分枝杆菌特殊DNA序列检测及其在分类鉴定中的应用进展

分子生物学技术已应用于分枝杆菌菌种快速鉴定，目前分子鉴定靶序列主要有四种：即hsp65基因，dnaj基因16SrRNA基因，16S－23SrDNA 间隔区序列，其他一些序列如IS6110，mce基因内453bp重复序列，SenX3-RegX3 IR,mtp40,DTI/DT6,属于种特异性或群特异性DNA序列，本文对这些DNA序列在分枝杆菌鉴定应用进行综述。     

分枝杆菌特殊DNA序列检测及其在分类鉴定中的应用进展

分子生物学技术已应用于分枝杆菌菌种快速鉴定。目前分子鉴定靶序列主要有四种 :即hsp6 5基因、dnaj基因、16SrRNA基因、16S 2 3SrDNA间隔区序列。其他一些序列如IS6 110、mce基因内 45 3bp重复序列、SenX3 RegX3IR、mtp40、DT1/DT6 ,属于种特异性或群特异性DNA序列。本文对这些DNA序列在分枝杆菌鉴定应用进行综述     

转基因食品PCR定性检测技术的研究

目的建立简便、快速、灵敏、特异的植物源性转基因食品DNA检测技术。方法针对转基因植物技术中载体上常用花椰菜花叶病毒的35S启动子和根农杆菌的NOS终止子特异基因序列,设计合成特异的引物对35S、NOS,利用基因PCR扩增技术检测转基因食品。结果引物对35S、NOS分别成功从转基因大豆中扩增出195bp和180bp特异的DNA带。结论基于35S启动子和NOS终止子基因序列的PCR扩增技术是一种简便、快速、灵敏、特异的转基因食品DNA检测技术。     

焦磷酸测序快速检测3种海洋性弧菌的方法学建立及创伤弧菌16S rRNA基因分型的研究

目的建立一种海洋致病性弧菌的快速诊断方法,为海洋性弧菌感染的临床检测构建新的技术平台。方法分别针对创伤弧菌vvh A,副溶血弧菌和溶藻弧菌的toxR基因设计扩增引物和测序引物,并PCR扩增特异性DNA片段,制备单链模板,进行焦磷酸测序,得到的碱基序列经NCBI比对验证;对创伤弧菌16S rRNA基因进行分型。结果创伤弧菌的扩增引物和测序引物均表现出较好的特异性,4株创伤弧菌均扩增出167 bp大小的DNA片段,并且测序结果与NCBI比对达到100%匹配度,而其他菌株未见扩增条带,测序结果为阴性;11株副溶血弧菌和溶藻弧菌均分别扩增出105 bp和134 bp大小的DNA片段,并且经测序得到与预期相符的DNA碱基序列。4株创伤弧菌中1株属于16S rRNA-A型,其余3株均属于16S rRNA-B型。结论本研究建立的PCR-焦磷酸测序方法是一种短核苷酸序列实时测定的新方法,具有高通量、精确、简单易行的优点,适用于海洋性致病菌及陆地感染细菌的快速精准鉴定。     

一种改良的人DNA微量快速检验技术

目的 探索一种以口腔粘膜脱落细胞为材料的安全、高效、低成本、敏感性高的人DNA微量快速检测方法。方法 采用从漱口液或棉签擦拭口腔粘膜获取脱落细胞,应用混合树脂（Chelex100）煮沸沉淀法提取DNA;用PCR分别对线粒体特异性DNA片断和基因组中的特定基因进行扩增检测。结果 通过对线粒体DNA中440 bp的非编码片段和染色体基因组中220 bp的乙醛脱氢酶DNA片段进行扩增,结果显示,从漱口液脱落细胞提取的DNA中可以稳定地扩增出上述两种DNA片断。结论 建立了一种改良的人口腔粘膜脱落细胞DNA微量快速检验技术。该法取样方便,DNA样品获取量较大,一次取样可同时进行多项线粒体和基因组标志DNA片段的快速PCR检测。     

转基因食品PCR定性检测技术的研究

目的 建立简便、快速、灵敏、特异的植物源性转基因食品DNA检测技术.方法 针对转基因植物技术中载体上常用花椰菜花叶病毒的35S启动子和根农杆菌的NOS终止子特异基因序列,设计合成特异的引物对35S、NOS,利用基因PCR扩增技术检测转基因食品.结果 引物对35S、NOS分别成功从转基因大豆中扩增出195bp和180bp特异的DNA带.结论 基于35S启动子和NOS终止子基因序列的PCR扩增技术是一种简便、快速、灵敏、特异的转基因食品DNA检测技术.     

利用生物条形码技术对相思子毒素进行微量检测

目的建立相思子毒素的高灵敏检测方法。方法利用相思子毒素的多抗及特异DNA链标记的金纳米颗粒NP探针和相思子毒素单抗标记的磁性微球MMP探针,形成MMP-相思子毒素-NP三明治复合物后再利用去杂交将NP探针上标记的DNA链释放出来,通过PCR方法或芯片检测方法鉴定这些释放的DNA链就可确定相思子毒素的存在。结果建立了相思子毒素的生物条形码检测体系,检测灵敏度可达1 fg/ml。和临床上常规的检测方法相比,其检测灵敏度可达常规ELISA的106倍。结论本资料为发展高灵敏度的相思子毒素的生物条形码检测试剂盒鉴定了基础。     

PCR-焦磷酸测序法快速检测和鉴定临床常见致病菌的研究

焦磷酸测序（Pyrosequecing）技术为近年新一代短片段DNA序列分析技术。国外主要用于分子流行病学的单个核苷酸多态性位点大容量快速检测和临床微生物菌种鉴定与分型，但国内尚未开展。本研究刚该技术对针对不同细菌的独特分子标志，设计基于PCR技术的快速菌种鉴定方法，以提供从分子水平快速鉴定菌种的新的可靠方法。     

大理地区志贺菌的血清型分布及多重PCR检测技术的应用

目的 探讨大理地区志贺菌的血清型分布以及多重PCR技术在志贺菌检测中的应用.方法 用常规分离培养、生化鉴定和血清学分型法对腹泻患者粪标本进行检测,分离到的标本再用多重PCR法对志贺菌的毒力基因shetA、shetB、ial和ipaH进行扩增检测.结果 通过常规培养和生化反应鉴定,得到68株志贺菌.血清学鉴定显示福氏志贺菌41株,宋内志贺菌25株,鲍氏志贺菌2株.通过多重PCR扩增后68株志贺菌均在423 bp(ipaH)处出现了条带,检出率为100%,其余在147 bp(shetB)、309 bp(shetA)处以及320 bp(ial)处均出现了至少一个条带,与常规鉴定法的符合率达100%.5份直接用阳性粪便标本提取DNA为模板进行多重PCR扩增后,也得到了同样的结果.结论 大理地区细菌性痢疾患者感染以福氏志贺菌为主,多重PCR技术可用于志贺菌的快速检测和流行病学调查.     

两种念珠菌DNA探针的研制及应用

目的：制备两种念珠菌DNA探针并应用于临床诊断。方法：对聚合酶链反应扩增的白色念珠菌标准株的E03基因的125bp片段，用半抗原地高辛标记；合成仪合成的E03基因中25bp特异寡核苷酸，用生物素标记。检测两种探针显色敏感度，并与23株临床分离的白色念珠菌、热带念珠菌，近平滑念珠菌、克柔念珠菌、星形念珠菌及大肠埃希菌等细菌进行斑点杂交试验。结果：Dig-125bpDNA探针显色敏感度为0.01pg，仅与白色念珠菌杂交，且对临床分离株检测的结果与传统厚膜孢子鉴定法相符。Bio-25bpDNA探针显色敏感度为20pg，与白色念珠菌、近平滑念珠菌及星形念珠菌杂交。结论：Bio-25bp DNA探针可用于念珠菌初步鉴定，而Dig-125bp DNA探针可用于白色念珠菌的鉴定。     

CMV早期核抗原单克隆抗体的快速检测

巨细胞病毒(CMV)的DNA探针技术和短期病毒培养增殖后免疫荧光技术是鉴定临床标本中CMV的两种快速的方法。至今为至,DNA探针检培养增殖后免疫荧光技术是鉴定临床标本中CMV的两种快速的方法.至今为至,DNA探针检测CMV主要用于研究,而免疫荧光技术已用于临床.作者建立了一种     

分枝杆菌的分子诊断

结核病仍然是世界范围的主要传染病，由于致病菌结核分支杆菌生长速度缓慢，结核杆菌和其他的临床上重要的分枝杆菌的分离，鉴定和药物敏感试验需要几个星期或更长的时间，近年来，多种分子诊断方法已用于分枝杆菌的直接检测，菌种鉴定和药物敏感实验，极大缩短了诊断时间，两种核酸扩增方法改良型结核分支杆菌直接试验和Amplicor结核分枝杆菌试验已经获得FDA批准用于临床标本结核分枝杆菌的检测，PCR测序和DNA探针作为多数分枝杆菌的菌种鉴定的常规手段。高通量的寡核苷酸阵列已用于分枝杆菌利福平耐药基因突变的检测和菌种的鉴定。     

阵列比较基因组杂交技术在肿瘤研究中的应用进展

基因组变异是肿瘤细胞的一个重要特点,其参与肿瘤形成的生物学过程和通路。阵列比较基因组杂交技术能以高分辨率在全基因组范围内检测基因变异和DNA拷贝数改变,尤其能对特异的基因变异进行高度准确的定位。现综述目前常用的几种阵列平台及其在寻找肿瘤相关基因、监测肿瘤发展进程、判断预后等方面的应用。     

用重组酶介导等温核酸扩增技术检测烟曲霉

目的建立检测烟曲霉的重组酶介导等温核酸扩增技术(RPA)方法。方法筛选针对烟曲霉ITS1-2靶DNA序列的特异性引物。建立RPA快速检测烟曲霉方法并进行条件优化。分析RPA特异性和敏感性并与Taq PCR结果进行比较。结果RPA检测烟曲霉的优化条件为:引物长度:18~30 bp;产物长度:200~700 bp;扩增温度:37~42℃,最低在27℃也可实现扩增;扩增时间:15~40 min,15 min即可达到凝胶电泳可检测的产物量;只需简单的恒温加热设备。RPA和Taq PCR可检测到的最低DNA浓度均为100 ng/m L。RPA仅对烟曲霉有特异性扩增,对黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、中国红酵母均无交叉扩增反应。结论建立的针对烟曲霉ITS1-ITS2靶DNA序列的RPA检测方法,可以快速、特异、灵敏地鉴定和检测烟曲霉。     

悬浮阵列技术在儿童下呼吸道病毒感染诊断中的应用

基因芯片技术具有快速、高效、高通量的特点，非常适合于对病毒性感染进行分子诊断及鉴别诊断。本研究采用Tem-PCR技术结合多功能悬浮阵列检测平台，检测了80例下呼吸道感染患儿的7种RNA病毒，探讨其在儿童急性下呼吸道病毒感染中的诊断价值。     

自身引物菌落聚合酶链反应筛选LoxP序列重组阳性克隆

目的 研究LoxP序列小片段重组阳性克隆的筛选和鉴定方法。方法 采用合成的LoxP为上游引物，载体互补的序列为下游引物，直接以菌落为模板进行聚合酶链反应(PCR)，电泳分离出784bp的条带者为阳性；PCR阳性克隆再用酶切法进行对比鉴定及DNA测序分析确证。结果 用菌落PCR法随机筛选的6个菌落中3个为阳性，随机取1个阳性克隆进行DNA序列分析，证实含有LoxP插入序列。用酶切法对此3个阳性克隆进行鉴定，3个克隆和未进行酶切的对照均出现100bp以下模糊带，结果不能判断。结论 自身引物菌落PCR法用于筛选和鉴定LoxP序列重组阳性克隆是一种快速、简便、经济、高效的方法。     

PCR结合反向膜杂交快速鉴定临床常见念珠菌方法学的建立

目的建立PCR结合反向膜杂交技术快速检测临床常见致病念珠菌的方法。方法根据真菌rDNA高度可变区设计白色念珠菌、热带念珠菌,近平滑念珠菌,都柏林念珠菌,光滑念珠菌、克柔念珠菌的种特异性探针,加尾后固定在尼龙膜上,生物素标记的通用引物扩增转录间隔区ITS1,利用反向膜杂交技术快速检测念珠菌种群。结果以上六种念珠菌均能扩增出大小为218 bp的条带,每张膜上只有与靶序列对应的探针点有阳性结果,其他探针点均为阴性。正常人类基因组DNA及临床常见的几种细菌DNA扩增结果均为阴性。结论 PCR结合反向膜杂交技术方法学的建立,可以快速检测临床常见致病的念珠菌。该方法特异性高,耗费时间短。可以快速、准确的为临床抗真菌药物的使用提供指导依据。     

应用DNA探针检测甲氧西林耐药葡萄球菌

目的建立一种快速检测葡萄球菌和甲氧西林耐药葡萄球菌的斑点杂交技术。方法设计金黄色葡萄球菌nuc基因、甲氧西林耐药mecA基因、葡萄球菌tuf基因的特异引物,用聚合酶链反应合成其特异DNA探针,并用生物素标记,分别与固定在硝酸纤维素膜上的标准菌株和临床分离株模板DNA杂交,观察其敏感性和特异性。结果3对引物分别扩增出270bp、310bp、370bp3种DNA探针,均具有高度特异性。50株金黄色葡萄球菌tuf、nuc基因均为阳性：mecA基因阳性者22株。30株表皮葡萄球菌tuf基因均为阳性,nuc基因均为阴性,mecA基因阳性者9株。而其他非葡萄球菌与3种DNA探针杂交结果均为阴性。该方法可检测出1 ng细菌DNA。结论斑点杂交技术检测耐甲氧西林葡萄球菌快速、有效,具有较高的应用价值。     

人表皮生长因子基因真核表达载体的构建及其基因转染

目的：构建人表皮生长因子基因真核表达载体，并将其导入细胞中表达表皮生长因子重组蛋白。 方法：经HindⅢ、BarnHI酶切PGEM-TEasy-hEGF，将人表皮生长因子基因定向克隆到真核表达载体pcDNA3．1中。在脂质体的包裹下将pcDNA3．I-hEGF导入角膜组织细胞中，分别从DNA、RNA、蛋白质3个水平上检测人表皮生长因子基因表达情况。 结果：经T7／SP6和hEGF内套引物进行PCR扩增及酶切鉴定重组体，分别得到310bp和162bp两条基因片段，将162bp条带经纯化后用AVa皿限制性内切酶切鉴定，可分别得到89bp和72bp两条片段；将人表皮生长因子基因序列与Genbank上公布的序列相比，碱基同源性达98．2％，氨基酸完全相同；PCR，RT．PCR在转染后21d之内，在DNA、RNA水平上可检测到人表皮生长因子基因；免疫组织化学检恻法在转染后第3天可检测到人表皮生长因子蛋白表达，2周之后，人表皮生长因子蛋白表达结果转为阴性。 结论：pcDNA3．1-hEGF重组质粒与LipofectamineTM2000以适当比例混合形成的微囊可携带人表皮生长因子基因进入细胞内并表达功能蛋白。     

革兰氏阴性菌耐药基因检测芯片的研制及应用

目的探讨应用基因芯片对革兰氏阴性菌耐药基因进行快速检测的方法,并进行鉴定。方法根据GenBank上已发表的革兰氏阴性菌耐药基因盒不同亚型的基因序列,参考各亚型cDNAs区域的保守序列设计了针对16种耐药基因的特异探针,制备了革兰氏阴性菌耐药基因分型鉴定基因芯片。从16株临床分离的菌株中提取细菌基因组DNA,随机引物标记后与芯片进行杂交,同时与DNA测序法比较。结果用于评价革兰氏阴性菌耐药基因芯片的阳性菌株均出现良好的特异性杂交信号。结论该基因芯片可实现对革兰氏阴性菌耐药基因的快速检测。