苏氨酸产生菌原生质体的研究

考察苏氨酸产生菌GSR 8-25的原生质体制备及再生的最佳条件,并用紫外线(uv)诱变处理其原生质体,从再生株中筛选苏氨酸高产菌株。经多次连续诱变处理得一再生株25-20,其苏氨酸产量由出发菌株的15mg/ml提高到21.5mg/ml,提高率达43.3％.     

利用原生质体诱变筛选L-亮氨酸高产菌株的研究

本实验以L-亮氨酸产生菌黄色短杆菌CF-435为出发菌株,制备原生质体,在原生质体形成率和再生率最佳的条件下,利用紫外线、利福平、氯化锂对原生质体进行复合处理,获得再生突变株,从中挑取单独菌落进行摇瓶发酵,筛选出高产菌株UV_3-29,在含有葡萄糖10%的培养基中发酵72h可积累L-亮氨酸26.73mg/ml,比原始菌种产酸量提高26%.     

利用原生质体诱变筛选L-异亮氨酸高产菌株

在捧杆菌原生质体制备中,以单一甘氨酸代替青霉素与溶菌酶进行细胞脱壁处理,以含0.3M蔗糖的普通肉汤培养基作为再生培养基。L-异亮氨酸产生菌A6在肉汤中培养至对数期,加入0.3M蔗糖和3%甘氨酸,继续培养8h,原生质体的形成率达98%。原生质体经洗涤后的再生率为81.6%,不经离心洗涤直接涂皿的再生率为81.2%。A6菌株的原生质体经紫外线诱变处理后,再生菌株的L-异亮氨酸产量高达14.3mg/ml,比原菌株产量提高30%左右。     

利用原生质体诱变筛选L—异亮氨酸高产菌株

在棒杆菌原生质体制备中,以单一甘氨酸代替青霉素与溶菌酶进行细胞脱壁处理,以含0.3M蔗糖的普通肉汤培养基作为再生培养基,L-异亮氨酸产生菌A6在肉汤中培养至对数期,加入0.3M蔗糖和3%甘氨酸,继续培养8h,原生质体的形成率达98%,原生质体经洗涤后的再生率为81.6%,不经离心直接涂皿的再生率为81.2%.A6菌株的原生质体经紫外线诱变处理后,再生菌株在L-异亮氨酸产量高达14.3mg/ml,比原菌株产量提高30%左右。     

利用亚硝酸诱变原生质体筛选L—亮氨酸高产菌株的研究

本实验以Ｌ－亮氨酸产生菌黄色短杆菌ＣＦＮ－１９为出发菌株。我们首先对ＣＦＮ－１９菌株制备原生质体，原生质体制备率为９５．１％，再生率为２５％，然后对原生质体进行亚硝酸、利福平、氯化锂复合诱变处理，从再生菌株中筛选出一株高产菌株Ｈ６－６６，产酸量由原来的２３．１ｍｇ／ｍｌ提高到３２．６ｍｇ／ｍｌ，提高率达４１％。同时又对Ｈ６－６６菌株进行遗传稳定性考察，考察结果Ｈ６－６６菌株是高产稳定菌株。     

抗炎化合物EP产生菌的原生质体制备和再生工艺研究

目的系统研究 6 ,2 2 二烯 5 ,8 过氧麦角甾 3 醇 (EP)产生菌粘帚霉属真菌F菌的原生质体制备、分离与再生的条件。方法通过研究不同的酶解系统、酶解时间、再生培养基等多种因素 ,考察它们对该菌原生质体得率及再生率的影响 ;同时 ,采用高效液相色谱法测定原生质体再生菌株中EP化合物的含量。结果F菌菌龄为 6 0h时 ,以 0 .5mol/L的甘露醇配制成 2 %的蜗牛酶和纤维素酶混合溶液 ,2 8℃酶解 4h ,原生质体得量较高。而以0 .5mol/L的甘露醇为稳渗剂的再生培养基时 ,该菌的原生质体再生率较高。结论从代谢产物的角度对该菌原生质体制备和再生方法的可行性进行分析 ,并探讨此过程对F菌生物合成EP的影响 ,为进一步对该菌的分子遗传及高产菌株的选育创造条件。     

刺糖多孢菌原生质体制备与再生条件优化

目的研究多杀菌素产生菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)原生质体制备与再生的最佳条件。方法利用数理统计的方法研究了不同制备培养基、菌龄、甘氨酸浓度、溶菌酶处理条件以及再生培养基对原生质体制备和再生的影响,并考察了原生质体的适宜保藏温度。结果菌体在添加0.3%甘氨酸的EHC培养基中培养72h,用2mg/mL溶菌酶32℃酶解40min后,涂布在再生培养基R6上再生,原生质体制备率超过99%,再生数可达到107cfu/mL。刺糖多孢菌原生质体可置于4℃短期保存72h,长期保存需要放置于-80℃条件下。结论优化的结果为刺糖多孢菌原生质体融合育种和遗传转化体系建立奠定了基础。     

原生质体诱变选育阿霉素高产菌株及发酵产品质量的初步分析

目的 利用原生质体诱变方法从一株链霉菌原始菌株Streptomyces sp.H-323 (CGMCC 4827)选育阿霉素高产突变菌株,以提高阿霉素的发酵单位,并对发酵产品的质量进行了初步研究.方法 通过研究不同甘氨酸浓度、溶菌酶酶解时间、酶解温度、酶浓度对H-323原生质体形成的影响,确定了原生质体的最佳制备和再生条件.通过阿霉素抗性选育,诱变原生质体筛选阿霉素高产突变菌株.最后通过高效液相、核磁等波谱分析法初步确定发酵法生产的阿霉素产品的质量.结果 制备Streptomyces sp.H-323原生质体的最佳条件:种子培养基中甘氨酸浓度0.5％、溶菌酶浓度3mg/mL、酶解时间60min、酶解温度30℃.通过原生质体诱变结合阿霉素抗性选育,得到一株高产突变株,阿霉素发酵单位由出发菌株的300mg/L提高到700mg/L.通过波谱分析,发酵产物达到国外注册标准.结论 通过原生质体诱变和抗性选育大大提高了阿霉素的产量,为高产阿霉素产业化提供方法支持.     

利用原生质体诱变筛选L-亮氨酸产生菌

L-异亮氨酸产生菌钝齿棒状杆菌AS110可产L-异亮氨酸16.4mg/ml,不产生L-亮氨酸。在菌株AS110制备成原生质体再生后,结果发现90%以上的再生菌株可以产生L-亮氨酸。用紫外线诱变处理AS110的原生质体,从再生菌株中筛选出一株L-亮氨酸产生菌AS150,经分离纯化后,可产L-亮氨酸16.4mg/ml,并且不产L-异亮氨酸。     

东方拟无枝酸菌DNA转化系统的建立

对东方拟无枝酸菌HCCB10007原生质体制备和再生条件进行了探索,结果表明以含2%甘氨酸的TSB培养基培养菌丝体,28℃经1mg/ml溶菌酶处理30min,形成的原生质体约达107个/ml,原生质体再生率为2.5%.将来源于HCCB10007的gtfE基因通过安普霉素抗性基因插入失活,构建质粒pLY26并经PEG介导转化HCCB10007原生质体,PCR鉴定结果表明转化成功.     

Liquid culture enhances protoplast formation from the auxotroph (ser−) ofLentinula edodes

The optimal conditions for the production and regeneration of the protoplasts fromLentinula edodes were studied. Protoplast formation from the mycelia ofL. edodes which were cultured in liquid medium showed a significantly high yield compared with that of the mycelia which were cultured on cellophane covered agar media. A mixture of Novozyme 234 (15 mg/ml) and Cellulase Onozuka R10 (10 mg/ml) in 0.6 M mannitol (pH 4) was optimal lytic enzyme for the protoplast release. The optimal incubation time and mycelia age were 3.5-4 hours at 30 degrees C and 6-8 days, respectively. Regeneration frequency was 0.18% plated onto a medium containing 0.6 M sucrose, and 0.08% plated onto a medium containing mannitol. But hardly any regeneration was observed in the media containing NaCl, KCl, or MgSO(4). More than 90% of the protoplasts contianed nuclei and the nucleus number per protoplast was 1.1. The DNA content per nucleus was 5.1 pg. The diameter of the protoplast was 3-5 mum and it had a well defined cell structure.     

L-亮氨酸、L-异亮氨酸生物合成调节机制的初步研究

本文比较了黄色短杆菌(Brevibacteriurn flavum)T6-13及其积累异亮氨酸突变株AS110,积累亮氨酸突变株S-23的苏氨酸脱氨酶(TDase)、乙酰乳酸合成酶(AHAase)和转氨酶(TAase)的相对活性及其受各种支链氨基酸反馈调节的程度。在S-23菌株内,AHAase活力增加并受支链氨基酸反馈调节程度减弱,同时TDase活力降低,导致S-23菌株大量积累亮氨酸,不积累异亮氨酸。在AS110菌株内,AHAase和TDase活力增强,并受支链氨基酸反馈调节能力降低,导致AS110菌株大量积累异亮氨酸。据此实验,初步探讨了亮氨酸、异亮氨酸生物合成调节机制。     

硫化氢下调大鼠主动脉L-精氨酸/一氧化氮合酶/一氧化氮通路

目的观察H2S对血管L-精氨酸/一氧化氮(L-Arg/NO)通路的影响以探讨H2S和NO这两种气体信号分子间的相互作用。方法离体孵育大鼠主动脉薄片,加入H2S供体NaHS(10-7~10-4mol.L-1)孵育4 h,及50μmol.L-1NaHS分别孵育2、4和6 h。采用G re iss法测定血管亚硝酸盐含量;同位素示踪法检测血管组织一氧化氮合酶(NOS)活性及L-Arg转运,RT-PCR检测eNOS、CAT1基因表达。结果一次性给予50μmol.L-1NaHS,孵育2 h,孵育液中NO2-含量比对照组低62%,血管NOS活性下降48%,L-Arg转运减少50%(P<0.01);孵育6 h,NO2-含量比对照组低19%(P<0.05),而NOS活性和L-Arg转运已基本恢复(P>0.05)。NaHS(10-7~10-4mol.L-1),呈浓度依赖的抑制了L-Arg/NOS/NO通路,IC50分别为0.499、3.198及3.927μmol.L-1(P<0.01);而给予50μmol.L-1NaHS后,eNOS和CAT-1A的mRNA表达分别减少34.3%和55.1%(P<0.01)。结论H2S通过抑制血管组织L-Arg转运和NOS活性和基因表达,下调L-Arg/NOS/NO通路,从而减少血管NO生成。     

顶头孢霉229与12的分生孢子及原生质体的形成和再生

头孢菌素产生菌顶头孢霉菌株229的沉没培养或斜面培养都可形成分生孢子,并可用普通滤纸将它们与菌丝及节孢子分开,但是它们成活率极低.这种成活的分生孢子的数量与培养基成分有关.菌丝培养基成分对制备顶头孢霉原生质体有显著影响.用一种MM培养基培养的菌丝,不经巯基化合物预处理,酶解(1%纤维素酶)3小时后,可得到大量原生质体.原生质体的再生频率为1.8～4.6%.与分生孢子形成的菌落相比,原生质体再生菌落的产抗生素能力显示出较大的变异性.本文还讨论了山梨醇与Nikkomycin对菌丝生长形态及原生质体形成的影响.     

In vivo activity of gemifloxacin, moxifloxacin and levofloxacin against pneumococci with gyrA and parC point mutations in a sepsis mouse model measured with the all or nothing mortality end-point

A dose-decreasing immunocompetent sepsis mouse model was used to evaluate the in vivo effect of levofloxacin, moxifloxacin and gemifloxacin, using a ciprofloxacin/levofloxacin susceptible serotype 6B strain (ciprofloxacin MIC: 1 mg/l) and two resistant serotype 14 and 19F strains with gyrA and parC point mutations (ciprofloxacin MICs of 32 and 64 mg/l, respectively). Significant higher in vivo activity was found for moxifloxacin and gemifloxacin than for levofloxacin against strains 1 and 2, and for gemifloxacin versus moxifloxacin or levofloxacin against strain 3. Gemifloxacin treatment resulted in 100% survival against strains 1 and 2(AUC0-24 h/MIC of 30 and 62) but against strain 3, survival was 60-80% (AUC0-24 h/MIC of 93). Similar AUC0-24 h/MIC values produced different therapeutic results suggesting that in vitro parameters other than the MIC could influence efficacy predictions based on in vitro susceptibility tests (MICs) or pharmacodynamic parameters (AUC0-24 h/MIC).     

原生质体ARTP诱变选育阿维拉霉素高产菌株

目的 筛选获得阿维拉霉素A含量高的菌株,进一步提高绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogene)发酵阿维拉霉素的水平。方法 对绿色产色链霉菌AVL4(S. viridochromogene AVL4)菌株原生质体制备及再生条件进行了优化,并在此基础上,采用ARTP诱变系统对其原生质体进行了诱变研究。结果 S. viridochromogene AVL4原生质体制备和再生的最佳条件为：以活化斜面转接至种子摇瓶培养24h的菌丝体为出发菌丝体,以SMM溶液作为渗透压稳定剂,采用12mg/mL的溶壁酶,30℃酶解反应60min。以原生质体为诱变对象,ARTP处理40s后的菌株经菌落形态初筛和摇瓶发酵复筛,获得一株编号S251的菌株,其摇瓶发酵阿维拉霉素的生物效价较出发菌株提高19.3%,其中,阿维拉霉素A占组分含量81%,较原始出发菌株AVL4含量提高6.4%,而且斜面连续转接五代遗传相对稳定。另外,成功实现变株S251的50L罐发酵验证,其产素水平最高达到4500U/mL,较对照菌株AVL4提高27.4%。结论 ARTP处理AVL4菌株原生质体,能够有效提高绿色产色链霉菌产阿维拉霉素的能力,获得的变株S251具有非常好的生产阿维拉霉素的工业化应用潜力。