中国人视黄醇结合蛋白cDNA的克隆与序列分析

目的：　为了进行中国人视黄醇结合蛋白（ｈｕｍ ａｎ ｒｅｔｉｎｏｌ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏ－ｔｅｉｎ, ｈＲＢＰ）的原核表达,克隆出ｈＲＢＰ的ｃＤＮＡ。　方法：　利用反转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法获得ｈＲＢＰ的ｃＤＮＡ,克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体后,在美国ＡＢＩＤＮＡ 自动测序仪上以双脱氧法进行核苷酸序列测定。结果：　扩增出了约０．５８ｋｂ的特异片段,并筛选出阳性重组克隆质粒ｐＧＥＭ－ＲＢＰ,核苷酸序列测定表明其含有一段５８０ 个碱基的插入片段,与文献报道的一致。结论：　我们已获得了中国人ＲＢＰ的ｃＤＮＡ,可用于进行原核表达。     

EB病毒转化的永生性人B淋巴母细胞中的MTHFR基因的表达

为检测用ＥＢ病毒转化建立的永生性人Ｂ淋巴细胞株中Ｎ＾５,Ｎ＾１０－亚甲基甲氢叶酸还原酶（ＭＴＨＦＲ）基因的表达及其ｃＤＮＡ序列,用ＥＢ病毒转化人外周血Ｂ淋巴细胞,建立永生性细胞株后,从培养细胞中提取总ＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＭＴＨＦＲ基因ｃＤＮＡ的不同片段,进行ＰＡＧＥ电泳分析和ｃＤＮＡ序列测定。结果显示永生性人Ｂ淋巴母细胞中有ＭＴＨＦＲ基因表达,其ｃＤＮＡ序列与文献报道的人肝脏ＭＴＡＨＦＲ基     

1999年上半年境外医疗器械产品注册情况(一)

序号产品名称生产厂国家注册号１气腹机ＷＩＳＡＰＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴＦＵＲＷＩＳＳＥＮＳＣＨＡＦＴＬＩＣＨＥＮＡＰＰＡＲＡＴＥＢＡＵＭＢＨ德国９９－０００１２心电电极ＭＳＢ（Ｓ－Ｅ－Ａｓｉａ）Ｌｔｄ．新加坡９９－０００２３外科手术电极ＭＳＢ（Ｓ－Ｅ－Ａｓｉａ）Ｌｔｄ．新加坡９９－０００３４ＣＵＢＡＣｌｉｎｉｃａｌ超声骨密度仪ＭｃＣｕｅＰｌｃ英国９９－０００４５超乳玻切系统ＧｅｕｄｅｒＧｍｂＨ德国９９－０００５６听觉诱发电位系统ＩＣＳＭｅｄｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ美国９９－０００６７眼震电…     

CPB-ST融合基因的构建及表达研究

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ双酶切含有大肠杆菌耐热性肠毒素ＳＴ１前体蛋白基因的质粒ｐＸＳＴ１，回收３２５ｂｐ的ＳＴ基因片段，然后，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶将其定向连接于事先经同样的双酶切处理的带有产气荚膜梭菌β－毒素基因（ＣＰＢ）的重组质粒ｐＥＣＢ２中ＣＰＢ基因的下降，转化受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶切反应鉴定重组质粒，得到了理想重组质粒ｐＥＣＢ－ＳＴ１。重组菌株Ｂｌ２１（ＤＥ３）（ｐＥＣＢ－ＳＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后，其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ及ＥＬＩＳＡ检测，结果表明重组菌株可以表达ＣＰＢ－ＳＴ融合蛋白，而且该融合蛋白无天然β－毒素和ＳＴ１的生物毒性。     

杂色曲霉素单克隆抗体的研制与特性鉴定

杂色曲霉素（ＳＴ）衍生后偶联到牛血清白蛋白（ＢＳＡ）或血蓝蛋白（Ｈ）上，制得复合抗原ＢＳＡ－ＳＴ和Ｈ－ＳＴ。将ＢＳＡ－ＳＴ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，取脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合。筛选到一株稳定分泌抗ＳＴ抗体的单克隆杂交瘤细胞株，该株细胞诱导的小鼠腹水及血清中均富含抗ＳＴ单克隆抗体（ＭｃＡｂ－ＳＴ）。经鉴定，ＭｃＡｂ－ＳＴ属于ＩｇＧ＿１，与Ｈ－ＳＴ反应之亲和力常数为１．２９ｘ１０￣９Ｌ／ｍｏｌ，其分子量为１６８０００（重链５３０００，轻链３１０００）。ＭｃＡｂ－ＳＴ的结构类似物的相对交叉反应下超过２％。应用ＭｃＡｂ－ＳＴ及Ｈ－ＳＴ建立的ＩＣ一ＥＬＩＳＡ法测定ＳＴ的线性范围是０．１～１０ｎｇ／ｍｌ，最低检测量是０．５ｐｇ／　２５μｌ，为快速检测粮食中ＳＴ提供厂重要手段。     

对氧磷单克隆抗体的研制及鉴定

重氮化法使对氧磷（Ｅ６００）与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、血蓝蛋白偶合合成人工抗原。用人工抗原Ｅ６００－ ＢＳＡ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,然后将ＳＰ２／０小鼠骨髓瘤细胞和Ｅ６００－ ＢＳＡ免疫的Ｂａｌｂ／ｃ小鼠脾脏细胞融合,成功的建立了能分泌抗对氧磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株。并分析了该细胞株的染色体及对其产生的单克隆抗体的类型、特异性、亲和力进行了鉴定和检测。上述杂交瘤细胞连续传代或冻存１０周,其分泌抗体水平稳定     

N-端融合蛋白对重组HBeAg抗原性的影响

目的　研究 Ｎ－ 末端融合蛋白对大肠杆菌中表达的 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 抗原性的影响。方法　用 Ｐ Ｃ Ｒ 法,从抗－ Ｈ Ｂｃ（ ＋ ） 血清标本中获得 Ｈ Ｂ Ｖ Ｐｒｅ ｃ － ｃ 基因片段,将其插入质粒 Ｔｒｃ９９ Ａ,重组成亚克隆 Ｐ Ｈ Ｂ Ｉ。以 Ｐ Ｈ Ｂ Ｉ为模板,扩增获得编码乙肝病毒核心蛋白１ ～１４０ 氨基酸的基因片段,加上终止信号,分别插入质粒ｐ Ｇ Ｅ Ｘ－ ２ Ｔ 和 Ｔｒｃ９９ Ａ 中,各自转化后,以 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导,大肠杆菌表达插入基因。以 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 和 Ｓ Ｄ Ｓ－ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 方法测定表达产物的分子量和 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 、 Ｈ Ｂｃ Ａｇ 滴度。结果　在 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导下,大肠杆菌中分别表达 Ｎ－ 端融合的 Ｇ Ｓ Ｔ－ Ｈ Ｂｅ Ａｇ 融合蛋白和非融合 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 蛋白。分子量各为４１０００ Ｄ 和１５０００ Ｄ。培养裂解物经 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 测定,融合蛋白 Ｈ Ｂｅ Ａｇ ： Ｈ Ｂｃ Ａｇ 的滴度比为２５６ ：１ ,非融合蛋白为１６ ：１ 。结论　 Ｎ－ 端融合蛋白 Ｇ Ｓ Ｔ－ Ｈ Ｂｅ Ａｇ 抗原性更接近血清 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 。     

简易检测DNA链间交联的方法

单细胞凝胶电泳（ＳＣＧＥ）又称彗星实验（ｃｏｍｅｔａｓａｙ），是一种较碱解螺旋法更加敏感的检测ＤＮＡ损伤的技术。目前ＳＣＧＥ多用于检测ＤＮＡ单链断裂（ＳＳＢｓ），国外偶有报道用于检测ＤＮＡ链间交联（ＩＳＣ）。甲醛是一种弱的动物促癌剂，在体外可诱发ＤＮ...     

262例HBV感染者PCR与ELISA检测结果分析

对２６２例确诊的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染者用聚合酶链反应检测血清ＨＢＶ－ＤＮＡ,用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测血清ＨＢＶ的五项标志。结果显示,ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗－ＨＢＣ同时阳性者,ＨＢＶ－ＤＮＡ的阳性率为９７．０６％,ＨＢｓＡｇ、抗－ＨＢｅ、抗－ＨＢｃ同时阳性者,ＨＢＶ－ＤＮＡ的阳性率为８９．４７％,ＨＢｓＡｇ、抗－ＨＢｃ同时阳性者,ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率为８１．８２％。提示：ＰＣＲ对ＨＢＶ及其传染者的检测更敏感、直接。     

ELISA微板法检测乙型肝炎病毒核心抗原的研究

以双抗体包被的抗体夹心法，用微板ＥＬＪＩＳＡ检测血清ＨＢｃＡｇ，确定双包被工作度ＭＣ－抗－ＨＢＣ（效价１：１０００）为０．０４μｌ／孔，ＭＣ－抗－ＨＢＳ（１ｍｇ／ｍｌ，５ｍｇ／ｍｌ）为３～４μｌ／孔；最佳裂解剂及其工作度为７％ＮＰ－４０巯基乙醇溶液。分别用不同的酶标记抗体检测，均证明双包被具有特异性。加入抗－ＨＥｃ进行阻断试验，其阻断率为７９．３％。对临床８４４例ＨＢｓＡｇ阴性的血清及１１４例ＨＢＶ－ＤＮＡ探针阴性血清用本法进行ＨＢｃＡｇ检测，均为阴性。在临床应用上，本法阳性率明显高于试管法，与ＨＢＶ－ＤＮＡ探针阳性符合率为９１．４％，且特异性与ＨＢＶ－ＤＮＡ探针一致。     

阿托伐他汀对IL-6诱导人脐静脉内皮细胞表达内皮抑素的影响

目的探讨阿托伐他汀对IL-6诱导的人脐静脉内皮细胞表达内皮抑素(ES)的抑制作用。方法采用IL-6和/或阿托伐他汀处理人脐静脉内皮细胞24～48h,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测培养人脐静脉内皮细胞上清液中ES浓度,RT-PCR检测ESmRNA的表达。结果 IL-6组48h时较对照组上清液ES浓度显著增加[(18.45±6.80)vs(6.81±2.33)ng/ml,P0.01],同时较24h时上清液ES浓度显著增加[(18.45±6.80)vs(7.07±2.54)ng/ml,P0.01];At+IL-6组与IL-6组48h时比较上清液ES浓度减少差异有统计学意义[(9.82±4.74)vs(18.45±6.80)ng/ml,P0.05]。IL-6组48h时与对照组比较ESmRNA表达显著增加[(0.587±0.220)vs(0.122±0.096),P0.001];At+IL-6组48h时与IL-6组相比ESmRNA表达减少差异有统计学意义[(0.310±0.205)vs(0.587±0.220),P0.05]。结论 IL-6可诱导人脐静脉内皮细胞分泌表达ES,阿托伐他汀对其分泌表达ES具有抑制作用。     

Dectin-1融合蛋白真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠Dectin-1融合蛋白真核表达质粒并进行真核表达初步研究.方法 运用RT-PCR技术扩增小鼠腹腔巨噬细胞Dectin-1基因的细胞外碳水化合物识别域(CRD),与真核表达载体pSecTag2C进行双酶切之后进行连接反应,构建重组融合表达载体,转染入293细胞中,目的 蛋白在细胞培养基中分泌表达,表达产物经蛋白浓缩、纯化后经SDS-PAGE、Western印迹鉴定.结果 获得重组真核表达载体pSecTag2C-Dectin-1,测序结果 证明质粒DNA序列完全正确,并在转染入293细胞后检测到目的 蛋白的表达.结论 成功构建重组真核表达载体pSecTag2C-Dectin-1,为进一步纯化蛋白研究真菌检测方法 及Dectin-1与真菌相互作用机制、功能等奠定了基础.     

人白细胞介素10基因克隆及真核表达

目的建立人白细胞介素-10(hIL-10)真核表达系统并观察其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达。方法用RT—PCR方法自活化的人外周血淋巴细胞扩增hIL-10cDNA，将其克隆至pMD18-T中，测序正确后，再定向插入至真核表达载体pCIneo中，经脂质体介导转染CHO细胞，检测其在细胞内外的表达和分泌并进行活性检测。结果RT—PCR扩增的hIL-10cDNA序列与GenBank中hIL-10cDNA序列一致；构建了真核重组表达载体pCIneO—hIL-10；转染CHO细胞后可检测到具生物活性的hIL-10的转录和表达。结论成功构建了hIL-10真核表达系统，为今后的临床研究及基因工程药物生产打下基础。     

CCL21转染PANC-1细胞株及对其生物学行为的影响

目的观察CCL21重组慢病毒载体转染PANC-1细胞株及对其生物学行为的影响。方法构建的CCL21重组慢病毒载体转染胰腺癌细胞株PANC-1,通过PCR、Western blot进行验证。结果构建的重组CCL21-慢病毒成功转染胰腺癌细胞株并稳定表达,但转染后的胰腺癌细胞株PANC-1其生物学行为未发生明显变化。结论通过PCR、Western blot检测,构建的重组CCL21-慢病毒成功转染胰腺癌细胞株并稳定表达,但转染后的胰腺癌细胞株PANC-1其生物学行为未发生明显变化。     

miR-29c真核表达载体构建及鉴定

目的构建pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c真核表达载体,为进一步研究miR-29c的功能和靶基因鉴定奠定基础。方法根据miR-29c成熟体序列设计合成1对miRNA寡聚单链DNA,经退火后克隆到真核表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR中,瞬时转染肺腺癌A549细胞后,经实时荧光定量PCR检测pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c在肺癌细胞中表达miR-29c。结果 A549转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c 24 h后,miR-29c表达量上升,明显高于阴性对照,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建真核表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c,并能有效表达miR-29c。     

大鼠聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1基因RNA干扰表达质粒构建与鉴定

目的 构建并筛选大鼠聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)基因的RNA干扰(RNAi)表达质粒,为职业性疾患的基因治疗探索新途径.方法 根据基因序列数据库中报道的PARP-1基因序列及短发夹RNA(shRNA)设计原则,设计、合成用于构建RNAi质粒的寡核苷酸,构建4种重组PARP-1 RNAi质粒,酶切及测序鉴定正确后,以脂质体Lipofectamine TM2000介导转染大鼠骨髓间充质干细胞.48 h后,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测转染细胞中PARP-1 mRNA的转录水平,筛选有效的PARP-1 RNAi质粒.结果 4种重组PARP-1 RNAi质粒经酶切及测序证明构建正确.转染后48 h,转染质粒shRNA-PARP-1-532的细胞PARP-1基因抑制效果最明显,mRNA的转录水平下降了78％,可作为后续实验的有效质粒.结论 成功构建并筛选出PARP-1基因的RNAi表达质粒,为探索PARP-1基因在疾病中的作用奠定了基础.     

补锌糖尿病大鼠差异显示新基因片段的克隆鉴定及组织表达

目的克隆补锌糖尿病大鼠差异显示的新基因片段并检测其在各组织中的表达分布。方法对前期研究中分离到的与补锌有关的糖尿病大鼠差异显示的基因片段进行克隆、测序,同源性分析,对发现的2条新基因(2#差异显示片段及6#差异显示片段)设计特异性引物,进行RT-PCR检测,以观察新基因在各组大鼠肝脏中的表达变化,并检测新基因在不同组织中的表达情况。结果经克隆、测序、同源性分析,在GenBank中未找到与2#差异显示片段及6#差异显示片段高同源性的序列,确定2#及6#差异显示片段为新的基因片段;2#及6#新基因片段在糖尿病对照组、糖尿病补锌组的表达量均低于正常对照组,糖尿病补锌组的表达量高于糖尿病对照组(P<0.05);2#新基因片段在大脑及胰腺中表达量较高,在肾脏中表达量较低,在心肌、骨骼肌、胸腺中无表达。6#新基因片段在心肌、骨骼肌、大脑、肾脏、胰腺中均有表达,但在胸腺中无表达;2#及6#新基因片段被GenBank收录,接收号分别为AY952968、AY952970。结论分离并克隆了2条与补锌有关的糖尿病大鼠差异显示的新基因片段,经RT-PCR检测其在各组大鼠肝脏及其它各组织中表达分布后,在GenBank上成功登录。     

人乳腺珠蛋白基因疫苗的构建及其免疫原性研究

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因重组质粒pcDNA3.1-hMAM,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序后克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM。将重组载体脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法和ELISA检测目的基因的表达。结果:成功扩增hMAM基因,酶切测序表明,重组质粒含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM基因疫苗构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

一个新的睾丸特异表达小鼠基因电子克隆与序列分析

目的电子克隆小鼠睾丸组织特异表达新的基因。方法运用"数据库消减杂交"筛选出一个在小鼠睾丸中特异表达的新基因(GI:223462116)。结果序列分析显示该cDNA长1 428 bp,有一个801 bp的开放阅读框,编码266个氨基酸,该蛋白质明显的含有4个亲水性区域,2个疏水性区域。结论所克隆的cDNA序列为小鼠的一个新基因。     

人神经病靶标酯酶RNAi表达载体的构建及其对哺乳动物细胞中NTE表达的抑制

目的构建人神经病靶标酯酶（NTE）双链RNA的稳定表达载体。方法用SpeI和XhoI将pSUPER质粒中的H1 RNA聚合酶Ⅲ启动子及多克隆位点部分切下替换pcDNA3．1（＋）载体中的巨嗜细胞病毒（CMV）启动子及其多克隆位点，构建了适合在哺乳动物细胞中表达具有干涉作用的小RNA的载体pSUPER／neo，进而将针对NTE表达的双链DNA插入到Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切的载体pSUPER／neo中构建NTE的双链RNA表达载体pSUPER/neo-NTE，后者被转染到COS7和SH-SYSY细胞中，采用蛋白质杂交和酶活力测定的方法，检测其表达效率并验证载体构建的TF确性。结果构建了适合在真核细胞用抗生素筛选的NTE双链RNA表达载体pSUPER／neo-NTE。蛋白质杂交检测显示，转染细胞能有效抑制外源性NTE的表达；酶活力测定则显示其能有效地抑制内源性NTE的表达．结论采用启动子替换的策略，成功构建了NTE双链RNA的表达载体并在哺乳动物细胞内有效抑制NTE的表达。