醚预处理对中性粒细胞介导心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的研究地氟醚预处理对中性粒细胞介导的心肌细胞的缺氧/复氧损伤的保护作用。方法 原代培养的SD乳鼠心肌细胞,随机分为四组:缺氧,复氧组、中性粒细胞介导缺氧,复氧组、地氟醚预处理组、地氟醚预处理 中性粒细胞介导缺氧/复氧组,各组缺氧前时测定乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶-MB(CK-MB)活性、肌钙蛋白T(TnT)浓度和心肌细胞搏动频率,复氧后测定LDH、CK-MB活性、TnT浓度、心肌细胞搏动频率、心肌存活率和节律失常发生率。结果 除地氟醚预处理组外,各组缺氧前和复氧后各指标差异均有显著性(P<0.05或0.01)。LDH、CK—MB活性缺氧前和复氧后时的差值、心肌存活率和节律失常发生率在各组间差异有显著性(P<0.01),TnT缺氧前和复氧后的差值组间无明显差异(P>0.05)。组间地氟醚预处理 中性粒细胞介导缺氧,复氧组较中性粒细胞介导缺氧/复氧组LDH、CK—MB活性缺氧前和复氧后的差值及节律失常发生率降低(P<0.01),心肌细胞存活率明显升高(P<0.01),但仍不如单纯缺氧/复氧组上述指标。结论 地氟醚减轻中性粒细胞介导的缺氧/复氧损伤,但不能完全阻断其心肌细胞的损伤。     

PKC在缺氧预处理和去甲肾上腺素预处理减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用

目的 评价蛋白激酶C(PKC)在缺氧预处理和去甲肾上腺素预处理减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用.方法 原代培养乳鼠心肌细胞,随机分为6组(n=25):对照组(Ⅰ组)常规培养;缺氧复氧组(Ⅱ组)细胞缺氧3 h,复氧1 h;缺氧预处理组(Ⅲ组)缺氧20 min,复氧20 min后制备缺氧复氧模型;去甲肾上腺素预处理组(Ⅳ组)细胞经终浓度为10-7 mol/L去甲肾上腺素孵育30 min后,去除去甲肾上腺素,再行缺氧复氧;H7+缺氧预处理组(Ⅴ组)细胞经终浓度为5×10-5 mol/L的H7孵育10 min后,去除H7,其余操作同Ⅲ组;H7+去甲肾上腺素预处理组(Ⅵ组)细胞经终浓度为5×10-5 mol/L的H7(PKC活性抑制剂)孵育10 min后,去除H7,其余操作同Ⅳ组.复氧结束后,测定心肌细胞存活率、培养液乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性和心肌细胞MDA含量和SOD活性.结果 与Ⅰ组比较,Ⅱ组细胞存活率和SOD活性降低,LDH、CK的活性及MDA含量升高(P＜0.01).与Ⅱ组比较,Ⅲ组和Ⅳ组细胞存活率和SOD活性升高,LDH、CK活性及MDA含量降低(P＜0.01).与Ⅲ组比较,Ⅴ组细胞存活率和SOD活性降低,LDH、CK活性及MDA含量升高(P＜0.01).与Ⅳ组比较,Ⅵ组细胞存活率和SOD活性降低,LDH、CK活性及MDA含量升高(P＜0.05).结论 PKC激活参与了缺氧预处理与去甲肾上腺素预处理减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤.     

缺氧诱导因子1α对缺氧条件下大鼠心肌细胞糖酵解的影响

目的观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对缺氧状态下大鼠心肌细胞糖酵解的影响。方法常规分离、培养大鼠心肌细胞,分为单纯缺氧组:使用无糖培养基在低氧混合气体(体积分数94%N2、5%CO2、1%O2)中培养;HIF-1α抑制组:先利用RNA干扰技术构建HIF-1α蛋白低表达的细胞模型,再作上述缺氧培养。两组细胞均设缺氧前(常规培养)及缺氧1、3、6、12、24h6个时相点,采用生物化学方法检测细胞中糖酵解关键酶己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性以及培养上清液中乳酸(LA)的含量。结果(1)HK、PFK活性:与缺氧前比较,两组心肌细胞两酶活性均呈先升高后下降的变化趋势。单纯缺氧组两酶活性峰值分别为(159±13)、(298±44)U/g.HIF-1α抑制组两酶活性在缺氧1、3、6h时均明显低于单纯缺氧组(P<0.05或0.01),其峰值分别为(133±55)、(188±55)U/g.(2)LDH活性、LA含量:与缺氧前(92±12)U/g比较,单纯缺氧组细胞LDH活性缺氧后显著升高,6h时达高峰(2568±125)U/g(P<0.01),随后逐渐下降;各时相点培养上清液中LA含量也成倍增加。HIF-1α抑制组细胞的LDH活性于缺氧3h时达峰值(2125±126)U/g,明显高于缺氧前(P<0.01);培养上清液中LA含量亦较缺氧前增高(P<0.01),但增幅较小。结论缺氧条件下大鼠心肌细胞中HIF-1α高表达是细胞糖酵解持续增强的直接原因,此为心肌细胞应对缺氧环境的重要内源性保护机制。     

甘氨酸对大鼠缺血缺氧心肌细胞凋亡的影响

目的 明确甘氨酸对缺血缺氧致心肌细胞凋亡过程的影响.方法 建立SD乳鼠心肌细胞缺血缺氧模型,分为单纯缺血缺氧组和甘氨酸处理组(培养液中加入终浓度5 mmoL/L甘氨酸,其余处理同单纯缺血缺氧组).以SD乳鼠正常心肌细胞作为对照组.3组细胞培养6 h后,检测凋亡情况、线粒体跨膜电位及分布情况、线粒体通透性转换孔(mPTP)开放情况及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性变化.结果 (1)细胞凋亡程度:对照组和甘氨酸处理组荧光强度均明显低于单纯缺血缺氧组(P<0.01).(2)线粒体跨膜电位:对照组心肌细胞荧光强度为73±4,单纯缺血缺氧组荧光强度(32±7)明显较弱(P＜0.01),甘氨酸处理组荧光强度(52±4)强于单纯缺血缺氧组(P＜0.01).(3)mPTP开放情况:对照组心肌细胞线粒体荧光强度(90±7)较强,甘氨酸处理组荧光强度(62±8)明显强于单纯缺血缺氧组(27±4,P＜0.01).(4)caspase-3活性:对照组和甘氨酸处理组均显著低于单纯缺血缺氧组(P＜0.01).结论 甘氨酸对缺血缺氧心肌细胞具有抗凋亡作用,其机制可能与改变线粒体膜电位、减少mPTP开放、减轻钙超载、降低caspase-3活性有关.     

血红素加氧酶-1在七氟醚预处理减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用

目的 探讨血红素加氧酶-1(HO-1)在七氟醚预处理减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用.方法 新生健康清洁级SD大鼠15只,日龄1～3d,处死后取心室肌组织,原代培养心肌细胞,以1×106个/ml接种于6孔培养板或以2× 105个/ml接种于24孔培养板,采用随机数字表法,将其随机分为4组(n＝25):对照组(C组)常规培养;缺氧复氧组(H/R组)采用缺氧2h,复氧1h的方法制备心肌细胞缺氧复氧损伤模型;七氟醚预处理组(S+ H/R组)细胞经2.5％七氟醚预处理20min后行药物洗脱10 min,再行缺氧复氧处理;锌原卟啉+七氟醚预处理组(ZnPP+ S+ H/R组)细胞经HO-1抑制剂锌原卟啉3 μmol/L孵育1h后,行七氟醚预处理及缺氧复氧处理.于复氧结束后测定心肌细胞HO-1表达、细胞凋亡率、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)、线粒体膜通透性转运孔(PTP)开放程度、细胞色素C(Cyto C)表达及培养液LDH和CK活性.结果 与C组比较,H/R组心肌细胞HO-1和胞浆Cyto C表达上调,线粒体Cyto C表达下调,培养液LDH、CK活性、细胞凋亡率、[Ca2+]i和PTP开放度升高(P<0.01).与H/R组比较,S+H/R组心肌细胞HO-1和线粒体Cyto C表达上调,胞浆Cyto C 表达下调,培养液LDH、CK活性、细胞凋亡率、[Ca2+]i和PIP开放度降低(P<0.01).与S+H/R组比较,ZnPP+ S+ H/R组心肌细胞HO-1和线粒体Cyto C表达下调,胞浆CytoC表达上调,培养液LDH、CK活性、细胞凋亡率、[Ca2+]i和PTP开放度升高(P<0.01).结论 HO-1表达上调参与了七氟醚预处理减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤.     

mAb2G4/ODN/lip在H9C2心肌细胞缺氧复氧模型中的保护作用

目的 探讨抗肌球蛋白单克隆抗体2G4/寡核苷酸/阳离子脂质体复合物(mAb2G4/ODN/lip)在H9C2心肌细胞缺氧复氧模型中的作用及机制.方法 将培养的心肌细胞按随机数字表法分为五组:正常对照组(C组)、单纯缺氧-复氧组(IR组)、mAb2G4/ODN/lip 2μg处理组(L组)、mAb2G4/ODN/lip 4μg处理组(M组)和mAb2G4/ODN/lip 6 μg处理组(H组).C组不作任何处理;IR组细胞孔加入生理盐水;其余三组加入不同剂量mAb2G4/ODN/lip处理细胞4h,更换普通培养基继续培养20 h.各实验组再进行缺氧2h复氧1h处理.MTT法测五组心肌细胞活力;ELISA法测TNF-α、IL-6、IL-8、AST、CK及SOD的浓度.结果 与C组比较,其余四组细胞活力明显下降,TNF-α、Ⅱ-6、IL-8、AST、CK浓度明显升高,SOD浓度明显降低(P＜0.01);与IR组比较,L组和M组细胞活力明显上升,TNF-α、IL-6、IL-8、SOD浓度明显升高,AST、CK浓度明显降低(P＜0.01).与L组比较,M组和H组TNF-α、IL-6、IL-8和SOD浓度明显升高,AST、CK浓度明显降低(P＜0.01).结论 mAb2G4/ODN/lip 2μg、4 μg处理能够通过特异性的结合受损心肌细胞,抑制炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8的表达,降低AST、CK表达,升高SOD浓度,对缺氧复氧心肌细胞起到保护作用.     

地氟烷预处理对幼鼠心肌细胞血管紧张素受体Ⅰ型表达的影响

目的 观察地氟烷预处理对缺氧,复氧心肌细胞血管紧张素受体Ⅰ型(AT1受体)表达的影响。方法无菌取新生2—3 d的SD幼鼠心室,采用胰蛋白酶消化成散在的单个细胞。加入DMEM培养液培养至第7天。随机分为四组,组1:细胞不经任何处理;组2:缺氧2 h,复氧1 h;组3:1.5 MAC地氟烷预处理20 min,清洗10 min,其余处理同组2;组4:地氟烷预处理前5 min,培养液中加入AT1受体阻断剂洛沙坦(Losartan),终浓度为10-6mol/L。比色法测培养液中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性;Rt-PCR测各组细胞AT1受体的基因表达(mRNA)。结果 组2CK、LDH活性及AT1受体mRNA的相对含量均高于组1(P<0.01);组3 CK、LDH活性及AT1受体mRNA均降低(与组2和组1比较,P<0.01);组4与组3比较CK、LDH活性及AT1受体mRNA的相对含量上升(P<0.05或0.01),但仍低于组2(P<0.01)。结论 地氟烷预处理可部分逆转缺氧/复氧所致的心肌细胞损伤,其保护效应的发生机制部分由AT1受体介导。     

尼卡地平对缺氧/复氧心肌细胞损害及细胞内Ca~(2 )的影响

目的 :研究尼卡地平对缺氧 /复氧心肌细胞损害及细胞内Ca2 的影响。方法 :培养 4～ 5天原代SD大鼠心肌细胞分为正常对照、单纯缺氧 /复氧以及低剂量和高剂量 (终浓度分别为 30ng/ml和 2 70ng/ml)的尼卡地平预防用药 2 0分钟后缺氧 /复氧四组。实验结束测定培养液乳酸脱氢氧酶 (LDH)和肌酸激酶 (CK)活性以及细胞内Ca2 含量。结果 :缺氧复氧后 ,心肌细胞内游离Ca2 浓度 ,以及培养液中LDH和CK活性显著升高。高剂量尼卡地平能明显减轻这种升高 ,而低浓度尼卡地平则无明显影响。结论 :高浓度尼卡地平减轻缺氧 /复氧心肌细胞Ca2 超载 ,对心肌细胞产生一定保护作用     

线粒体ATP敏感性钾通道在降钙素基因相关肽减轻新生大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用

目的评价线粒体ATP敏感性钾通道(mitoK_(ATP)通道)在降钙素基因相关肽(CGRP)减轻新生大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用。方法取原代培养的新生1～3 d SD大鼠心肌细胞,在含有10%胎牛血清培养基中培养,细胞接种于6孔细胞培养板,采用随机数字表法分为5组(n=10):正常对照组(C组)、缺氧复氧组(AR组)、CGRP+缺氧复氧组(CGRP组)、CGRP+mitoK_(ATP)通道阻滞剂(5-HD)+缺氧复氧组(5-HD组)、CGRP+CGRP受体阻滞剂CGRP_(8-37)+缺氧复氧组(CGRP_(8-37)组)。除C组,其余4组均缺氧3 h,复氧2 h;CGRP组缺氧前2 h加入终浓度为0.1 nmol/L CGRP;5-HD组于缺氧前2.5 h加入终浓度为500μmol/L 5-HD,30 min后加入终浓度为0.1 nmol/L CGRP;CGRP_(8-37)组于缺氧前2.5 h加入终浓度为1 nmol/L CGRP_(8-37),30 min后加入终浓度为0.1 nmol/L CGRP。于缺氧复氧后检测心肌细胞凋亡情况,计算凋亡指数(AI)、乳酸脱氢酶(LDH)活性,JC-1荧光法测定线粒体膜电位(Δψm)的变化,即JC-1多聚体/单聚体的比值。结果 AR组AI明显高于C组(P0.01)LDH活性明显强于C组(P0.01),JC-1多聚体/单聚体的比值明显低于C组(P0.01)。CGRP组和5-HD组AI明显低于AR组(P0.05),LDH活性明显弱于AR组(P0.01),JC-1多聚体/单聚体的比值明显高于AR组(P0.01)。5-HD组和CGRP_(8-37)组AI明显高于CGRP组(P0.01),LDH活性明显强于CGRP组(P0.01),JC-1多聚体/单聚体的比值明显低于CGRP组(P0.01)。结论 CGRP可以激活新生大鼠心肌细胞膜CGRP受体,通过激活mitoK_(ATP)通道,减少心肌细胞缺氧复氧损伤。     

胰岛素样生长因子Ⅰ对大鼠缺血缺氧心肌细胞凋亡的影响

目的 了解胰岛素样生长因子I(IGF-I)对缺血缺氧致心肌细胞凋亡的影响,探讨其调控机制.方法 分离培养SD乳鼠的心肌细胞.于制备缺血缺氧心肌细胞模型(缺血缺氧组)前1 h,用IGF-I(200μg/L)进行干预(干预组),以缺血缺氧组致伤前测定结果为正常对照(对照组).观察不同时相点心肌细胞凋亡的吸光度(A)值、线粒体膜电位变化及磷酸化Akt蛋白表达变化.结果 对照组心肌细胞凋亡A值为0.18±0.03;缺血缺氧后1、3、6、12 h分别为0.33±0.05、0.61 ±0.06、1.17±0.08、2.25±0.11,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);干预组上述时相点的A值分别为0.26±0.04、0.49±0.05、0.84±0.06、1.63±0.09,与缺血缺氧组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).缺血缺氧6、12 h,心肌细胞线粒体膜电位荧光强度较对照组40.2±10.1下降,分别为18.7±5.1、6.3±1.9(P＜0.01),干预组较缺血缺氧组相对增高,分别为28.8±6.2、12.5±3.1(P＜0.05).与对照组比较,其余各组缺血缺氧后6 h磷酸化Akt蛋白表达量增加.结论 IGF-I对缺血缺氧心肌细胞具有抗凋亡作用,其机制可能与IGF-I激活磷脂酰肌醇3-激酶/Akt、增加磷酸化Akt表达、减少细胞色素c的释放有关.     

微管干预剂对大鼠缺氧心肌细胞能量生成的影响

目的 了解缺氧条件下微管干预剂对大鼠心肌细胞能量生成的影响。方法 常规分离、培养大鼠心肌细胞，分为单纯缺氧组、缺氧＋秋水仙碱（微管解聚剂）组及缺氧＋5、10、15 mmol／L紫杉醇（微管稳定剂）组。每组细胞加入刺激剂后，缺氧培养0．5、1．0、3．0、6．0、12．0、24．0h。采用锥虫蓝染色检测细胞死亡率，常规比色法检测细胞肌酸激酶（CK）活性，高效液相色谱法检测细胞腺苷三磷酸（ATP）及腺苷二磷酸（ADP）含量。结果 （1）缺氧＋秋水仙碱组及缺氧＋15mmol／L紫杉醇组细胞培养1．0～24．0h死亡率均高于单纯缺氧组（P〈0．01）；缺氧＋5、10mmoL／L紫杉醇组6．0～24．0h时均低于单纯缺氧组（P〈0．05）。（2）缺氧＋秋水仙碱组培养1．0～12．0h时CK活性均高于单纯缺氧组（P〈0．01）。0．5～12．0h时，缺氧＋15mmoL／L紫杉醇组CK活性均高于单纯缺氧组（P〈0．01）；缺氧＋5、10mmol／L紫杉醇组低于单纯缺氧组（P〈0．05或P〈0．01）。（3）缺氧＋5mmol／L紫杉醇组培养0．5～6．0h ATP含量[（49．9±2．8）、（40．7±2．0）、（25．8±1．9）、（19．1±1．2）μg／10^6个细胞]高于单纯缺氧组[（42．9±5．8）、（29．5±1．8）、（18．2±0．9）、（14．1±0．7）μg／10^6个细胞，P〈0．05或P〈0．01]。0．5～12．0 h时，缺氧＋秋水仙碱组低于单纯缺氧组（P〈0．01）；缺氧＋15mmol／L紫杉醇组低于单纯缺氧组及缺氧＋10mmol／L紫杉醇组（P〈0．01）。各组ADP含量变化趋势与ATP相反。结论 微管解聚剂和高浓度微管稳定剂可使缺氧心肌细胞ATP含量锐减。适宜浓度的微管稳定剂在缺氧早期可促进心肌细胞能量生成，对心肌具有保护作用。     

微管干预剂对缺氧心肌细胞糖酵解途径关键酶的影响

目的 了解微管干预剂对缺氧心肌细胞糖酵解途径关键酶的影响. 方法体外培养心肌细胞,分为单纯缺氧组、缺氧+微管解聚剂(秋水仙碱)组、缺氧+低浓度微管稳定剂组、缺氧+中浓度微管稳定剂组、缺氧+高浓度微管稳定剂组,后3组加入的微管稳定剂为紫杉醇,浓度分别为5、10、15 μmol/L.采用激光共聚焦显微镜观察微管形态学变化,检测细胞活力及己糖激酶、丙酮酸激酶、磷酸果糖激酶、乳酸脱氢酶的活性. 结果缺氧+微管解聚剂组和缺氧+高浓度微管稳定剂组心肌细胞微管结构破坏显著,细胞活力亦明显下降[缺氧1.0 h,2组细胞活力分别为(89.99±3.47)%、(84.56±6.61)%,明显低于单纯缺氧组(97.44±1.76)%(P<0.01)],前3种酶的活性亦明显降低;缺氧+低浓度微管稳定剂组前3种酶的活性与单纯缺氧组基本近似;缺氧+中浓度微管稳定剂组微管结构损伤显著轻于其他组,前3种酶的活性于缺氧6.0 h内高于单纯缺氧组.缺氧后各组乳酸脱氢酶活性升高. 结论适当浓度的微管稳定剂能明显减轻微管结构损伤,促使缺氧早期心肌细胞糖酵解酶活性增强.     

人参皂苷单体Re对大鼠心肌细胞缺氧的作用

目的 观察人参皂苷单体Re对大鼠心肌细胞缺氧的保护作用并探讨其机制.方法 SD大鼠乳鼠心肌细胞原代培养,按照随机数字表法分为5组,每组6个样本.正常对照组细胞常规培养;缺氧对照组细胞常规培养48 h再缺氧培养12 h;另外3组细胞先常规培养48 h,分别用20、40、80 g/L人参皂苷单体Re预处理30 min再缺氧12 h,相对应设为单体Re低、中、高浓度组.采用ELISA法检测心肌细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,荧光漂白恢复(FRAP)实验观察细胞间连接通讯,以FRAP率表示结果.数据处理行组间或配对t检验.结果 (1)与缺氧对照组细胞LDH活性[(403±22)U/L]比较,单体Re低、中、高浓度组均明显降低,分别为(255±16)、(241±13)、(237±24)U/L(t值分别为5.1、5.2、8.3,P值均小于0.05).(2)细胞经激光淬灭后10 min,正常对照组FRAP率为(74.8±3.6)%;缺氧对照组FRAP率为(13.2±5.6)%;单体Re低、中、高浓度组FRAP率分别为(34.3±3.9)%、(36.2±3.1)%、(39.5±2.9)%,与缺氧对照组比较,差异均有统计学意义(t值分别为18.3、-41.9、-6.6,P值均小于0.05).结论 采用人参皂苷单体Re预处理可降低缺氧大鼠心肌细胞LDH的释放,明显改善细胞间连接通讯,对缺氧心肌细胞有明显的保护作用,剂量尤以20 g/L为适宜.

Abstract：

Objective To investigate the protective effect of ginsenoside Re on myocardial cells of neonatal SD rat with hypoxia injury,and to explore its mechanism. Methods The primary passage of myocardial cells collected from neonatal SD rats were divided into A group (with ordinary treatment),B group[exposed to hypoxia (1% O2,5% CO2,94% N2) for 12 hours after being cultured for 48 hours],C group (pretreated with 80 g/L ginsenoside Re for 30 minutes after 48 hours of ordinary culture,then exposed to hypoxia for 12 hours),D group (received the same treatment as used in C group except for using 40 g/L ginsenoside Re),E group (received the same treatment as used in C group except for using 20 g/L ginsenoside Re) according to the random number table,with 6 samples in each group. Myocardial cell supernatants were collected for determination of content of lactate dehydrogenase (LDH) with enzyme linked immunosorbent assay. Fluorescence recovery after photobleaching technique was used to detect gap junction intercellular communication (GJIC).Result was observed by laser scanning confocal microscope. Data were processed with paired t test. Results (1) Compared with that in B group[(403±22)U/L],contents of LDH in E,D,and C groups were obviously decreased[(255±16),(241±13),(237±24)U/L,with t value respectively 5.1,5.2,8.3,P values all below 0.05]. (2) The fluorescence recovery rate in A group was (74.8±3.6)% 10 min after quenching,which was higher than that in B group[(13.2±5.6)%,t=15.2,P<0.01]. The fluorescence recovery rate in C,D,and E groups was respectively (39.5±2.9)%,(36.2±3.1)%,and (34.3±3.9)% 10 min after quenching,all higher than that in B group (with t value respectively -6.6,-41.9,18.3,P values all below 0.05). Conclusions Ginsenoside Re pretreatment,particularly with a dose of 20 g/L,can protect myocardial cells from hypoxia injury,and the effect may be attributable to inhibition of release of LDH and improvement of the GJIC function.     

热休克蛋白90对大鼠缺氧心肌细胞丝氨酸苏氨酸蛋白激酶表达的影响

目的探讨内源性热休克蛋白90（HSP90）在缺氧心肌细胞丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（AKT）相关信号通路中的作用。方法建立新生Wistar大鼠心肌细胞缺氧模型，将细胞分为正常组、缺氧组、加入HSP90特异性阻断剂格尔德霉素后再缺氧组（格尔德霉素＋缺氧组）。于缺氧后1、3、6、12、24、48h用噻唑蓝法检测心肌细胞的活力；缺氧24h，原位缺口末端标记法检测心肌细胞凋亡指数（AI）；缺氧1、3、6、12、24h，蛋白质印迹法检测大鼠心肌细胞中内源性HSP90及AKT表达水平。结果（1）缺氧24、48h，缺氧组、格尔德霉素＋缺氧组细胞活力均较正常组明显下降（P〈0．05）；格尔德霉素＋缺氧组细胞活力缺氧12h即开始明显下降，缺氧48h时明显低于缺氧组（P〈0．05）。（2）缺氧24h，缺氧组细胞AI为（10．7±1．2）％，明显高于正常组[（1．9±0．3）％．P〈0．05]；格尔德霉素＋缺氧组细胞AI为（26、3±5．3）％，明显高于缺氧组（P〈0．01）。（3）缺氧12h，缺氧组心肌细胞内源性HSP90及AKT表达水平高于正常组与格尔德霉素＋缺氧组；缺氧24h，缺氧组有所下降．格尔德霉素＋缺氧组则下降更明显。结论内源性HSP90对维持心肌细胞的活力有重要作用．缺氧心肌细胞AKT表达水平可受内源性HSP90表达水平的影响。     

心肌细胞缺氧引起微管结构破坏导致线粒体通透性转换孔开放的实验研究

目的观察缺氧引起的心肌细胞微管破坏能否导致线粒体通透性转换孔(MPTP)开放及其呼吸功能的变化情况。方法将原代培养的SD大鼠乳鼠同批心肌细胞随机分为对照组、缺氧组、常氧 解聚剂组、缺氧 稳定剂组。对照组常氧培养。常氧 解聚剂组加入8μmol/L秋水仙素室温平衡30 min后,与对照组一起行常氧培养。缺氧 稳定剂组加入10μmol/L紫杉醇室温平衡30 min后,和缺氧组一起行缺氧处理。检测对照组及其他组细胞处理0．5、1．0、3．0、6．0、12．0h后微管免疫荧光、MPTP的开放及线粒体内膜电位变化,噻唑蓝法测定线粒体的呼吸功能。结果处理0．5h,缺氧组和常氧 解聚剂组微管免疫荧光强度分别为(76．1±3．9)%、(74．8±5．O)%,微管发生明显破坏,MPTP开放,线粒体内膜电位损耗和细胞呼吸功能下降,且随着处理时间的延长,以上现象愈发显著。处理0．5h,缺氧 稳定剂组微管免疫荧光强度为(92．8±4．0)%,与对照组(100．0±0．0)%相近(P＞0．05)；随着处理时间的延长,该组各检测指标的改变程度均明显轻于缺氧组(P＜0．05或0．01)。结论缺氧可引起心肌细胞微管明显破坏,导致MPTP开放,进而影响线粒体的呼吸功能。微管解聚剂能较好地模拟缺氧引起的微管破坏；微管稳定剂则能有效地减轻缺氧引起的微管破坏,改善线粒体通透性转换及其呼吸功能。     

c-Jun氨基末端激酶信号通路对缺氧上调血管内皮细胞钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶表达的影响

目的 了解缺氧对钙／钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶（CASK）表达的影响及c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路在其中的作用。方法 将人血管内皮细胞株EA．hy926进行缺氧处理3h后继续常规培养0、12、24、48、72h，同时设常氧培养对照。采用蛋白质印迹法检测CASK的表达。构建CASK启动子区荧光素酶报告基因质粒。用其转染细胞后，于常氧及缺氧培养1、3、6、12h裂解细胞提取总蛋白，检测报告基因萤火虫荧光素酶及内参照海肾素荧光素酶活性，并用蛋白质印迹法检测JNK磷酸化情况。在培养的细胞中分别加入不同剂量（0、10、100nmo/L，1、10μmol／L）的JNK抑制剂SP600125预处理1h后再缺氧培养3h，观察其对CASK表达的影响。结果缺氧处理后常规培养0～72h，细胞CASK持续保持高表达，并明显高于常氧组。随着缺氧时间延长荧光素酶相对活性普遍增加，均高于常氧组（0．010±0．003，P〈0．01），且缺氧12h达峰值（0．192±0．023）。JNK的磷酸化随缺氧时间延长逐渐增强。加入SP600125后，CASK的表达显著降低，并呈剂量一效应依赖性，其浓度为10μmol／L时，抑制效率达高峰。结论 缺氧上调血管内皮细胞CASK的表达部分依赖于JNK信号通路活化。     

缺氧对人脐静脉内皮细胞株增殖与活力的影响

目的了解缺氧对人脐静脉内皮细胞增殖与活力的影响。方法将体外培养的人脐静脉内皮细胞株 EA.hy926分为常氧组和缺氧组。常氧组常规培养,缺氧组细胞充入混合气体(含体积分数94%N_2、5%CO_2、1%O_2)后置于37℃缺氧培养1、3、6、12 h。提取两组细胞总蛋白,用蛋白质印迹法检测血管内皮生长因子(VEGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平;以噻唑蓝法检测细胞活力,并用流式细胞仪检测细胞周期。结果与常氧组比较,缺氧组细胞培养1 h VEGF 表达增高,6 h 达高峰,12 h 降低但仍明显高于常氧组;培养3 h 时细胞 PCNA 蛋白表达开始升高,6 h 达峰值并持续至12 h。培养1、3 h,缺氧组细胞活力较常氧组明显增高(P<0.05),6 h 开始下降,至12 h 时低于常氧组但差异无统计学意义(P>0.05)。缺氧组细胞培养1、3、6 h,G_0/G_1期细胞均较常氧组少,S 期和 G_2/M 期细胞增多,增殖指数(PI)各为(43±9)%、(39±11)%、(40±11)%,均高于常氧组(32±9)%,其中3、6 h 时差异有统计学意义(P<0.05);12 h 时 PI 为(27±4)%,降至常氧组水平以下(P<0.05)。结论缺氧早期可促进人脐静脉内皮细胞增殖,但随着缺氧时间的延长细胞增殖将受抑制。     

p38丝裂原活化蛋白激酶途径在大鼠严重烧伤后早期心肌膜磷降解中的作用

目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径在严重烧伤后早期心肌胞质型磷脂酶A2（cPLA2）表达及膜磷脂降解中的作用。方法将Wistar大鼠分为：正常组（8只）、单纯烧伤组（40只）、烧伤＋SB203580组（16只）和烧伤＋等渗盐水组（16只）。后3组大鼠制成40％TBSAⅢ度烧伤模型,后2组按实验设计分别注射p38MAPK抑制剂SB203580或等渗盐水。单纯烧伤组设5个时相点,其余烧伤组设2个时相点,每时相点8只。检测各组大鼠心肌cPLA2 mRNA表达和膜磷脂含量变化。缺氧复合烧伤血清处理体外培养的大鼠心肌细胞,观察SB203580对其cPLA2 mRNA表达的影响。结果单纯烧伤组大鼠伤后各时相点cPLA2 mRNA表达显著高于正常组的0．280±0．020,伤后3h达峰值;单纯烧伤组大鼠心肌膜磷脂含量伤后即降低,6h达最低值[（0．052±0．017）mg磷／mg蛋白]。烧伤后心肌cPLA2 mRNA表达与膜磷脂含量呈显著负相关（r=-0．53,P＜0．05）。与烧伤＋等渗盐水组比较,伤后6、12h烧伤＋SB203580组大鼠心肌磷酸化p38MAPK水平显著降低,cPLA2 mRNA表达仅为该组的72％、51％（P＜0．01）,心肌膜磷脂含量也显著高于该组。此外,SB203580也显著降低了缺氧复合烧伤血清处理的离体大鼠心肌细胞cPLA2 mRNA的表达水平。结论p38MAPK途径在大鼠严重烧伤后早期心肌膜磷脂降解中起重要作用,其机制可能与磷酸化p38MAPK上调心肌cPLA2 mRNA表达水平有关。