人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。     

用酵母载体pPIC9k重组构建表达sCR1

目的采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western Blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

幽门螺杆菌多表位肽在毕赤酵母中的分泌表达

构建分泌表达幽门螺杆菌多表位肽CTB-UE的毕赤酵母。以原核表达载体pET-22b-CTB-UE为模板,通过PCR扩增得到融合His-tag的ctb-ue基因序列,将其插入酵母表达载体pPIC9K,得到重组表达载体pPIC9K-CTB-UE。重组表达载体pPIC9K-CTB-UE经内切酶Sal I线性化后,电击转化进毕赤酵母GS115,通过组氨酸缺陷性MD平板筛选重组菌株,G418抗性筛选多拷贝转化子,阳性转化子经PCR鉴定,摇瓶发酵表达,取上清经过超滤浓缩,Ni-NTP亲和层析纯化,透析脱盐,SDS-PAGE检测,Western blot验证。结果获得了整合有ctb-ue基因的毕赤酵母,诱导后分泌表达的CTB-UE蛋白能够与His-tag抗体发生特异性反应。成功构建了分泌型毕赤酵母GS115(pPIC9K-CTB-UE),能分泌表达幽门螺杆菌多表位肽CTB-UE。     

His肽修饰小鼠IFNγ的制备

制备标记有6His的小鼠可溶性干扰素γ(Mouse interferon gamma,mIFNγ),为其功能研究提供更多实验基础.采用RT-PCR扩增编码mIFNγ的cDNA序列,克隆于pUC19质粒,测序鉴定正确后亚克隆到pQE80L表达质粒载体中,经BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切后1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定;利用SDS-PAGE和Western blot检测表达的目的蛋白,Ni2 -NTA亲和层析纯化重组蛋白,ELISA进行检测.结果RT-PCR扩增得到编码mIFNγ cDNA片段,测序结果正确,SDS-PAGE和Western blot分析显示重组蛋白在大肠杆菌中获得了较高水平表达,mIFNγ占菌体蛋白的30%.Ni2 -NTA亲和层析纯化得到的mIFNγ蛋白纯度达到96%以上;ELISA检测出目的蛋白.结果证实重组蛋白mIFNγ被成功制备.     

人可溶性血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体Flt-1基因在甲醇酵母中的克隆表达

应用RT－PCR技术，从人脐静脉内皮细胞中扩增出编码Flt-1，胞外区前四个结构域的基因片段，将Flt-1基因片段连接到表达载体PIC9K上，获得重组质粒pPIC9K-F，将重组质粒转化到甲醇酵母Pichia pastoris GS115中，得到基因工程菌株P.pastoris(pPIC9K-F)，对培养上清进行SDS－PAGE和Western blot分析。结果显示在74.2ku处有阳性条带出现，表明sFLT-1在甲醇酵母中获得了成功表达。受体配基结合实际显示表达产物与VEGF可特异性结合，表明其具有配基结合生物活性。     

重组人可溶性TRAIL在毕赤酵母中表达与纯化及其抗肿瘤细胞活性

目的研究重组人可溶性TRAIL(sTRAIL)蛋白的表达和纯化,以及对HepG2细胞增殖与凋亡的影响。方法将人sTRAIL基因插入毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建甲醇酵母分泌型表达载体pPIC9-sTRAIL,电击转化至GS115(his4),MD平板筛选出阳性菌株。对工程菌株发酵培养基成分、pH、甲醇浓度、诱导表达时间等条件进行优化,并初步分析重组sTRAIL蛋白的体外抗肿瘤活性。结果工程菌株在BMMY培养基(pH6.0)、1%甲醇条件下诱导表达48h目的蛋白浓度最高可达(58.7±2.4)mg/L。重组人sTRAIL蛋白能抑制HepG2细胞的增殖、诱导HepG2细胞的凋亡。结论优化了人sTRAIL的表达和纯化工艺条件,所生产的sTRAIL可用于抗肝癌新药的开发。     

N-糖基化IL-24的表达及体外诱导肿瘤细胞凋亡的研究

目的构建IL-24基因的真核表达载体,在毕赤酵母GS115中高效表达,研究重组N-糖基化IL-24蛋白体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性。方法借助过渡质粒α/pUC18,将IL-24基因插入到质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,构建重组质粒IL-24/pPIC9K,转化毕赤酵母GS115分泌表达,Tricine-SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白,ELISA检测蛋白表达量,糖苷酶PNGaseF分析IL-24糖基化形式和程度。MTT法和形态学分析重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的活性。结果成功构建重组表达质粒IL-24/pPIC9K,IL-24在毕赤酵母最高表达量为(81.31±14.46)mg·L-1。约70%的IL-24发生了N-糖基化。重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响。N-糖基化IL-24对MCF-7抑制率约高于去糖基化IL-24。结论毕赤酵母分泌形式的表达和适度的糖基化修饰都有利于目的蛋白IL-24的生物学活性,为后续的研究提供基础。     

重组rPA基因在毕赤酵母细胞中的胞内表达研究

目的构建含rPA全长基因的重组酵母胞内表达质粒pPIC9K rPA ,并在毕赤酵母中进行表达。方法用限制性内切酶BamHI和NotI将含有rPA全长基因的质粒pJZ1 6双酶切后 ,克隆至酵母表达载体pPIC9K中 ,构建酵母重组表达质粒。rPA基因经DNA序列测定准确无误。通过电穿孔法转染毕赤酵母菌GS1 1 5 ,PCR鉴定阳性酵母转化子 ,将rPA基因整合入酵母基因组DNA ,在毕赤酵母中实现了胞内非融合表达。表达产物进行SDS PAGE、Western blots以及溶纤维蛋白活性检测。结果表达产物以胞内包涵体的形式存在 ,未糖基化。SDS PAGE结果显示表达蛋白质的相对分子量约为 39kD。Western blots检测表明表达蛋白质能与单克隆抗体发生特异性反应。包涵体经 8mol L脲溶液溶解后 ,有明显的溶纤维蛋白活性。结论在毕赤酵母中成功地实现了rPA重组蛋白的胞内表达     

人GCSF-白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达

制备人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白.从新鲜人外周血中分离单核细胞,给予大肠杆菌脂多糖刺激后,RT-PCR制备G-CSF cDNA,以其为模板扩增得到人G-CSF的编码区序列(525 bp).重叠PCR拼接HSA-GCSF融合基因(2277 bp),序列测定正确,中间未加入任何连接肽.插入表达载体pPIC9K中a交配因子的开放阅读框内,构建分泌型表达重组质粒pPIC9K-HSA-GCSF.电击转化毕赤酵母菌KM71,G418筛选得到高拷贝转化子.甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的相对分子质量约为84 k,Western blot分析融合蛋白为G-CSF与HSA的杂合分子,NFS-60细胞/MTT比色法测定融合蛋白具有G-CSF的生物学活性.结果:构建了可分泌表达HSA-GCSF融合蛋白的毕赤酵母工程菌,为进一步对其进行药学研究奠定了基础.     

人C-型利钠肽-血清白蛋白融合蛋白质的构建及在毕赤酵母中的分泌表达

目的构建重组表达人C-型利尿钠肽(CNP)-人血清白蛋白(HSA)融合蛋白质的毕赤酵母。方法重叠PCR拼接CNP(400 bp)-HSA(1 800 bp)成融合基因,双酶切后克隆至表达载体pPIC9K中。电穿孔法转染毕赤酵母菌KM71,摇瓶培养分泌表达。结果融合基因约为2 200 bp,序列测定正确。SDS-PAGE分析相对分子质量约为80 000,Western blot和RIA鉴定显示其为CNP与HSA的杂合分子。结论实现了HSA-CNP融合蛋白质在毕赤酵母中的分泌表达。     

重组人血清白蛋白-hGCSF突变体在毕赤酵母中的表达

目的通过定点突变,提高融合蛋白HSA-hGCSF的生物活性。方法结构模拟显示,对hG-CSF中5个氨基酸残基加以突变可以提高其生物活性。通过限制性酶切方法将该突变基因与HSA基因的3′连接,融合基因插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,置于启动子AOX1之后,重组质粒pPIC9K-HSA-hG-CSFm经SalⅠ线性化,电击转化毕赤酵母GS115,摇瓶中进行分泌表达。用MTT比色法测定发酵液上清中融合蛋白的hG-CSF活性。结果PCR鉴定得到约为2300bp的融合基因,测序结果正确。SDS-PAGE和Western blot分析表达的融合蛋白HSA-hGCSFm,表明该蛋白相对分子质量约为85000,且具有HSA的抗原性,生物活性为1.5×106IU/mL。结论分子设计实现了突变体融合蛋白生物活性的提高。     

T4溶菌酶在毕赤酵母中的诱导表达及抑菌活性测定

目的利用毕赤酵母诱导表达T4溶菌酶蛋白并测定其抗菌活性。方法T4溶菌酶（T4lysozyme）基因以N端融合的方式被准确插入到质粒pPIC9K的EcoR I-Not I位点内,得到分泌型重组表达载体 pPIC9K-T4L。该载体首先经限制性内切酶Sal I酶切,进而采用电击方法将线性化的重组质粒DNA导入到毕赤酵母中。经过梯度筛选得到多个单拷贝和多拷贝转化重组子。随机挑取部分重组子PCR扩增阳性克隆,经菌体培养和甲醇诱导后获得了分泌表达,表达产物存在于培养上清液中。结果表达蛋白经琼脂孔扩散抗菌实验显示抑菌圈明显;重组蛋白对金黄色葡萄球菌与肺炎链球菌均具有显著抑制作用;多拷贝与单拷贝重组表达子没有抗菌活性差异与蛋白表达量的差异;加热煮沸对于T4溶菌酶蛋白的抗菌活性无明显影响。结论T4溶菌酶在毕赤酵母中得以成功诱导与表达;表达产物不受拷贝数影响并具热稳定性。     

人肠三叶因子毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的构建人肠三叶因子(hITF)的毕赤酵母表达载体。方法从人结肠黏膜提取总RNA,经RT-PCR得到hITF cDNA,用PCR方法扩增hITF基因,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的重组表达质粒pPIC9/hITF。结果通过酶切和基因序列分析确定插入pPIC9中的片段为hITF基因片段。结论重组质粒pPIC9/hITF的成功构建,为在真核细胞中高效表达hITF。并制备其抗体的进一步研究提供基础。     

猪囊尾蚴cC1亚单位疫苗毕赤酵母高表达体系的优化

目的　优化猪囊尾蚴 c C1亚单位疫苗毕赤酵母表达系统。方法　毕赤酵母转化菌在 BMMY、BMM、MM及各加 1%酪蛋白水解物 (CA)的诱导培养基中经 0 .5 %甲醇诱导表达后 ,上清液行 SDS- PAGE。结果　高拷贝毕赤酵母转化菌 SMD116 8的表达水平高于酵母转化菌 GS115 ;Mut S型比 Mut+型表达量高 ;表达水平与拷贝数呈正相关 ,即拷贝数越高 ,表达量也越高 ;在诱导培养基 BMMY中的表达水平明显高于其它诱导培养基 ;阴性对照菌未见目的表达条带。结论　猪囊尾蚴 c C1亚单位疫苗在毕赤酵母高表达系统中得到优化 ,为大量制备生产打下了基础。