人乳腺癌转移抑制基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建乳腺癌转移抑制基因（BRMS1）的真核表达载体pcDNA3．1（-）B／myc-BRMSI,为进一步研究恶性肿瘤的转移机制及基因治疗提供物质基础。方法常规方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,Trizd法提取细胞株总RNA;设计一对特异性引物,经过逆转录反应获得BIIMS1 cDNA的CDS序列,连接到质粒pcDNA3．1／mye—His（-）B上,构建BRMS1的真核表达载体peDNA3．1（-）B／myc．BRMS1,行基因测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK-293,行Westernblot验证其是否表达。结果重组质粒pcDNA3．1（-）B／myc-BRMS1经双酶切及基因测序分析,验证了克隆的人BRMS1基因cDNA序列与GenBank[AF159141]公布的人BRMS1基因的cDNA序列吻合,重组体peDNA3．1（-）B／myc—BRMS1中插入的目的基因BRMS1是正向、单倍插入。结论成功构建了BRMS1真核表达载体pcDNA3．1（-）B／myc—BRMS1,为深入研究BRMS1基因功能和BRMS1基因治疗奠定了物质基础。     

结肠癌组织中乳腺癌转移抑制基因1的表达及意义

目的 探讨乳腺癌转移抑制基因1( BRMS1)在结肠癌组织中的表达及其意义.方法 采用免疫组化二步法,检测46例结肠癌组织及癌旁组织中BRMS1蛋白的表达情况,并结合临床病理特征分析其临床意义.结果 结肠癌组织与癌旁组织中BRMS1的阳性表达率分别为34.8％(16/46)、84.8％( 39/46),差异有统计学意义(x2 =23.92,p ＜0.01):BRMS1表达与结肠癌肿块大小、临床分期、淋巴结转移状态密切相关(x2=6.02、4.28、4.35,均P＜O.01),与患者年龄、病理类型等无关.结论 BRMS1在结肠癌的转移过程中可能起到抑制作用,检测结肠癌组织中BRMS1蛋白的表达,有助于判断其预后.     

人survivin基因反义真核表达载体的构建及初步鉴定

目的 构建人survivin基因反义真核表达载体。方法 采用分子克隆技术。用SacⅠ和SacⅡ双酶切pGEM-T Easy-survivin．然后将该片段反向插入真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点。最后对产生重组子进行琼脂糖凝胶电泳。结果 经琼脂糖凝胶电泳鉴定，将目的片段成功的连接到pIRES2-EGFP上。结论 成功地将survivin目的片段反向插入到pIRES2-EGFP中，构建了人survivin反义真核表达裁体pIRES2-EGFP-survivin。     

MCHR1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建有效针对小鼠黑色素浓集激素受体1(melanin-concentrating hormone receptor 1,MCHR1)的shRNA(small hairpin RNA)真核表达载体。方法设计合成3条小鼠MCHR1基因的shRNA序列以及1条无同源性的shRNA序列作为阴性对照,与质粒重组构建sh-MCHR1干扰载体,并进行菌液PCR和DNA测序鉴定;脂质体法转染小鼠3T3-L1细胞后观察MCHR1 mRNA和蛋白表达的变化。结果经菌液PCR及DNA测序鉴定表明各shRNA载体构建成功;转染3T3-L1细胞后,与空载体组相比,阴性对照组MCHR1 mRNA和蛋白的表达均无明显差异,但实验组3种干扰载体均能显著抑制MCHR1 mRNA和蛋白的表达(P<0.05),且3种载体的抑制程度有一定的差异,以sh-MCHR1-1载体沉默效果最佳。结论 sh-MCHR1干扰载体构建成功,为进一步探究MCHR1与肥胖症之间的关系奠定了实验基础。     

人转化生长因子β1质粒真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定人转化生长因子β1(TGF-β1)基因真核表达栽体。方法设计含XbaI和XhoI酶切住点的TGF-β1cDNA引物，采用RT-PCR法，扩增TGF-β1cDNA片段，纯化PCR产物，XbaI和XhoI双酶切并连接至pcDNA3。转化感受态大肠杆菌DH5α。酶切鉴定阳性重组子，并进行序列测定。结果琼脂糖凝胶电泳显示，用XbaI和XhoI双酶切后可形成两条带，分子量分别为1．2kb和5．38kb。符合物理图谱，表明栽体成功构建，并且测序结果与预期结果完全一致。结论成功构建了人TGF-β1基因真核表达栽体。     

c-myc靶向siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：设计构建重组体为转染肿瘤细胞，观察癌基因的沉默效果，为探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础。方法：以c-myc为靶基因，以pEGFP-C1／U6质粒为载体，设计构建重组体，根据c-myc癌基因cDNA序列，设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列，克隆到空载体pEGFP-C1／U6中，转化DHSa菌株，提取质粒，进行酶切鉴定和测序分析。结果：经酶切鉴定筛出的重组体测序结果与目的序列相同，重组载体构建成功。结论：利用RNAi技术可成功构建小干扰RNA重组体。     

VEGFA基因重组真核表达载体的构建与表达

目的 构建VEGFA基因重组真核表达载体pEGFP-VEGFA,并检测其在人胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达.方法 以人脐血单核细胞的RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增VEGFA基因,并将其定向插入真核表达载体pEGFP-Nl中,构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA.经限制性核酸内切酶BglII和SalI酶切和DNA测序鉴定后,用脂质体法将pEGFP-VEGFA转染HEK293T细胞,转染后24 h和48 h采用荧光显微镜观察pEGFP-VEGFA的表达.结果 pEGFP-VEGFA被双酶切为4 697 bp和1 251 bp两条条带,测序结果证实VEGFA序列与GenBank公布的VEGFA mRNA序列完全一致.在经转染的HEK293T细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pEGFP-VEGFA成功转染HEK293T细胞,并在其中得到了表达.结论 成功构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA,为进一步研究VEGFA基因的生物学功能奠定了基础.     

SLPI基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建并鉴定含分泌型白细胞蛋白酶抑制蛋白(SLPI)基因的重组真核表达质粒。方法以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出SLPI基因cDNA,将产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,构建含SLPI基因的重组真核表达质粒。将pcDNA-SLPI重组质粒和空载体pcDNA分别转染HeLa细胞,Western blot检测SLPI蛋白表达。结果核酸序列分析及双酶切鉴定SLPI已成功插入pcDNA3.1(+)载体中,转染pcDNA-SLPI的HeLa细胞中检测到高表达的SLPI蛋白。结论成功构建了含SLPI基因的重组真核表达质粒。     

BRMS1基因在食管鳞癌组织中的表达及意义

目的探讨乳腺癌转移抑制基因(BRMS1)在食管鳞癌组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学技术检测50例食管鳞癌组织和20例癌周正常食管黏膜组织中BRMS1蛋白的表达。结果 BRMS1蛋白在食管鳞癌组阳性率为38.0%(19/50),在癌周正常食管黏膜组织阳性率为90.0%(18/20),两者之间差异有统计学意义(P<0.01),BRMS1蛋白的表达与食管鳞癌患者的性别、年龄及肿瘤的分化程度、浸润深度等指标无相关性(P>0.05),与淋巴结转移相关(P<0.05)。结论通过检测BRMS1蛋白的表达水平可预测食管癌远处转移的可能性,为制定手术和化疗方案提供指导。     

pEGFP-N1-PEDF重组质粒的构建和鉴定

目的：构建 pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒,并进行鉴定。方法利用RT-PCR方法从组织中提取PEDF的基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-PEDF重组质粒,酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。结果本实验成功构建了pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒。结论为进一步研究利用PEDF基因治疗皮肤肿瘤提供实验基础。     

pIRES-IL-24-PTEN双表达载体的构建及鉴定

目的构建携带人IL-24和10号染色体缺失的磷酸脂酶与PTEN双基因的真核表达载体,为研究其表达产物的抑癌机制提供基础。方法通过PCR方法获得PTEN、IL-24基因片段,进行T-A克隆,再酶切亚克隆到pIRES载体,酶切、测序鉴定正确后命名为pIRES-IL-24-PTEN载体。脂质体转染A549细胞,提取细胞的总蛋白,Western blot检测IL-24和PTEN蛋白的表达。结果酶切、测序显示pIRES-IL-24-PTEN载体序列正确,Western blot检测到IL-24和PTEN蛋白表达。结论成功构建pIRES-IL-24-PTEN载体,为后续研究奠定基础。     

组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体的构建和鉴定

目的利用pEGFP-N1真核表达载体构建组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体pEGFP-Hdac3,并鉴定其在大鼠肝癌细胞系CBRH-7919中的表达。方法利用大鼠肝脏cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)获取目的基因Hdac3;用HindⅢ、BamH I双酶切真核表达载体pEGFP-N1和目的基因Hdac3,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。利用测序正确的重组体转染CBRH-7919细胞,检测Hdac3和PPAR-γ的mRNA表达。结果利用基因克隆技术获得组蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3重组质粒。PCR,双酶切,DNA测序证实目的基因H-dac3已成功插入pEGFP载体中。用重组质粒转染大鼠肝癌细胞系CBRH-7919后Hdac3 mRNA表达显著升高、而PPAR-γmRNA表达明显降低。结论本研究成功构建了蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3。     

携带反义MDR1基因的逆转录病毒载体的构建和表达

目的　建立逆转录病毒介导的反义多药耐药MDR1基因转移体系 ,探讨反义RNA封闭白血病耐药细胞中MDR1基因表达的能力。方法　逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)法从白血病耐药细胞株HL 6 0 /VCRmRNA中扩增出含有启始密码子ATG的 5 2 4bp的MDR1基因cDNA片段 ,反向插入逆转录病毒载体 pLXSN ,通过脂质体转和乒乓感染单、双噬型包装细胞GP +E86和GP +envAM 12 ,以双嗜型病毒上清感染白血病耐药细胞K5 6 2 /MDR ,半定量RT PCR和流式细胞术(FCM)分析MDR1基因转录和P 糖蛋白 (P gp)的表达。 结果　酶切、PCR和DNA测序证实反义MDR1基因重组逆转录病毒载体 pLASSN构建正确 ;双嗜型病毒生产细胞的滴度为 1 3× 10 5CFU/ml,巢式PCR和补救分析均未检测到辅助病毒存在 ;PCR和RT PCR分析证实病毒生产细胞和反义修饰的耐药细胞K5 6 2MDR/LASSN中均有反义MDR1基因整合和MDR1基因反义RNA的转录 ;FCM分析K5 6 2MDR/LASSN细胞中P gp表达强度和表达率比对照细胞均有明显下降。 结论　逆转录病毒介导的反义基因转移系统安全有效 ,可用于肿瘤耐药逆转的研究     

人白细胞介素24真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素24(human interleukin-24,hIL-24)真核表达载体,并在HepG2细胞中稳定表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),从植物血凝素活化的人外周血单个核细胞中克隆得到hIL-24基因目的 片段.应用DNA重组技术将IL-24PCR产物双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DHSα获得重组载体,进行PCR、酶切及测序鉴定.应用脂质体将鉴定正确的重组质粒转染至HepG2细胞,用G418筛选稳定转染细胞株.采用RT-PCR检测稳定转染细胞HepG2中IL-24 mRNA的表达.结果 通过RT-PCR获得与预期大小一致约600 bp的IL-24基因片段;重组载体pcDNA3.1(+)-IL-24经PCR、双酶切及测序证实,IL-24 eDNA片段已正确插入真核表达载体中;在稳定转染的HepG2细胞株中可见到IL-24 mRNA表达.结论 成功构建了hIL-24真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24,并获得了稳定转染该重组质粒的HepG2细胞株.     

含绿色荧光蛋白及人胰岛素基因的真核表达载体的构建

目的构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人胰岛素基因的重组真核表达载体。方法将人胰岛素基因插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的EcoRⅠ和BamHⅠ位点中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-INS。酶切鉴定,测序证实。结果重组真核表达载体pIRES2-EGFP-INS经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,电泳后显示360bp的INS的目的片段和5.3kb的pIRES2-EGFP载体片段,进一步测序并证明重组质粒连接正确。结论成功构建了pIRES2-EGFP-INS重组质粒,为简便快速了解胰岛素基因的转染效率奠定了基础。     

HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及鉴定

目的　设计并合成人8 羟基鸟嘌呤 DNA糖苷酶(HOGG1)特异性的锤头状核酶(hammerheadribozyme)基因并构建其真核表达载体。鉴定含有核酶靶基因HOGG1cDNA保守序列的真核表达载体。方法　运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ) ,将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA 3 1中,重组子由BamHI和EcoRI酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。含有HOGG1基因cDNA保守序列的真核表达载体经BamHI和EcoRI酶切电泳鉴定。结果　RZ人工合成后与pcDNA 3 1连接,酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI位点之间,命名为pcDNA 3 1 RZ。1 3kb的HOGG1基因cDNA保守序列准确克隆于pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI酶切位点之间,命名为pcDNA 3 1 HOGG1。结论　成功合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体,以及核酶靶基因的真核表达载体。     

ELK-1 rniRNA干扰质粒构建及鉴定

目的 设计及构建ELK-1微小干扰核糖核酸(miRNA)质粒,最终鉴定出有效干扰质粒.方法 设计及构建4对ELK-1的pcDNATM 6.2-GW/EmGFPmiR miRNA及1对无效对照miRNA干扰质粒,通过测序鉴定.将干扰质粒用脂质体法转染293T细胞,通过顺时转染获得细胞系.通过倒置荧光显微镜下观察绿色荧光确定转染效率,RT-PCR检测4对干扰质粒、阴性对照质粒ELK-1的mRNA的表达水平.结果 测序表明,ELK-1干扰序列及读框完全正确,干扰质粒瞬时转染的293T细胞系在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光达90%以上.RT-PCR结果显示,MR-2、MR-3干扰质粒对ELK-1 mRNA有较好的抑制效果.结论 成功构建了ELK-1干扰真核表达载体,筛选出有效干扰质粒,为进一步研究ELK-1在肿瘤细胞中的作用提供参考.