肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因的克隆与鉴定

目的：克隆和筛选肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因,方法：将肺腺癌多药耐药细胞（SPC－A－1／CDDP）作为实验方,肺腺癌细胞（SPC－A－1）作为对照方,应用抑制消减杂交技术,构建实验方特异表达cDNA消减文库;用斑点杂交法初步筛选cDNA消减文库后,将获得的阳性克隆进行测序和同源性分析（Genbank),对新的cDNA序列进行Northern blot杂交验证。结果：建立了一个肺腺癌多药耐药细胞（SPC－A－1／CDDP）特异表达cDNA消减文库,斑点杂交法初步筛选显示23个个克隆中有SPC－A－1／CDDP特异表达cDNA片断,测序和同源性分析表明2个cDNA片断为新序列,其余cDNA片段与已知基因有93％－100％的同源性,Northern blot杂交结果表明2个新的cDNA片断来自SPC－A－1／CDDP细胞。结论：2个新的cDNA序列可能为未知肺腺癌多药耐药相关基因序列;抑制消减杂交法是克隆特异表达基因的有效方法。     

胃癌血管特异性短肽GEBP11结合受体的免疫沉淀法筛选

目的：筛选胃癌血管特异性短肽GEBP11（CTKNSYLMC）的结合受体.方法：采用Western-blot、免疫细胞化学染色法对共培养人脐静脉内皮细胞（co-HUVECs）CD31和KDR的表达进行检测;化学合成生物素标记的GEBP11,应用免疫沉淀、免疫磁珠法分离富集与GEBP11结合的蛋白质;采用Western-blot检测,确定并获取特异性蛋白条带;利用液相色谱一二级质谱（LC-MS/MS）及生物信息学分析,对条带蛋白进行测序和分析.结果：co-HUVECs表达CD31,KDR表达增加.通过免疫沉淀和Western-blot分析,发现一条与GEBP11特异结合的条带,其分子量约为12KD.经LC-MS/MS和生物信息学分析,获得候选蛋白ATP7B.结论：经鉴定co-HUVECs表达内皮细胞标志性分子且KDR表达上调;利用免疫沉淀-质谱法筛选获得了GEBP11受体的候选蛋白,为研究GEBP11的作用机制奠定了基础.     

应用免疫沉淀-质谱法筛选肿瘤血管靶向肽CGNSNPKSC的结合受体

目的：筛选和鉴定肿瘤血管靶向肽GX1（CGNSNPKSC）的结合受体。方法：化学合成生物素标记的GX1，培养内皮细胞并收集细胞膜蛋白；利用免疫沉淀的方法进行免疫磁珠分离，富集能与血管特异性短肽GX1结合的蛋白质；利用生物素-亲和素系统进行westernblot免疫检测，筛选出能和GX1结合的目的条带；利用液相色谱-二级质谱（LC—MS／MS）对能与血管特异性短肽GX1结合的蛋白质进行测序鉴定。结果：利用免疫沉淀和westernblot的方法，获得了能与GX1结合的蛋白条带，其分子量为13KDa。利用LC-MS／MS及生物信息学分析，获得了8个候选蛋白：cDNA FLJ40018fis，clone STOMA 2006398，cytochromeP45019A1，pmble histone—lysine N-methyltransferaseASHlL，adenylylcyclase—associated protein2（CAP2），similar to ankyrin repeat domain20A，diacylglycerol kinaseiota（DGKI），isoform 2 of Inositol1，4，5-trisphosphate receptor type1，similartoannexinA2 isoforml。结论：利用免疫沉淀-质谱法获得了8个GX1结合受体的候选蛋白，为进一步寻找血管抑制治疗的靶标奠定了一定的实验基础。     

DOC-2作用蛋白的筛选及与TGFβⅢ受体相互作用的初步验证

背景与目的：人卵巢癌差异表达基因DOC-2既是肿瘤抑制基因也是信号分子，参与细胞的生长分化过程。筛选DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域PID（nDOC-2）的相互作用蛋白并进行初步验证，为研究DOC-2的信号通路提供线索。方法：将含有人DOC-2氨基端PID结构域cDNA的片断插入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒，转化酵母菌AHl09并在其内表达，然后转化人胎脑cDNA文库，在营养缺陷培养基和X-d-半乳糖苷酶（X—d—gal）上进行阳性克隆的双重筛选，PCR扩增目的片段，测序，并进行生物学分析，寻找DOC-2氨基端PID结构域的相互作用蛋白。将DOC-2cDNA和TGFβⅢ受体cDNA共转染人卵巢癌细胞系HO-8910，利用免疫沉淀和Western Blot，对TGFβⅢ型受体是否能与DOC-2相互作用进行初步分析。结果：经扩增和筛选胎脑cDNA文库及序列分析，21个侯选阳性克隆中3个克隆为：APLPl、TGFβⅢ型受体的部分mRNA和PCDHGC3（pmtocadherin gamma subfamily C3）。免疫沉淀及Westernblot结果显示，DOC-2与TGFβⅢ型受体相互作用后可形成蛋白复合物。结论：获得的3个基因编码的蛋白可能参与了DOC-2的信号转导，DOC-2与TGFβⅢ型受体可能存在互相作用，并通过TGFβⅢ型受体在TGFβ的信号通路中起作用。     

肿瘤血管靶向肽GX1的受体筛选

目的：筛选肿瘤血管靶向肽GX1（CGNSNPKSC）的受体。方法：化学合成生物素标记的GX1,分离培养原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,培养并收集共培养人脐静脉内皮细胞（co-HUVECs）全蛋白;应用免疫沉淀、免疫磁珠法分离富集与GX1结合的蛋白质;采用银染检测,确定并获取特异性蛋白条带;利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALD I-TOF-MS）及生物信息学分析,对条带蛋白进行测序和分析。结果：免疫沉淀和银染法获得与GX1特异性结合的蛋白条带,其分子量在10-15KDa之间。利用MALDI-TOF-MS及生物信息学分析获得了一个有意义的候选蛋白核苷二磷酸激酶A（NDPKA）。结论：利用免疫沉淀-质谱法筛选获得了GX1受体的候选蛋白,为研究GX1的作用机制奠定了基础。     

人胃癌细胞定向克隆表达cDNA文库的构建及鉴定

目的：克隆胃癌的相关基因。方法：提取人胃癌细胞总RNA，分离其mRN。以NatI／oligo（dT）12-18为引物合成双链。cDNA，除去小于400bp的cDNA片段后，连接EcoRⅠ人工接头，经NotⅠ酶酶切，插入定向克隆表达载体λExcellNotI／EcoRI／CIP，体外包装后转染大肠杆菌NM522，构建了人胃癌细胞MGC－803定向克隆表达。cDNA文库。结果：文库含1．2×106个重组子，重组率为96．7％。用PCR技术鉴定，文库中插入cDNA的平均大小为1kbc结论：该文库适于筛选各种丰度mRNA的cDNA克隆。     

应用酵母双杂交筛选人胃癌耐药细胞SIVA-1基因相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交筛选人胃癌耐药细胞中与SIVA-1基因相互作用的蛋白。方法:构建人胃癌耐药细胞的cDNA文库,运用酵母双杂交及体外免疫共沉淀实验方法筛选SIVA-1相关作用蛋白,探讨其对胃癌耐药细胞耐药性的影响机制。结果:成功构建人胃癌耐药细胞cDNA文库,滴度为4.78×106 cfu/mL,重组率>95%,扩增后滴度达9.50×109 pfu/mL,成功构建诱饵表达载体pGBKT7-SIVA-1,且经自激活检测表明重组诱饵载体pGBKT7-SIVA-1不具有自激活性。经过初筛,我们获得能同时激活三个报告基因（Ade2、His3、LacZ）的阳性克隆21个,随后将21个阳性克隆进行质粒抽提、扩增并进行酵母回转实验,最终获得4个与SIVA-1截短体相互作用的阳性候选克隆。对这四个文库插入片段进行基因测序,最终得到2个不同的与SIVA-1相互作用的蛋白:UXT（泛表达转录子）和PCBP1（多聚胞嘧啶结合蛋白1）。经体外免疫共沉淀实验后,最终筛选出与胃癌耐药细胞SIVA-1相互作用的PCBP1。结论:PCBP1与SIVA-1之间存在蛋白相互作用关系。     

NY-ESO-1基因在人食管癌中的表达及其基因克隆

背景与目的：NY-ESO-1是从食管癌cDNA文库中筛选到的肿瘤抗原,但是该基因在食管癌组织中的表达情况尚未见报道。本文研究NY-ESO-1基因在食管癌中的表达率,以便于确定食管癌患者是否可以使用以NY-ESO-1抗原为基础的疫苗治疗。方法：采用RT-PCR方法检测了NY-ESO-1基因在30例食管癌组织和相应癌旁正常组织中的表达;采用分子克隆的方法从食管癌组织中克隆了NY-ESO-1cDNA。结果：NY-ESO-1基因在食管癌组织中的表达率为50%（15/30）,在30例相应癌旁正常组织中未见表达;克隆的NY-ESO-1cDNA序列与GenBank报道一致。结论：NY-ESO-1基因在食管癌中高频率表达,NY-ESO-1抗原可以被具有HLA-1类分子限制性CTL识别。     

人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因消减cDNA文库的构建和初步筛选

背景与目的 筛选肺癌转移相关基因有助于阐明肺癌侵袭转移的分子机理.为了筛选不同转移潜能肺癌的转移相关差异表达基因,本研究构建不同转移潜能的人大细胞肺癌细胞株NL9980和L9981间差异表达基因的消减cDNA文库,并对消减文库进行初步筛选.方法 应用抑制消减杂交技术构建人大细胞肺癌高低转移株NL9980与L9981间差异表达基因的正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库,利用α互补原理,经蓝白菌落初步筛选获得阳性克隆,应用斑点杂交的方法对正向和反向消减cDNA文库进行杂交筛选.结果 成功构建了人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因的正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选和斑点杂交,正向消减文库获得了307个阳性克隆,反向消减文库获得了78个阳性克隆.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,利用此方法可以成功构建人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因消减cDNA文库.不同转移潜能人大细胞肺癌细胞株中存在可能与转移相关的差异表达基因.     

生长抑素对胃癌组织中VEGF-C及其受体的影响

目的：探讨生长抑素（somatosatain,SST）对胃癌组织中血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C）及其受体的影响.方法：将2009年1月-2012年6月行手术治疗的60例胃癌病人按随机序贯方式分为SST治疗组与对照组,每组各30例.用实时荧光定量PCR检测60例胃癌组织及其癌旁组织标本中VEGF-C mRNA表达情况,采用免疫组化方法对其受体Flt-4进行检测.结果：对照组VEGF-C、Flt-4在肿瘤组织与癌旁组织中的表达有显著差异.VEGF-C在肿瘤组织中的表达量与胃癌患者的性别、肿瘤分化程度无关,但与肿瘤的淋巴结转移（P＜0.01）、TMN分期（P＜0.01）显著相关.SST治疗组与对照组比较,VEGF-C及其受体Flt-4在胃癌组织中的表达水平显著低于对照组（P＜0.05）.结论：SST可能通过靶向VEGF-C及其受体抑制胃癌肿瘤淋巴转移.     

VEGFR1和MDR1在胃癌中的表达及意义

目的：探讨VEGFR1和MDR1在胃癌中的表达及意义。方法：采用免疫组化SP法检测VEGFR1和MDR1在胃癌中的表达及与分化程度的关系;比较VEGFR1和MDR1在胃癌中的表达相关性。结果：VEGFR1在高、中、低度分化胃癌的表达率依次为15／53（28％）、19／43（44％）、37／54（68％）;在低分化胃癌组织中的表达明显高于高分化和中分化胃癌组织（P〈0．05）。MDR1在高、中、低度分化胃癌的表达率依次为18／53（34％）、21／43（48％）、41／54（76％）;在低分化胃癌组织中的表达明显高于高分化和中分化胃癌组织（P〈0．05）。结论：VEGFR1和MDR1在胃癌中的表达具有一致性,可能在胃癌的多药耐药中扮演重要角色。     

TSG101在胃癌中的表达及意义

目的：探讨TSG101在胃癌中的表达及意义。方法：采用免疫组化sP法检测TSG101在胃癌中的表达及与分化程度的关系。结果：TSG101在胃癌的表达率为77／179（43％），其中在高、中、低度分化胃癌的表达率依次为14／62（23％）、20／59（34％）、43／58（74％）；在低分化胃癌组织中的表达明显高于高分化和中分化胃癌组织（P〈0．05）。结论：TSG101在胃癌中的表达和肿瘤分化程度密切相关，可能在胃癌的发生发展中扮演重要角色。     

CD146在胃癌中的表达及其临床意义

目的:检测和分析CD146在胃癌组织和癌旁黏膜组织中的表达及其与胃癌临床病理参数的关系，探讨CD146的临床意义。方法:使用免疫组化方法检测75例胃癌组织及癌旁黏膜组织中CD146的表达，分析CD146表达与胃癌临床病理参数的相关性。结果:CD146在75例胃癌患者癌组织标本中的阳性表达（46.67%）高于CD146在75例癌旁黏膜组织中的阳性表达（10.67%）（P<0.05）。CD146阳性表达与胃癌患者淋巴结转移及临床分期有关（P<0.05）。但癌组织中CD146表达水平与患者性别、年龄、浸润深度、分化程度无明显相关性（P>0.05）。结论:CD146可能成为胃癌患者潜在的治疗靶点。     

缝隙连接蛋白43的表达与胃癌患者临床病理特征及预后的相关性

目的 探讨缝隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)的表达与胃癌患者临床病理特征及预后的相关性.方法 通过免疫组化检测68例胃癌及癌旁胃正常组织(离肿瘤切缘>5 cm)中Cx43的表达,分析Cx43表达与临床病理特征的相关性.采用Kaplan-Meier构建总生存曲线及无病生存曲线,用Cox回归分析评价胃癌患者...     

胃癌组织中间隙连接超微结构改变及间隙连接蛋白-43的表达及其意义

目的 观察胃癌组织中间隙连接结构的改变,并检测Cx43蛋白及mRNA在组织中的表达,为胃癌的发病机制研究提供新的思路,同时也为药物治疗提供潜在的作用靶点。方法 通过透射电子显微镜技术观察正常胃与胃癌组织中间隙连接的变化;利用Western blot和 RT-PCR技术检测Cx43在正常胃与胃癌组织中的表达水平。结果 胃癌组织超微结构中细胞间隙连接破坏,分化越差破坏越严重,在正常胃组织中Cx43蛋白及mRNA的表达高于胃癌组织中的表达（P<0.05）,在胃癌组织中高-中分化者Cx43蛋白及mRNA表达高于低分化者（P<0.05）,胃癌组织中TNM分期Ⅰ/ⅡCx43蛋白及mRNA表达高于Ⅲ/Ⅳ期的表达（P<0.05）,胃癌组织中浸润深度未侵及浆膜层者Cx43蛋白及mRNA的表达高于侵及浆膜层者（P<0.05）,胃癌组织中无淋巴结转移者Cx43蛋白及mRNA的表达高于有淋巴结转移者(P<0.05）,Cx43蛋白及mRNA在不同年龄和性别组中的表达差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 间隙连接超微结构的改变同Cx43蛋白及mRNA的异常表达与胃癌的发生、发展有关,这为胃癌的发病及靶向治疗提供了新的方向。     

FXR和CDX2在胃黏膜肠化生及胃癌中的表达及意义

目的:探讨法尼酯衍生物X受体(farnesoid X receptor,FXR)和尾型同源盒2(caudal type homeobox 2,CDX2)在胃黏膜肠化生(intestinal metaplasia,IM)及胃癌中的表达和意义。方法:采用免疫组织化学染色法检测FXR和CDX2在30例慢性胃炎、50例IM、60例胃癌组织中的表达。利用卡方检验比较各组间FXR和CDX2的表达差异,并分析其与肠化生和胃癌患者临床病理参数的关系。利用Spearman秩相关检验分析FXR和CDX2表达的相关性。结果:IM和胃癌组织中FXR的高表达率分别为58.0%和38.3%,较慢性胃炎组织(13.3%)均显著增高（P＜0.05）。与IM组织相比,胃癌组织中FXR表达显著下降（P=0.040）。FXR高表达与IM患者肠化生程度较重（中重度）相关（P=0.025）。FXR高表达与胃癌患者分化较好（中高分化）相关（P=0.003）。IM和胃癌组织中CDX2的高表达率分别为46.0%和26.7%,较慢性胃炎组织(6.7%)均显著增高（P＜0.05）。与IM组织相比,胃癌组织中CDX2表达显著下降（P=0.035）。CDX2高表达与IM患者肠化生程度较重（中重度）相关（P=0.004）。CDX2高表达与胃癌患者分化较好（中高分化）相关（P<0.001）。FXR和CDX2表达在慢性胃炎、IM、胃癌组织中均显著正相关（P<0.001）。结论:FXR和CDX2在IM和胃癌组织中表达均上调且显著正相关,可能共同参与了IM和胃癌的发生发展。     

胃癌中RNA解旋酶DDX19A的表达及临床意义

背景与目的：RNA解旋酶DDX19A（DEAD-box helicases 19A）是DDX蛋白超家族的成员之一,主要参与RNA的转运过程。该家族的许多成员参与肿瘤的发生及发展过程,然而关于DDX19A在胃癌中的作用,目前尚未见报道。结合生物信息学分析,探讨胃癌组织中DDX19A的表达情况及临床意义。方法：采用UALCAN数据库,转录水平分析胃癌及癌旁胃组织中DDX19A的表达差异,进一步分析其在胃癌中的表达及与临床分期的关系;采用Kaplan-Meier Plotter数据库分析DDX19A表达水平与胃癌患者总生存期（overall survival,OS）及无病生存期（disease-free survival,DFS）的相关性。采用蛋白质印迹法（Western blot）检测16对冻存的新鲜胃癌组织及配对癌旁胃黏膜中DDX19A蛋白的表达。收集2011—2015年承德医学院附属医院病理科存档的胃癌石蜡包埋标本109例、癌旁胃黏膜标本30例,所有患者临床病理学资料完整。免疫组织化学S-P四步法检测109例胃癌及30例癌旁胃黏膜中DDX19A蛋白的表达,分析其高表达与胃癌临床病理学特征及预后的关系。结果：UALCAN及Kaplan-Meier Plotter数据库检索结果显示,DDX19A mRNA在胃癌组织中的表达明显高于癌旁胃组织（P<0.01）,其高表达与胃癌临床分期及患者不良预后正相关（P<0.05）。Western blot结果显示,胃癌组织中DDX19A蛋白显著高表达（P<0.01）。免疫组织化学结果显示,胃癌组织中的DDX19A阳性表达率为68.8%（75/109）,显著高于其在癌旁胃黏膜中的表达（33.3%,10/30）,差异有统计学意义（P<0.01）。DDX19A高表达与胃癌分化程度、浸润深度、TNM分期密切相关（P<0.05）,而与患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移无关（P>0.05）。69例随访资料完整的病例中,DDX19A高表达患者的OS明显短于低表达患者（P<0.05）。结论：DDX19A在胃癌组织中明显高表达,并且其高表达与胃癌临床分期、侵袭性及患者不良预后相关。DDX19A有望成为与胃癌预后相关的潜在生物标志物及治疗的新靶点。     

Frequent CYP1A1 expression in gastric cancers and their related lesions

CYP1A1 expression in various tissues of 43 gastric cancer cases was analyzed with frozen tissue array-based immunohistochemical staining (IHC), RT-PCR, Western blot analysis and EROD (7-ethoxyresourfin-O-deethylase) assay. CYP1A1 was detected immunohistochemically in 86% (37/43) of gastric cancers, in both 57% (4/7) of atrophic gastritis and intestinal metaplasia and in 7.7% (1/13) of non-cancerous mucosa. RT-PCR and Western blot analysis revealed coincident results with that of IHC and ruled out possible concurrent CYP1A2 expression. EROD assay showed increased CYP1A1/1B1 activity in either cancer or premalignant tissues but not in non-cancerous ones. The frequencies of CYP1A1 expression are significantly different between non-cancerous and premalignant (P<0.025) or cancer groups (P<0.005), suggesting that CYP1A1 is expressed at relatively early stage of gastrocarcinogenesis and exerts its effects throughout the stepwise oncogenic processes.     

乙酰肝素酶基因表达与胃癌临床病理特点的关系

目的探讨乙酰肝素酶基因(HPAmRNA)在胃癌中的表达及其与临床病理因素之间的相互关系。方法选用43例胃癌组织和10例癌旁正常胃组织,用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测标本中HPAmRNA的表达,并结合患者临床病理指标进行分析。结果43例胃癌中,29例HPAmRNA表达阳性,其阳性率显著高于癌旁正常胃组织(P=0.013)。HPAmRNA的表达与TNM分期、有无浆膜浸润、淋巴结转移、远处转移以及与肿瘤大小有相关性(P<0.05);与患者年龄、性别、肿瘤所在部位、肿瘤的Borrmann分型、组织学类型、分化程度、腹膜转移和肝转移无相关性(P>0.05)。结论HPAmRNA阳性表达的胃癌有较高的侵袭转移性,HPA可能是胃癌侵袭转移中的一个重要酶,可能与胃癌的淋巴结转移有关。     

STMN1及UBE2C在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的:通过检测STMN1及UBE2C基因在胃癌组织中的表达,探索其表达与临床病理因素间的关联及两基因表达间的关联。方法:采用免疫组化的方法检测180例胃癌病理标本及对应180例正常胃部黏膜标本中STMN1及UBE2C基因的表达情况。结果:STMN1在胃癌组织中的阳性表达率为85.6%,而在正常组织中阳性表达率为26.1%(P＜0.05),STMN1的表达与患者性别、年龄及肿瘤分化程度无明显相关性,而与TNM分期、淋巴结转移及Lauren分型明显相关（P＜0.05)。UBE2C在胃癌组织中的阳性表达率为73.3%,而在正常组织中阳性表达仅为24.4%(P＜0.05),UBE2C的表达与患者性别、年龄及肿瘤分化程度均无显著相关,而与淋巴结转移、TNM分期及Lauren分型关联性显著(P＜0.05)。Logistic多因素分析表明,淋巴结转移、Lauren分型、TNM分期与STMN1及UBE2C表达相关(P＜0.05)。STMN1与UBE2C基因表达呈正相关(r=0.288,P＜0.05)。结论:STMN1的表达与胃癌的产生、进展、浸润及转移密切相关,UBE2C可能通过PI3K/Akt信号通道调节STMN1。