蚊抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系的建立与表达鉴定

目的 建立抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系。方法 采用PCR方法，以淡色库蚊抗药性品系CD-NA文库为模板，扩增出抗药性品系高表达的糜蛋白酶基因编码区；经T／A克隆测序鉴定后，亚克隆到真核表达载体piEl-3，构建重组昆虫细胞表达载体piEl-3／chy，经酶切和PCR鉴定后，与带有筛选标记的piEl-neo质粒共转染蚊细胞C6／36，通过G418选择培养，建立转染细胞系；用RT-PCR、Westernblotting鉴定糜蛋白酶基因的转录表达。结果 成功构建了真核表达载体piE1-3／chy，证明糜蛋白酶基因已转入C6／36细胞，建立了稳定转染细胞系，表达产物分子质量单位约30ku，与理论值相符。结论 稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究糜蛋白酶基因与抗药性的关系奠定了基础。     

淡色库蚊抗药性相关胰蛋白酶基因稳定转染细胞系的建立与表达鉴定

目的为进一步研究胰蛋白酶基因与抗药性的关系。方法采用PCR方法,以淡色库蚊抗性品系cDNA文库为模板,扩增出抗药性品系高表达的胰蛋白酶(trypsin)基因编码区。T/A克隆测序鉴定后,亚克隆到昆虫细胞表达载体pIE13,构建重组昆虫细胞表达载体pIE13/try。经酶切和PCR鉴定后,与带有筛选标记的pIE1neo质粒共转染蚊虫细胞C6/36,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞。用RTPCR、Westernblotting鉴定胰蛋白酶基因的转录表达。结果酶切和PCR鉴定表明,成功构建昆虫细胞表达载体pIE13/try;证实胰蛋白酶基因已转入C6/36细胞,并建立稳定转染细胞系,成功地表达目的基因。结论稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究胰蛋白酶与抗药性的关系提供了良好的实验基础。     

蚊抗药性相关糜蛋白酶基因表达、纯化及活性分析

目的表达、纯化淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关糜蛋白酶（NYD-Ch）基因并进行酶活性分析。方法应用PCR和基因重组技术，构建原核表达载体，表达目的蛋白；用酶促底物法测定表达蛋白NYDCh的酶学活性和最适pH值。结果成功构建重组表达载体pET32a（＋）／NYD-Ch，并转化到感受态菌E．coli BL21（DE3）中。SDS-PAGE和Western blot显示，目的蛋白分子质量与理论值相符。NYD-Ch最大活力通过S（Ala）2ProPhe-pNA获得。NYD-Ch活力随pH的增高而增大，在pH8．01～11．0的范围内较高，pH10．0时达最高。抑制剂PMSF、SBTI、TPCK对NYD-Ch酶活力均有明显的抑制作用。结论成功表达了NYD-Ch蛋白，并分析了其酶学活性。本结果为深入研究NYD-Ch与杀虫剂抗性关系奠定基础。     

KAI1基因转染的胰腺癌细胞系的建立

目的转染pCMV—KAI1重组质粒入人胰腺癌细胞株MiaPacaⅡ和Panc1，观察KAⅡ基因的表达，为进行KAI1基因在胰腺癌中抗转移作用的有关研究提供实验用靶细胞，并为今后利用KAI1基因治疗胰腺癌提供实验和理论依据。方法采用Western blot方法从7种胰腺癌细胞中筛选出无KAI1表达的MiaPacaⅡ和Panc1细胞株，通过脂质体转染法将pCMV—KAI1重组质粒转染到MiaPacaⅡ和Panc1中，经G418筛选4周，获得单克隆细胞系，应用Western blot、免疫荧光及免疫细胞化学方法检测转染细胞系KAI1蛋白的表达。结果获得了稳定表达KAI1基因的MiaPacaⅡ和Panc1胰腺癌细胞克隆；经Western blot分析显示转染后的胰腺癌细胞株MiaPacaⅡ与Panc1有明确的分子质量为29100KAI1蛋白表达，而未转染细胞无KAI1蛋白表达；免疫荧光显示，转染的胰腺癌细胞质中可见明显的荧光，而无转染的母细胞无荧光；免疫细胞化学检测显示，无转染的细胞呈阴性反应，转染的细胞呈中到强度的阳性反应。结论pCMV—KAI1重组质粒经转染人人胰腺癌细胞株MiaPacaⅡ和Panc1后可表达KAI1蛋白，从而建立了KAIl蛋白表达的MiaPacaⅡ和Panc1细胞系。     

淡色库蚊抗药性相关基因NYD-Ch和NYD-Tr的表达与初步鉴定

目的　淡色库蚊抗药性相关基因NYD Ch(糜蛋白酶 )和NYD Tr(胰蛋白酶 )表达与鉴定。　方法　以淡色库蚊抗性品系全长cDNA文库为模板 ,采用PCR方法扩增出抗性品系中高表达的NYD Ch和NYD Tr基因 ,经T/A克隆测序鉴定 ,将扩增产物用NotI、EcoRI双酶切后作为插入片段 ,与具有相同粘性末端的融合表达质粒 pET 2 8a(+ )连接 ,转化入表达菌株E .coliBL2 1中 ,取含重组表达质粒的重组菌株以IPTG进行诱导表达 ,表达产物以SDS PAGE电泳和小鼠抗NYD Ch和NYD Tr抗血清进行Westernblot分析鉴定。　结果　NYD Ch和NYD Tr基因开读框大小分别为816bp和 786bp ,预计可分别编码 2 72个和 2 62个氨基酸。对应分子质量大小分别为 2 9.4ku和 2 8ku ,加上pET 2 8a(+ )载体融合部分氨基酸 ,表达产物条带应在 3 3ku附近 ,与SDS PAGE蛋白电泳胶上蛋白条带一致。Westernblot分析确认诱导后的 pET 2 8a(+ ) /NYD Ch和 pET 2 8a(+ ) /NYD Tr在分子质量约 3 3ku处出现 1条与小鼠抗NYD Ch和NYD Tr抗血清特异反应的条带。　结论　NYD Ch和NYD Tr基因在大肠杆菌中获得表达 ,Westernblot分析表明该蛋白为目的蛋白。     

人肥大细胞类糜蛋白酶分泌型真核表达载体的构建

目的构建人肥大细胞类糜蛋白酶（MC—Chy）分泌型真核表达载体。方法以MC-Chy基因的质粒pDEST17／CMA为模板,通过PCR扩增出融合有免疫球蛋白K链信号肽的人MC—Chy基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA3．1,通过PCR、酶切和DNA测序鉴定。结果PCR扩增出免疫球蛋白K链融合人MC-Chy基因,DNA序列测定结果显示目的基因片段正确插入真核表达载体pcDNA3．1。结论成功构建了人MC-Chy分泌型真核表达载体,为下一步重组类糜蛋白酶的制备及其功能的深入研究奠定了基础。     

丙型肝炎病毒CTL表位基因真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的构建含丙型肝炎病毒（HCV）复合多表位基因的真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染细胞系。方法通过生物信息学预测分析的方法得到涵盖HCV不同基因型与小鼠H2复合体的多个细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位,串联后人工合成基因序列,将其克隆入真核表达载体pEGFP-N3中,然后利用脂质体法转染CHO细胞,通过持续G418筛选建立稳定转染细胞株。最后通过荧光显微镜观察、RT-PCR和Western Blot等方法证实多表位基因的表达。结果所构建的含有HCV复合多表位基因的真核表达载体pEGFP-mEpi在CHO细胞中能稳定表达。结论真核表达载体的成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究复合多表位疫苗的基因免疫奠定了基础。     

逆转录病毒介导的靶向人Slingshot-1L基因的稳定转染细胞系的建立

目的 应用 Slingshot(SSH)-1L重组逆转录病毒载体,建立过表达该基因的稳定转染细胞系.方法 用脂质体法将含SSH-1L的重组逆转录病毒载体pLNCX-SSH-1L转染PA317包装细胞,G418筛选,滴度测定.收集病毒上清感染MG63细胞,G418筛选.结果 应用 pLNCX-Slingshot-1L重组逆转录病毒载体,获得滴度为5×10~8 CFU /L的病毒上清,感染MG63细胞,获得了过表达SSH-1L基因的MG63细胞.结论 应用SSH-1L重组逆转录病毒载体,成功建立了过表达该基因的稳定细胞系.     

胱抑素C基因真核表达载体的构建及在转染的人主动脉平滑肌细胞中的表达

目的克隆人胱抑素C基因及构建胱抑素C基因真核表达载体并研究其在人血管平滑肌细胞中的表达。方法培养人脐静脉内皮细胞系,并从中提取总RNA,采用逆转录聚合酶链反应扩增胱抑素C基因,构建其真核表达载体,双酶切及聚合酶链反应鉴定阳性克隆,转染人血管平滑肌细胞,逆转录聚合酶链反应及Western blot法检测其表达情况。结果成功克隆人胱抑素C基因及构建其真核表达载体,转染后成功高表达。结论克隆人胱抑素C基因及构建其真核表达载体成功,转染人血管平滑肌细胞获得其高表达。     

白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段的克隆及其作为基因表达内参照的应用

目的获取白纹伊蚊β-肌动蛋白基因序列并探讨其作为基因表达内参照的作用。方法根据昆虫β-肌动蛋白核苷酸序列的高度保守区设计引物,通过PCR的方法从白纹伊蚊C6/36细胞中扩增获得白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段,进一步通过RT-PCR的方法验证其在稳定转染空载体和40S核糖体蛋白S4(RPS4)基因的白纹伊蚊C6/36细胞中的表达。结果获得白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段,长911 bp,与其他几种蚊β-肌动蛋白基因对应序列的相似性在89%以上。在稳定转染空载体和RPS4基因的C6/36细胞中,均可稳定地扩增出目的基因。结论成功获得了白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段,并且该片段完全可以用作基因表达差异分析时的内参照基因。     

尖音库蚊淡色亚种细胞系的建立和特征

用尖音库蚊淡色亚种(Culer pipiens pallens)新孵Ⅰ龄幼虫建成蚊细胞系Cpp512.取蚊卵消毒,孵出幼虫,剪成碎片,接种于含15％FBS的改良TC199培养基中,2周左右由幼虫组织长出的细胞形成单层。现已传至53代。细胞形态以梭形为主。细胞对数期群体倍增时间(PDT)为21h。BrdU掺入法测得细胞周期时间为18h。透射电镜检查未见病毒或支原体污染。染色体检查以二倍体核型为主,多倍体亦存在。     

对溴氰菊酯抗性和敏感淡色库蚊不同发育阶段的抗性水平

对室内选育的淡色库蚊（对溴氰菊酯抗性品系和敏感品系）用浸渍法测定了Ⅱ龄、Ⅲ龄和Ⅳ龄幼虫，用接触筒法测定了早期、中期和晚期成虫；并观察了增效醚（ＰＢ）、磷酸三苯酯（ＴＰＰ）和杀虫脒与溴氰菊酯混用后的增效效果。结果表明：（１）淡色库蚊各发育阶段对溴氰菊酯的抗性水平，在敏感品系由高至低依次为中期、晚期、早期成虫、Ⅳ龄、Ⅲ龄和Ⅱ龄幼虫；在抗性品系则为早期、中期、晚期成虫、Ⅳ龄、Ⅲ龄和Ⅱ龄幼虫。（２）ＰＢ和杀虫脒均有明显增效作用，提示抗性可能与氧化代谢增强和靶标部位不敏感有关。其中似乎幼虫阶段以氧化代谢增强为主要抗性机制；在成虫阶段，氧化代谢增强和靶标部位不敏感性均在抗性中起重要作用     

淡色库蚊对溴氰菊酸抗药性品系cDNA表达文库的构建和初步鉴定

目的构建淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性品系cDNA表达文库.方法应用定向克隆技术将相应cDNA片段插入λExCell/NotⅠ/EcoRⅠ/CIP载体的NotⅠ和EcoRⅠ双酶切位点;并用PCR对插入片段大小进行分析.结果获得含4.72×105个重组子的cDNA表达文库,重组率为100%,插入片段大小平均约1.1kb.结论所建文库容量及插入片段大小适合进一步研究.     

淡色库蚊细胞色素P450抗性相关基因克隆与初步鉴定

[目的 ]探讨淡色库蚊细胞色素P45 0与溴氰菊酯抗药性的关系。 [方法 ]采用一对昆虫细胞色素P45 0简并引物 ,以反转录 聚合酶链反应从淡色库蚊扩增特异片段 ,T/A直接克隆法筛选阳性克隆 ,对新序列进行cDNA芯片和逆Northern分析。 [结果 ]从淡色库蚊对溴氰菊酯敏感品系和抗性品系获得 112个阳性克隆 ,其中 2 4个阳性克隆测序后显示为细胞色素P45 0新序列 ,由GenBank登录上网 ;经国际细胞色素P45 0命名委员会鉴定分别属CYP4家族CYP4C、CYP4D、CYP4H和CYP4J等 4个亚家族 ;2 4个CYP4cDNA片段中 ,来自敏感品系的 2个片段(NYDS3和NYDS5 )和来自抗性品系的 4个片段 (NYDR6、NYDR9、NYDR15和NYDR17)在两品系间存在差别 ,cDNA芯片信号亮度值均是抗性品系大于敏感品系 ,倍数在 3 .1～ 9.7范围内 ;NYDR17仅与抗性探针杂交 ;逆Northern再鉴定 ,获得了与cDNA芯片一致的结果。 [结论 ]淡色库蚊CYP4与溴氰菊酯抗性相关 ;在淡色库蚊溴氰菊酯抗性机理中 ,可能存在P45 0基因点突变而导致的特异表达。     

溴氰菊酯和倍硫磷混用、轮用对淡色库蚊抗性发展的影响

目的　观察杀虫剂不同用药方式对淡色库蚊抗性发展的影响。方法　以淡色库蚊（Culex pipiens pallens）为试虫,用溴氰菊酯和倍硫磷混剂和单剂隔代轮用进行抗性选育,以溴氰菊酯和倍硫磷单剂作为对照。结果　淡色库蚊经16代处理,其抗性系数在溴氰菊酯和倍硫磷混用为14.65;两者轮用为17.74（溴氰菊酯）和2.77（倍硫磷）;单剂连用则分别为729.08和24.73。结论　两种作用机制不同的杀虫剂混用或轮用均能延缓害虫对杀虫剂抗性的发展。     

恶性疟原FCC-1 HN株EBA-175和HRP-II基因片段在HeLa细胞中的表达及鉴定

目的　在 Ｈｅ Ｌａ 细胞中表达恶性疟原虫红细胞结合蛋白 Ｅ Ｂ Ａ－ １７５ 和富组氨酸蛋白 Ｈ Ｒ Ｐ－ Ｉ Ｉ, 进一步研究其生物学功能和免疫学特性。方法　将 Ｅ Ｂ Ａ－ １７５ 和 Ｈ Ｒ Ｐ－ Ｉ Ｉ 部分基因串接插入 Ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ３ 真核表达载体, 获得重组表达质粒 Ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ３ Ｅ Ｂ Ａ１７５ － Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ。采用磷酸钙－ Ｄ Ｎ Ａ 共沉淀法将重组质粒转染 Ｈｅ Ｌａ 细胞进行体外表达, 对表达产物进行 Ｓ Ｄ Ｓ－ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ、 Ｄｏｔ－ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎ － ｂｌｏｔ 鉴定。结果　表达产物占表达蛋白总量的１６４ ％ , 相对分子量与预设计的４８ｋ Ｄａ 基本相符。表达产物与鼠抗恶性疟原虫血清及构建的重组质粒免疫鼠血清产生特异免疫反应。结论　表达载体 Ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ３ 在 Ｈｅ Ｌａ 细胞内可表达出具有一定免疫学活性的恶性疟原虫重组抗原蛋白。     

恶性疟原虫环子孢子蛋白基因在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法特异性扩增恶性疟原虫云南株（ＰＦＤ－３／ＹＮ）环子孢子蛋白基因片段,经基因序列测定后克隆于ｐＷＲ４５０－１融合蛋白表达载体,并转化大肠杆菌ＴＧ１、ＪＭ１０３及ＪＭ１０９。在不同菌体浓度及不同剂量ＩＰＴＧ诱导下检测ＣＳＰ融合蛋白的表达,结果显示仅ｐＷＲ－ＣＳＰ／ＴＧ１工程菌在菌体浓度ＯＤ５９０值达０．７～０．８时,加入终浓度１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ进行诱导,可表达一８８ｋＤａ的融合蛋白。ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明ＣＳ蛋白表达产物能被抗ＣＳ蛋白重复区单克隆抗体所识别     

华支睾吸虫mGST新基因的克隆、表达与纯化

目的扩增华支睾吸虫一个微粒体谷胱甘肽转移酶(mGST)新基因,明确是否存在内含子,并进行原核表达与纯化. 方法用PCR方法分别从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库和基因组DNA中扩增mGST基因并测序,将编码基因定向克隆到原核表达载体pET-30a(+),在大肠埃希菌BL21/DE3中表达,按照Ni-NTA agarose说明书纯化重组蛋白,用SDS-PAGE和TLC分析. 结果 mGST基因全长486 bp,没有内含子,构建的原核表达质粒pET-30a(+)-mGST在大肠埃希菌中得到了有效表达,融合蛋白的分子质量单位约为24 ku.重组蛋白达细菌总蛋白质的11%,纯化后的重组蛋白纯度为83%. 结论 mGST基因没有内含子,在大肠埃希菌中能有效表达,得到了纯化的重组蛋白,为进一步研究其功能奠定了基础.